酶工程（一）課件

酶工程（一）酶工程（一）1酶工程概述酶的命名和分類酶的化學(xué)本質(zhì)、來(lái)源和生產(chǎn)酶催化反應(yīng)機(jī)理及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶的固定化和固定化酶反應(yīng)器酶工程的應(yīng)用酶工程的研究進(jìn)展酶工程概述2一酶和酶工程的概述（一）、酶的概念（二）、對(duì)酶的認(rèn)識(shí)和研究歷程（三）、酶工程的概念一酶和酶工程的概述（一）、酶的概念3（一）、酶的概念酶是生物催化劑，主要是蛋白質(zhì)，也有核酸，能在比較溫和的條件下高效率的起催化作用，使生物體內(nèi)的各種物質(zhì)處于不斷的新陳代謝中。生物體內(nèi)→新陳代謝→各種化學(xué)反應(yīng)→條件溫和（37℃，近中性），速度快，有條不紊。（一）、酶的概念酶是生物催化劑，主要是蛋白質(zhì)，4（二）、對(duì)酶的認(rèn)識(shí)和研究歷程人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)起源于生產(chǎn)實(shí)踐，人類幾千年前，都開(kāi)始制作發(fā)酵及食品。1833年，PagonPersoz從麥芽中得到一種能水解淀粉的物質(zhì)——淀粉酶。1878年，Kühne將這類生物催化劑統(tǒng)稱為“酶”（Enzyme）1887年，Buechner兄弟發(fā)現(xiàn)不含酵母細(xì)胞的酵母提取液也能使糖生成酒精，證實(shí)了發(fā)酵與細(xì)胞活力無(wú)關(guān)，并表明了酶能以溶解的、有活性的狀態(tài)從破碎的細(xì)胞中分離出來(lái)。1926年，Sumner從刀豆中提取脲酶，得到結(jié)晶，證明是蛋白質(zhì)。后來(lái)，先后獲得胃蛋白酶，胰蛋白酶的結(jié)晶1969年人工合成牛胰核糖核酸酶。1983年，發(fā)現(xiàn)核酸的催化功能——1989獲諾貝爾獎(jiǎng)（二）、對(duì)酶的認(rèn)識(shí)和研究歷程人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)起源于生產(chǎn)實(shí)踐，5（三）、酶工程的概念酶工程：工業(yè)上有目的地設(shè)計(jì)一定的反應(yīng)器和反應(yīng)條件，利用酶的催化功能，在常溫常壓下催化化學(xué)反應(yīng)，生產(chǎn)人類需要的產(chǎn)品或服務(wù)于其它目的的一門(mén)應(yīng)用技術(shù)。廣義地講還包括酶的生產(chǎn)、分離和純化。國(guó)際酶工程學(xué)會(huì)（1971年）定義：是研究和開(kāi)發(fā)酶的生產(chǎn)、酶的分離純化、酶的固定化、酶及固定化酶的反應(yīng)器、酶與固定化酶的應(yīng)用等的工程科學(xué)。（三）、酶工程的概念酶工程：工業(yè)上有目的地設(shè)計(jì)一定的反應(yīng)6按現(xiàn)代觀點(diǎn)，酶工程主要包括以下內(nèi)容酶的大量生產(chǎn)和分離純化及它們?cè)诩?xì)胞外的應(yīng)用新穎酶的發(fā)現(xiàn)、研究和應(yīng)用酶的固定化技術(shù)和固定化酶反應(yīng)器基因工程技術(shù)應(yīng)用于酶制劑的生產(chǎn)與遺傳修飾酶的研究酶分子改造與化學(xué)修飾以及酶結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的研究有機(jī)介質(zhì)中酶的反應(yīng)酶的抑制劑、激活劑的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用研究抗體酶、核酸酶的研究模擬酶、合成酶以及酶分子的人工設(shè)計(jì)、合成的研究按現(xiàn)代觀點(diǎn)，酶工程主要包括以下內(nèi)容7二酶的命名和分類（一）、習(xí)慣命名法（二）、國(guó)際系統(tǒng)分類法（三）、國(guó)際系統(tǒng)命名法（四）、同工酶（五）、酶的活力和活力單位二酶的命名和分類（一）、習(xí)慣命名法8（一）、習(xí)慣命名慣用名常依據(jù)酶所作用的底物和反應(yīng)類型命名。原則：（1）根據(jù)作用底物：如淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶等。（2）根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)：如水解酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶等。（3）二者結(jié)合：如乳酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等。（4）再加上酶的來(lái)源、特性：如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、酸性磷酸酯酶、堿性磷酸酯酶等。（一）、習(xí)慣命名慣用名常依據(jù)酶所作用的底物和反應(yīng)類型命名。9（二）、國(guó)際系統(tǒng)分類法根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)分為六大類1、氧化還原酶類：催化氧化還原反應(yīng)，涉及H和電子的轉(zhuǎn)移。如脫氫酶類。2、轉(zhuǎn)移酶類：催化分子間功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。如轉(zhuǎn)氨酶類。（二）、國(guó)際系統(tǒng)分類法根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)分為六大類103．水解酶類：催化水解反應(yīng)。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶等。4．裂合酶類：催化非水解地除去底物分子中的基團(tuán)及其逆反應(yīng)的酶。如醛縮酶脫氨酶脫羧酶3．水解酶類：催化水解反應(yīng)。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶115．異構(gòu)酶類：催化同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變。6、合成酶：與ATP分解相偶聯(lián)，并由二種物質(zhì)合成一種物質(zhì)。如天冬酰胺合成酶丙酮酸羧化酶5．異構(gòu)酶類：催化同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變。12在每一大類酶中，又根據(jù)底物中被作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)分為若干亞類，然后再把屬于某一亞類、亞亞類的酶按順序排好，這樣把已知的酶分門(mén)別類地排成一個(gè)表，叫做酶表。類亞類亞亞類序號(hào)在每一大類酶中，又根據(jù)底物中被作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)分13如EC1.1.1.27為乳酸：NAD+氧化還原酶EC1.1.1.37為蘋(píng)果酸：NAD+氧化還原酶EC1.1.1.1為乙醇：NAD+氧化還原酶如EC1.1.1.27為乳酸：NAD+氧化還原酶14（三）、國(guó)際系統(tǒng)命名法要求確切表明底物的化學(xué)本質(zhì)及酶的催化性質(zhì)。原則如下：1酶的系統(tǒng)命名有兩部分構(gòu)成：底物名稱（底物1：底物2）＋反應(yīng)名稱如果底物2為水，可略去不寫(xiě)醇脫氫酶為醇：NAD+氧化還原酶L—乳酸：NAD+氧化還原酶。（三）、國(guó)際系統(tǒng)命名法要求確切表明底物的化學(xué)本質(zhì)及酶的催化性152不管酶的催化反應(yīng)是正反應(yīng)還是逆反應(yīng)，都用同一個(gè)名稱。當(dāng)只有一個(gè)方向的反應(yīng)能夠被證實(shí)，或只有一個(gè)方向的反應(yīng)有生化重要性時(shí)，自然以此方向?yàn)槊?。NAD+和NADH相互轉(zhuǎn)化的所有反應(yīng)中（DH2+NAD+D+NADH+H+）都命名為：DH2：：

NAD+氧化還原酶2不管酶的催化反應(yīng)是正反應(yīng)還是逆反應(yīng)，都用同一個(gè)名稱。當(dāng)只16同工酶，指能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成卻有所不同的一組酶。它是研究細(xì)胞分化及形態(tài)遺傳的分子學(xué)基礎(chǔ)中的重要研究?jī)?nèi)容。如超氧化物歧化酶（SOD）可以分為三大類，如CuZn-SOD,Mn-SOD和Fe-SOD另外，乳酸脫氫酶（LDH）也有5種同工酶，催化同一種反應(yīng)同工酶的命名，在系統(tǒng)或習(xí)慣命名中，都是一樣的。同工酶，指能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成17（五）、酶的活力和活力單位酶的活力：指酶催化特定底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的速率。酶的活力常常是制訂酶制劑價(jià)格的最重要的參考指標(biāo)影響酶的活力因素，包括環(huán)境條件、底物性質(zhì)、酶本身因素等因素酶活力單位：指單位時(shí)間、單位質(zhì)量酶蛋白所催化的底物反應(yīng)或產(chǎn)物生成的物質(zhì)的量（或質(zhì)量）單位質(zhì)量生物催化劑（五）、酶的活力和活力單位酶的活力：指酶催化特定底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)18三、酶化學(xué)本質(zhì)、來(lái)源和生產(chǎn)（一）酶的化學(xué)本質(zhì)（二）酶的來(lái)源和生產(chǎn)三、酶化學(xué)本質(zhì)、來(lái)源和生產(chǎn)（一）酶的化學(xué)本質(zhì)19（一）酶的化學(xué)本質(zhì)除了核酸酶之外，酶都是具有催化功能的蛋白質(zhì)。1蛋白質(zhì)的性質(zhì)（一）酶的化學(xué)本質(zhì)除了核酸酶之外，酶都是具有催化功能的蛋白質(zhì)202、酶的化學(xué)組成1按組成成分（1）單純酶：其活性僅僅取決于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及核糖核酸酶。（2）結(jié)合酶：只有結(jié)合非蛋白組分后（輔助因子）后才表現(xiàn)出活性全酶=酶蛋白＋輔助因子2、按酶分子大小（1）單體酶：一般有有1條多肽鏈組成，幾乎都是水解E，Mr=13000～35000，不含四級(jí)結(jié)構(gòu)，如溶解酶，胰蛋白酶等（2）寡聚酶：由幾個(gè)亞基通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，Mr=35000～數(shù)百萬(wàn)，具有四級(jí)結(jié)構(gòu)，如磷酸化酶a和3-磷酸甘油醛脫氫酶（3）多酶復(fù)合體：由幾種酶嵌合而成的復(fù)合體，靠共價(jià)鍵連接Mr﹥幾百萬(wàn)。（4）核酶少數(shù)RNA具有自我拼接加工的催化活性。2、酶的化學(xué)組成1按組成成分21（二）酶的來(lái)源和生產(chǎn)1酶的來(lái)源1）直接從動(dòng)植物獲得，即從生物體中分離和提純不足：生產(chǎn)周期長(zhǎng)，來(lái)源有限，還要受一些自然條件的限制。2）化學(xué)合成方法不足：一般只適用于短肽的生產(chǎn)（二）酶的來(lái)源和生產(chǎn)1酶的來(lái)源223）工業(yè)微生物發(fā)酵，即通過(guò)液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵，是工業(yè)上酶的主要來(lái)源。其優(yōu)點(diǎn)如下：微生物種類繁多，制備出的酶種類齊全微生物繁殖快，生產(chǎn)周期長(zhǎng)微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力，可以通過(guò)適應(yīng)、誘導(dǎo)、誘變以及基因工程等方法培育出新的高產(chǎn)酶的菌株。3）工業(yè)微生物發(fā)酵，即通過(guò)液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵，是工業(yè)上23微生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶分類結(jié)構(gòu)酶：在細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中出于其自身需要而表達(dá)，誘導(dǎo)酶：加入相應(yīng)的誘導(dǎo)劑后才會(huì)表達(dá)，誘導(dǎo)劑一般是該酶所催化反應(yīng)的底物或產(chǎn)物。一般而言，野生型微生物需要經(jīng)過(guò)遺傳改造后，才能變?yōu)楦弋a(chǎn)酶的菌株。其方法包括物理誘變育種化學(xué)誘變育種基因工程構(gòu)建微生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶分類24優(yōu)良菌種的條件繁殖快、產(chǎn)酶量高、酶的性質(zhì)符合使用要求，而且最好能產(chǎn)生分泌到胞外的酶，產(chǎn)生的酶容易分離純化菌種不易變異退化，產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易受噬菌體的感染侵襲易于培養(yǎng)，能夠利用廉價(jià)的原料進(jìn)行酶的生產(chǎn)，并且發(fā)酵周期短。菌種不是致病菌，在系統(tǒng)發(fā)育上與病原體無(wú)關(guān)，不產(chǎn)生有毒物質(zhì)和其他生理活性物質(zhì)不產(chǎn)或盡量少產(chǎn)蛋白酶優(yōu)良菌種的條件25一些常用微生物及它們所產(chǎn)生的酶一些常用微生物及它們所產(chǎn)生的酶262.酶的生產(chǎn)影響酶生產(chǎn)的主要因素1）培養(yǎng)基設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)好供微生物生長(zhǎng)、繁殖、代謝和合成代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和原料。其中誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)，需要加入誘導(dǎo)劑2）發(fā)酵方式的選擇：固體發(fā)酵：又稱為表面培養(yǎng)或曲式培養(yǎng)，以麩皮、米糠等為基本原料，加入適量的無(wú)機(jī)鹽和水作為培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶微生物菌種培養(yǎng)的一種培養(yǎng)技術(shù)。特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、便于推廣，特別適合于霉菌，缺點(diǎn):發(fā)酵條件不易控制，物料利用不完全，勞動(dòng)強(qiáng)度大，容易染菌等。液體深層發(fā)酵：又稱浸沒(méi)式培養(yǎng)，利用液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行的一種攪拌式通氣培養(yǎng)方式，發(fā)酵過(guò)程需要一定的設(shè)備和技術(shù)條件，動(dòng)力消耗也較大，但是原料的利用率和酶的產(chǎn)量都較高。目前，工業(yè)上主要采用液體深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)酶，但是在酒曲培養(yǎng)、食品工業(yè)及一些用于飼料添加劑的酶生產(chǎn)中，仍在應(yīng)用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)。2.酶的生產(chǎn)影響酶生產(chǎn)的主要因素273）發(fā)酵條件控制營(yíng)養(yǎng)條件環(huán)境條件，注意溶氧濃度、溫度、pH值特別注意剪氣力對(duì)蛋白質(zhì)的影響，因?yàn)樵诟呒羟辛ο拢鞍踪|(zhì)容易失活。注意發(fā)酵的泡沫，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是表面活性劑，大量的蛋白質(zhì)積累在發(fā)酵液中使得在鼓泡條件下很容易形成泡沫，影響發(fā)酵正常操作。因此應(yīng)該考慮除泡裝置，并添加消泡劑。3）發(fā)酵條件控制283.酶的分離和提純1）酶的用途及對(duì)酶純度的要求：科學(xué)研究——需要最高的純度，必要時(shí)需要結(jié)晶醫(yī)用——需要很高的純度，避免不良反應(yīng)食品工業(yè)——在安全性的基礎(chǔ)上，純度可低一些工業(yè)用——在達(dá)到一定酶活性的基礎(chǔ)上，對(duì)純度要求不高3.酶的分離和提純1）酶的用途及對(duì)酶純度的要求：292）酶的分離提純?cè)诿干a(chǎn)中投入成本很大蛋白酶的濃度很低，而分離提純的費(fèi)用往往隨著產(chǎn)物初始濃度的下降呈指數(shù)式上升。細(xì)胞破碎液或發(fā)酵液存在大量與目標(biāo)酶蛋白性質(zhì)類似、分子量接近。酶對(duì)環(huán)境條件敏感，環(huán)境中的蛋白酶容易作用于目標(biāo)酶，使其失活。2）酶的分離提純?cè)诿干a(chǎn)中投入成本很大303）在實(shí)現(xiàn)目的的情況，可直接用整個(gè)細(xì)胞作為生物催化劑細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)酶的活性很高，可以滿足工業(yè)過(guò)程對(duì)酶活的要求胞內(nèi)酶的催化作用必須依賴于輔酶，可以利用細(xì)胞內(nèi)的輔酶再生系統(tǒng)所需要的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程需要細(xì)胞內(nèi)幾種酶的共同參與3）在實(shí)現(xiàn)目的的情況，可直接用整個(gè)細(xì)胞作為生物催化劑314）酶的分離提純的步驟在此過(guò)程中，保持酶的活性是最為關(guān)鍵的。因此，全部操作必須在低溫下進(jìn)行，一般在0～5℃間，還要防止重金屬失活、防止－SH被氧化，不能過(guò)度攪拌等4）酶的分離提純的步驟32細(xì)胞破碎的方法：動(dòng)物細(xì)胞比較容易破碎，通過(guò)一般的研磨器、勻漿器、搗碎機(jī)等可達(dá)到目的細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，破碎需要用超聲波、細(xì)菌磨、溶菌酶、某些化學(xué)溶劑（如甲苯、去氧膽酸納）或凍融等處理破碎后的分離方法：過(guò)濾、沉降等細(xì)胞破碎的方法：33酶的分離純化鹽析法：eg（NH4）SO4、Nacl，Na2SO4、使E↓析出之后需超鹽處有機(jī)溶劑沉淀法：用30～60%的乙醇、丙酮、異丙醇等，保持低溫-10～-15℃等電沉淀法：調(diào)節(jié)到PI使之絮聚、沉降。層析法：親和層析，離子交換層析，凝膠過(guò)濾曾析，吸附層析等酶的保存：低溫、干燥、避光、避氧。酶的分離純化34四、酶催化反應(yīng)機(jī)理及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（一）酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)（二）酶催化反應(yīng)的機(jī)理（三）酶催化反應(yīng)的速率理論（四）酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)四、酶催化反應(yīng)機(jī)理及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（一）酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)35（一）酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)反應(yīng)條件溫和：常溫、常壓、接近中性的pH值催化效率高。以分子比表示，酶催化比非催化的反應(yīng)速度高108－1020倍，比其他催化反應(yīng)高107－1013。

舉例1：H2O2→H2O＋O2（ⅰ）Fe2+催化10-5mol/s（ⅱ）H2O2E催化105mol/sE的催化能力高1010倍

舉例2：已知催化反應(yīng)最快的是碳酸酐酶。CO2＋H2O→H2CO3每個(gè)E分子每秒可催化6×105個(gè)CO2分子與水堿H2CO3比非酶催化快107倍。（一）酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)36酶的作用專一性。通常把酶作用的物質(zhì)稱為該酶的底物（substrate)。一種酶只作用于一種或一類底物。反應(yīng)專一性（鍵專一性）：這些酶的專一性較低，能夠催化具有相同化學(xué)鍵或基團(tuán)的底物進(jìn)行某種類型的反應(yīng)。如酯酶底物專一性：只能催化特定底物發(fā)生特定的反應(yīng)。如脲酶只能催化尿素，而且只能是水解反應(yīng)立體化學(xué)專一性：表現(xiàn)為對(duì)底物的構(gòu)象有特殊的要求。如L－乳酸脫氫酶只能催化L-乳酸的氧化，而對(duì)D-乳酸則不起作用。酶的作用專一性。通常把酶作用的物質(zhì)稱為該酶的底物（subst37酶的催化活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)。輔助因子分為輔酶和輔基輔酶：與酶蛋白松弛結(jié)合，可以通過(guò)透析或其他方法將其從全酶中除去，如NADH，ATP及各種維生素輔基：以共價(jià)鍵和酶蛋白質(zhì)結(jié)合，不易透析除去，如Ca2+、Co2+、Zn2+、Mg2+等金屬離子酶的催化活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)。38酶易失活。凡使蛋白質(zhì)變性的因素都能使酶破壞而完全失去活性酶活力的調(diào)節(jié)控制。在各種水平上進(jìn)行，酶水平的調(diào)控方式包括：抑制調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素調(diào)控等。酶易失活。凡使蛋白質(zhì)變性的因素都能使酶破壞而完全失去活性39（二）酶的催化反應(yīng)機(jī)理1酶的活性中心指酶分子中直接和底物結(jié)合，并和酶的催化作用直接有關(guān)的部位。（1）結(jié)合基團(tuán)：與S結(jié)合的基團(tuán)。（2）催化基團(tuán)：直接參與催化反應(yīng)的基團(tuán)。酶的活性部位，不僅決定酶的專一性，同時(shí)對(duì)E的催化性質(zhì)起決定作用?；钚圆课坏幕鶊F(tuán)都是必需基團(tuán)，必需基團(tuán)還包括活性部位以外的，對(duì)維持空間構(gòu)象必需的基團(tuán)。（二）酶的催化反應(yīng)機(jī)理1酶的活性中心40第八章-酶工程（一）課件412關(guān)于酶催化的專一性作用機(jī)制假說(shuō)（1）鎖－鑰匙學(xué)說(shuō)：1890年Fisher提出。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為酶的天然構(gòu)象是剛性的，如果底物分子結(jié)構(gòu)上存在著微小的差別，就不能契入酶分子中，從而不能被酶催化。2關(guān)于酶催化的專一性作用機(jī)制假說(shuō)42（2）誘導(dǎo)－契合假說(shuō):Koshland提出當(dāng)酶分子與底物接近時(shí)，酶蛋白受底物分子的誘導(dǎo)，其構(gòu)象發(fā)生了有利于底物結(jié)合的變化，酶與底物在此基礎(chǔ)上互補(bǔ)楔合，進(jìn)行反應(yīng)。（2）誘導(dǎo)－契合假說(shuō):Koshland提出43第八章-酶工程（一）課件443.中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)：底物先與酶結(jié)合成不穩(wěn)定的中間絡(luò)合物，然后再分解釋放出酶與底物證實(shí)：H2O2+過(guò)氧化物酶（H2O2—過(guò)氧化物酶）

（褐色）

（紅色）

645\587\548\498nm

561\550nm（H2O2—過(guò)氧化物酶）+AH2過(guò)氧化物酶+A+2H2O（紅色）（褐色）

3.中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)：底物先與酶結(jié)合成不穩(wěn)定的中間絡(luò)合物，然后45（三）酶催化反應(yīng)的速率理論1概念：在反應(yīng)體系中，任何反應(yīng)分子都有進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的可能，但只有能量達(dá)到或超過(guò)某一限度（能閾）的活化分子，才能在碰撞中起化學(xué)反應(yīng)。能閾——活化能：活化分子處于活化態(tài)，活化態(tài)與常態(tài)的能量差，也就是分子由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)所需的能量稱為活化能。達(dá)到或超過(guò)能閾的分子——活化分子活化分子越多——反應(yīng)速度越快。提高活化分子數(shù)量的途徑①對(duì)反應(yīng)體系加熱，照射②降低活化能（三）酶催化反應(yīng)的速率理論1概念：462.酶高效催化的理論酶催化能夠降低活化能，是非酶催化1/3以下。2.酶高效催化的理論47（1）鄰近和定向效應(yīng)鄰近效應(yīng)：指酶、底物結(jié)合形成絡(luò)合物時(shí)，底物分子與底物分子之間、酶的催化集團(tuán)與底物分子之間，絡(luò)合形成“大分子”，局部反應(yīng)基團(tuán)的有效濃度得到了極大的提高，從而使反應(yīng)速率大大增加定向效應(yīng)：指反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán)之間、酶的催化基團(tuán)之間與底物的反應(yīng)基團(tuán)之間的正確取向，使反應(yīng)速率增大。（1）鄰近和定向效應(yīng)48（2）酸堿催化：指通過(guò)瞬時(shí)地向反應(yīng)物提供質(zhì)子或從反應(yīng)物中汲取質(zhì)子，以穩(wěn)定過(guò)度態(tài)、加速反應(yīng)的一類催化反應(yīng)機(jī)制。（2）酸堿催化：指通過(guò)瞬時(shí)地向反應(yīng)物提供質(zhì)子或從反應(yīng)物中汲取49（3）張變和扭曲效應(yīng)：E與S誘導(dǎo)契合過(guò)程中，E受S誘導(dǎo)而變構(gòu)，同時(shí)變化的E分子使S分子中的敏感鍵產(chǎn)生“張力”或“變形”，使敏感鍵易于斷裂。（3）張變和扭曲效應(yīng)：50（4）共價(jià)催化：E與S形成一個(gè)反應(yīng)活性很高的不穩(wěn)定的共價(jià)中間產(chǎn)物，加快反應(yīng)。共價(jià)催化的最一般形式是催化劑的親核基團(tuán)對(duì)底物中親電子的碳原子進(jìn)行攻擊，形成共價(jià)中間物。第八章-酶工程（一）課件51（5）多元催化與協(xié)同效應(yīng)酶的催化作用是一個(gè)綜合的結(jié)果，是要通過(guò)側(cè)鏈基團(tuán)協(xié)同作用來(lái)完成的。（5）多元催化與協(xié)同效應(yīng)52（四）酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)1概念熱力學(xué)：研究一個(gè)反應(yīng)能否進(jìn)行，進(jìn)行的程度（反應(yīng)物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的多少），只考慮始態(tài)、終態(tài)，不考慮歷程（如何反應(yīng)）?；瘜W(xué)動(dòng)力學(xué)：研究（1）反應(yīng)速度（2）反應(yīng)條件對(duì)速度的影響（3）反應(yīng)步驟（4）反應(yīng)機(jī)理（以便估價(jià)、控制、應(yīng)用）。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：研究酶促反應(yīng)的速度和影響此速度的各種因素以及反應(yīng)歷程。（四）酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)1概念532底物濃度[S]對(duì)酶促反應(yīng)速度V與底物濃度[S]的關(guān)系Michaelis&Menten提出的著名的米氏方程根據(jù)如下現(xiàn)象的觀測(cè)當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)候，反應(yīng)速率與底物濃度成正比，即符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，反應(yīng)速率與底物濃度無(wú)關(guān)，即符合零級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)當(dāng)酶的濃度大大小于底物濃度時(shí)，反應(yīng)速率與酶的加入量成正比2底物濃度[S]對(duì)酶促反應(yīng)速度V與底物濃度[S]的關(guān)系Mi54根據(jù)中間絡(luò)合物假說(shuō)，Michaelis&Menten提出單底物酶催化的反應(yīng)機(jī)理如下：式中，E代表游離酶，ES為酶與底物的復(fù)合物；S為底物；P為產(chǎn)物；k+1,K-1,k+2為相應(yīng)各步反應(yīng)的反應(yīng)速率常數(shù)。根據(jù)中間絡(luò)合物假說(shuō)，Michaelis&Menten提出單55Michaelis&Menten進(jìn)一步假設(shè)：與底物濃度[S]相比，酶的濃度[E]很小，因而可忽略由于生成中間復(fù)合物ES而消耗的底物考慮反應(yīng)的初始狀態(tài)，此時(shí)產(chǎn)物P的濃度為零，可忽略反應(yīng)的逆反應(yīng)的存在假設(shè)基元反應(yīng)ESE+P的反應(yīng)速率最慢，為上述步驟的控制步驟，而S+EES的反應(yīng)速率很快，可快速達(dá)到平衡狀態(tài)。在此基礎(chǔ)二人提出了“米氏方程”：Michaelis&Menten進(jìn)一步假設(shè)：563溫度對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響在Topt之前，T↑、V↑△T=10℃，反應(yīng)速度增加1～2倍在Topr之后，T↑、V↓注意：（1）動(dòng)物體內(nèi)最適T一般30-50℃，植物40-60℃，有少數(shù)酶能耐較高的溫度，如某些細(xì)菌中分離的DNA聚合酶，最適溫度可達(dá)70℃，細(xì)菌淀粉酶在93℃下活力最大。（2）最適T，不是酶的特征常數(shù)，它與酶作用時(shí)間的長(zhǎng)短、底物種類以及PH有關(guān)。3溫度對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響在Topt之前，T↑、V↑△T574pH對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響每一種酶只能在一定pH下才能表現(xiàn)酶反應(yīng)的最大速度，高于或低于此值，反應(yīng)速度都會(huì)下降，通常稱此PH值為酶反應(yīng)的最適PH值。（1）一般酶最適PH4－8，植物5－6.5動(dòng)物6.5－8（3）最適PH與等電點(diǎn)不一定例如：胰pr.E：Phopt=7.7～8.1蔗糖E：pr.E：Phopt=3.0～7.5胃pr.E：Phopt=1.5～2.2酶有最適PH的原因（1）pH影響E結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，過(guò)酸、過(guò)堿會(huì)強(qiáng)烈影響酶蛋白的構(gòu)象，甚至使E變性失活。（2）PH影響E分子上某些基團(tuán)的解離狀態(tài)（3）PH影響S分子某些基團(tuán)的解離狀態(tài)。4pH對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響每一種酶只能在一定pH下才能584激活劑對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響定義：凡能提高酶活的物質(zhì)均為激活劑種類：（1）無(wú)機(jī)離子：金屬離子：K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Mo2+。陰離子：Cl—、Br—（2）有機(jī)小分子：Vc、Cys、GSH可使含E—SH處于還原態(tài)。4激活劑對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響定義：凡能提高酶活的物質(zhì)均為595.抑制劑對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響1）抑制的作用失活作用：凡使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用。抑制作用：使酶活力下降，但并不引起酶蛋白變性的作用。（此作用使一部分酶的必需基團(tuán)或輔助因子失活（活力變?。?）抑制類型不可逆抑制：I與E共價(jià)結(jié)合，是一不可逆反應(yīng)，二者結(jié)合后，不能透析除去抑制劑而恢復(fù)酶活力，稱為不可逆抑制作用?？赡嬉种疲篒與E非共價(jià)結(jié)合，為可逆反應(yīng)，透析能除去抑制劑使酶恢復(fù)活力，稱為可逆抑制作用。5.抑制劑對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響1）抑制的作用60第八章-酶工程（一）課件61蛋白質(zhì)1蛋白質(zhì)的化學(xué)組成C--------50%H--------7%O--------23%N--------16%S--------0～3％other---微量2分類簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)：完全由氨基酸構(gòu)成如：核糖核酸酶，胰島素結(jié)合蛋白質(zhì)：另外含有輔基或配基如：血紅蛋白核蛋白蛋白質(zhì)1蛋白質(zhì)的化學(xué)組成623蛋白質(zhì)分子量——大約6000～1000000之間——對(duì)于不含輔基的蛋白質(zhì)氨基酸殘基＝分子量/1103蛋白質(zhì)分子量634氨基酸——蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位——結(jié)構(gòu)通式，L型，α-碳原子（除脯氨酸）4氨基酸——蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位64第八章-酶工程（一）課件655蛋白質(zhì)的構(gòu)象一級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈共價(jià)主鏈的氨基酸順序二級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助氫鍵排列成沿一維方向具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象三級(jí)結(jié)構(gòu)：有規(guī)則構(gòu)象加上無(wú)規(guī)則松散肽段四級(jí)結(jié)構(gòu)：寡聚蛋白質(zhì)中各個(gè)亞基之間在空間上的相互關(guān)系或結(jié)合方式5蛋白質(zhì)的構(gòu)象66第八章-酶工程（一）課件676蛋白質(zhì)的性質(zhì)兩性解離等電點(diǎn)變性：蛋白質(zhì)受到外界各種因素的影響，使其二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，天然蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)就會(huì)改變，并失去原來(lái)的生理功能與活性。蛋白質(zhì)變性后，其溶解度降低，黏度增大；在生理上，原有功能喪失。6蛋白質(zhì)的性質(zhì)68輔助因子輔助因子69第八章-酶工程（一）課件70酶工程（一）酶工程（一）71酶工程概述酶的命名和分類酶的化學(xué)本質(zhì)、來(lái)源和生產(chǎn)酶催化反應(yīng)機(jī)理及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶的固定化和固定化酶反應(yīng)器酶工程的應(yīng)用酶工程的研究進(jìn)展酶工程概述72一酶和酶工程的概述（一）、酶的概念（二）、對(duì)酶的認(rèn)識(shí)和研究歷程（三）、酶工程的概念一酶和酶工程的概述（一）、酶的概念73（一）、酶的概念酶是生物催化劑，主要是蛋白質(zhì)，也有核酸，能在比較溫和的條件下高效率的起催化作用，使生物體內(nèi)的各種物質(zhì)處于不斷的新陳代謝中。生物體內(nèi)→新陳代謝→各種化學(xué)反應(yīng)→條件溫和（37℃，近中性），速度快，有條不紊。（一）、酶的概念酶是生物催化劑，主要是蛋白質(zhì)，74（二）、對(duì)酶的認(rèn)識(shí)和研究歷程人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)起源于生產(chǎn)實(shí)踐，人類幾千年前，都開(kāi)始制作發(fā)酵及食品。1833年，PagonPersoz從麥芽中得到一種能水解淀粉的物質(zhì)——淀粉酶。1878年，Kühne將這類生物催化劑統(tǒng)稱為“酶”（Enzyme）1887年，Buechner兄弟發(fā)現(xiàn)不含酵母細(xì)胞的酵母提取液也能使糖生成酒精，證實(shí)了發(fā)酵與細(xì)胞活力無(wú)關(guān)，并表明了酶能以溶解的、有活性的狀態(tài)從破碎的細(xì)胞中分離出來(lái)。1926年，Sumner從刀豆中提取脲酶，得到結(jié)晶，證明是蛋白質(zhì)。后來(lái)，先后獲得胃蛋白酶，胰蛋白酶的結(jié)晶1969年人工合成牛胰核糖核酸酶。1983年，發(fā)現(xiàn)核酸的催化功能——1989獲諾貝爾獎(jiǎng)（二）、對(duì)酶的認(rèn)識(shí)和研究歷程人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)起源于生產(chǎn)實(shí)踐，75（三）、酶工程的概念酶工程：工業(yè)上有目的地設(shè)計(jì)一定的反應(yīng)器和反應(yīng)條件，利用酶的催化功能，在常溫常壓下催化化學(xué)反應(yīng)，生產(chǎn)人類需要的產(chǎn)品或服務(wù)于其它目的的一門(mén)應(yīng)用技術(shù)。廣義地講還包括酶的生產(chǎn)、分離和純化。國(guó)際酶工程學(xué)會(huì)（1971年）定義：是研究和開(kāi)發(fā)酶的生產(chǎn)、酶的分離純化、酶的固定化、酶及固定化酶的反應(yīng)器、酶與固定化酶的應(yīng)用等的工程科學(xué)。（三）、酶工程的概念酶工程：工業(yè)上有目的地設(shè)計(jì)一定的反應(yīng)76按現(xiàn)代觀點(diǎn)，酶工程主要包括以下內(nèi)容酶的大量生產(chǎn)和分離純化及它們?cè)诩?xì)胞外的應(yīng)用新穎酶的發(fā)現(xiàn)、研究和應(yīng)用酶的固定化技術(shù)和固定化酶反應(yīng)器基因工程技術(shù)應(yīng)用于酶制劑的生產(chǎn)與遺傳修飾酶的研究酶分子改造與化學(xué)修飾以及酶結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的研究有機(jī)介質(zhì)中酶的反應(yīng)酶的抑制劑、激活劑的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用研究抗體酶、核酸酶的研究模擬酶、合成酶以及酶分子的人工設(shè)計(jì)、合成的研究按現(xiàn)代觀點(diǎn)，酶工程主要包括以下內(nèi)容77二酶的命名和分類（一）、習(xí)慣命名法（二）、國(guó)際系統(tǒng)分類法（三）、國(guó)際系統(tǒng)命名法（四）、同工酶（五）、酶的活力和活力單位二酶的命名和分類（一）、習(xí)慣命名法78（一）、習(xí)慣命名慣用名常依據(jù)酶所作用的底物和反應(yīng)類型命名。原則：（1）根據(jù)作用底物：如淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶等。（2）根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)：如水解酶、脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶等。（3）二者結(jié)合：如乳酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等。（4）再加上酶的來(lái)源、特性：如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、酸性磷酸酯酶、堿性磷酸酯酶等。（一）、習(xí)慣命名慣用名常依據(jù)酶所作用的底物和反應(yīng)類型命名。79（二）、國(guó)際系統(tǒng)分類法根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)分為六大類1、氧化還原酶類：催化氧化還原反應(yīng)，涉及H和電子的轉(zhuǎn)移。如脫氫酶類。2、轉(zhuǎn)移酶類：催化分子間功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。如轉(zhuǎn)氨酶類。（二）、國(guó)際系統(tǒng)分類法根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)分為六大類803．水解酶類：催化水解反應(yīng)。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶等。4．裂合酶類：催化非水解地除去底物分子中的基團(tuán)及其逆反應(yīng)的酶。如醛縮酶脫氨酶脫羧酶3．水解酶類：催化水解反應(yīng)。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶815．異構(gòu)酶類：催化同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變。6、合成酶：與ATP分解相偶聯(lián)，并由二種物質(zhì)合成一種物質(zhì)。如天冬酰胺合成酶丙酮酸羧化酶5．異構(gòu)酶類：催化同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變。82在每一大類酶中，又根據(jù)底物中被作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)分為若干亞類，然后再把屬于某一亞類、亞亞類的酶按順序排好，這樣把已知的酶分門(mén)別類地排成一個(gè)表，叫做酶表。類亞類亞亞類序號(hào)在每一大類酶中，又根據(jù)底物中被作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)分83如EC1.1.1.27為乳酸：NAD+氧化還原酶EC1.1.1.37為蘋(píng)果酸：NAD+氧化還原酶EC1.1.1.1為乙醇：NAD+氧化還原酶如EC1.1.1.27為乳酸：NAD+氧化還原酶84（三）、國(guó)際系統(tǒng)命名法要求確切表明底物的化學(xué)本質(zhì)及酶的催化性質(zhì)。原則如下：1酶的系統(tǒng)命名有兩部分構(gòu)成：底物名稱（底物1：底物2）＋反應(yīng)名稱如果底物2為水，可略去不寫(xiě)醇脫氫酶為醇：NAD+氧化還原酶L—乳酸：NAD+氧化還原酶。（三）、國(guó)際系統(tǒng)命名法要求確切表明底物的化學(xué)本質(zhì)及酶的催化性852不管酶的催化反應(yīng)是正反應(yīng)還是逆反應(yīng)，都用同一個(gè)名稱。當(dāng)只有一個(gè)方向的反應(yīng)能夠被證實(shí)，或只有一個(gè)方向的反應(yīng)有生化重要性時(shí)，自然以此方向?yàn)槊AD+和NADH相互轉(zhuǎn)化的所有反應(yīng)中（DH2+NAD+D+NADH+H+）都命名為：DH2：：

NAD+氧化還原酶2不管酶的催化反應(yīng)是正反應(yīng)還是逆反應(yīng)，都用同一個(gè)名稱。當(dāng)只86同工酶，指能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成卻有所不同的一組酶。它是研究細(xì)胞分化及形態(tài)遺傳的分子學(xué)基礎(chǔ)中的重要研究?jī)?nèi)容。如超氧化物歧化酶（SOD）可以分為三大類，如CuZn-SOD,Mn-SOD和Fe-SOD另外，乳酸脫氫酶（LDH）也有5種同工酶，催化同一種反應(yīng)同工酶的命名，在系統(tǒng)或習(xí)慣命名中，都是一樣的。同工酶，指能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成87（五）、酶的活力和活力單位酶的活力：指酶催化特定底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的速率。酶的活力常常是制訂酶制劑價(jià)格的最重要的參考指標(biāo)影響酶的活力因素，包括環(huán)境條件、底物性質(zhì)、酶本身因素等因素酶活力單位：指單位時(shí)間、單位質(zhì)量酶蛋白所催化的底物反應(yīng)或產(chǎn)物生成的物質(zhì)的量（或質(zhì)量）單位質(zhì)量生物催化劑（五）、酶的活力和活力單位酶的活力：指酶催化特定底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)88三、酶化學(xué)本質(zhì)、來(lái)源和生產(chǎn)（一）酶的化學(xué)本質(zhì)（二）酶的來(lái)源和生產(chǎn)三、酶化學(xué)本質(zhì)、來(lái)源和生產(chǎn)（一）酶的化學(xué)本質(zhì)89（一）酶的化學(xué)本質(zhì)除了核酸酶之外，酶都是具有催化功能的蛋白質(zhì)。1蛋白質(zhì)的性質(zhì)（一）酶的化學(xué)本質(zhì)除了核酸酶之外，酶都是具有催化功能的蛋白質(zhì)902、酶的化學(xué)組成1按組成成分（1）單純酶：其活性僅僅取決于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及核糖核酸酶。（2）結(jié)合酶：只有結(jié)合非蛋白組分后（輔助因子）后才表現(xiàn)出活性全酶=酶蛋白＋輔助因子2、按酶分子大?。?）單體酶：一般有有1條多肽鏈組成，幾乎都是水解E，Mr=13000～35000，不含四級(jí)結(jié)構(gòu)，如溶解酶，胰蛋白酶等（2）寡聚酶：由幾個(gè)亞基通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，Mr=35000～數(shù)百萬(wàn)，具有四級(jí)結(jié)構(gòu)，如磷酸化酶a和3-磷酸甘油醛脫氫酶（3）多酶復(fù)合體：由幾種酶嵌合而成的復(fù)合體，靠共價(jià)鍵連接Mr﹥幾百萬(wàn)。（4）核酶少數(shù)RNA具有自我拼接加工的催化活性。2、酶的化學(xué)組成1按組成成分91（二）酶的來(lái)源和生產(chǎn)1酶的來(lái)源1）直接從動(dòng)植物獲得，即從生物體中分離和提純不足：生產(chǎn)周期長(zhǎng)，來(lái)源有限，還要受一些自然條件的限制。2）化學(xué)合成方法不足：一般只適用于短肽的生產(chǎn)（二）酶的來(lái)源和生產(chǎn)1酶的來(lái)源923）工業(yè)微生物發(fā)酵，即通過(guò)液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵，是工業(yè)上酶的主要來(lái)源。其優(yōu)點(diǎn)如下：微生物種類繁多，制備出的酶種類齊全微生物繁殖快，生產(chǎn)周期長(zhǎng)微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力，可以通過(guò)適應(yīng)、誘導(dǎo)、誘變以及基因工程等方法培育出新的高產(chǎn)酶的菌株。3）工業(yè)微生物發(fā)酵，即通過(guò)液體深層發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵，是工業(yè)上93微生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶分類結(jié)構(gòu)酶：在細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中出于其自身需要而表達(dá)，誘導(dǎo)酶：加入相應(yīng)的誘導(dǎo)劑后才會(huì)表達(dá)，誘導(dǎo)劑一般是該酶所催化反應(yīng)的底物或產(chǎn)物。一般而言，野生型微生物需要經(jīng)過(guò)遺傳改造后，才能變?yōu)楦弋a(chǎn)酶的菌株。其方法包括物理誘變育種化學(xué)誘變育種基因工程構(gòu)建微生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶分類94優(yōu)良菌種的條件繁殖快、產(chǎn)酶量高、酶的性質(zhì)符合使用要求，而且最好能產(chǎn)生分泌到胞外的酶，產(chǎn)生的酶容易分離純化菌種不易變異退化，產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，不易受噬菌體的感染侵襲易于培養(yǎng)，能夠利用廉價(jià)的原料進(jìn)行酶的生產(chǎn)，并且發(fā)酵周期短。菌種不是致病菌，在系統(tǒng)發(fā)育上與病原體無(wú)關(guān)，不產(chǎn)生有毒物質(zhì)和其他生理活性物質(zhì)不產(chǎn)或盡量少產(chǎn)蛋白酶優(yōu)良菌種的條件95一些常用微生物及它們所產(chǎn)生的酶一些常用微生物及它們所產(chǎn)生的酶962.酶的生產(chǎn)影響酶生產(chǎn)的主要因素1）培養(yǎng)基設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)好供微生物生長(zhǎng)、繁殖、代謝和合成代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和原料。其中誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)，需要加入誘導(dǎo)劑2）發(fā)酵方式的選擇：固體發(fā)酵：又稱為表面培養(yǎng)或曲式培養(yǎng)，以麩皮、米糠等為基本原料，加入適量的無(wú)機(jī)鹽和水作為培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶微生物菌種培養(yǎng)的一種培養(yǎng)技術(shù)。特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、便于推廣，特別適合于霉菌，缺點(diǎn):發(fā)酵條件不易控制，物料利用不完全，勞動(dòng)強(qiáng)度大，容易染菌等。液體深層發(fā)酵：又稱浸沒(méi)式培養(yǎng)，利用液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行的一種攪拌式通氣培養(yǎng)方式，發(fā)酵過(guò)程需要一定的設(shè)備和技術(shù)條件，動(dòng)力消耗也較大，但是原料的利用率和酶的產(chǎn)量都較高。目前，工業(yè)上主要采用液體深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)酶，但是在酒曲培養(yǎng)、食品工業(yè)及一些用于飼料添加劑的酶生產(chǎn)中，仍在應(yīng)用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)。2.酶的生產(chǎn)影響酶生產(chǎn)的主要因素973）發(fā)酵條件控制營(yíng)養(yǎng)條件環(huán)境條件，注意溶氧濃度、溫度、pH值特別注意剪氣力對(duì)蛋白質(zhì)的影響，因?yàn)樵诟呒羟辛ο?，蛋白質(zhì)容易失活。注意發(fā)酵的泡沫，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是表面活性劑，大量的蛋白質(zhì)積累在發(fā)酵液中使得在鼓泡條件下很容易形成泡沫，影響發(fā)酵正常操作。因此應(yīng)該考慮除泡裝置，并添加消泡劑。3）發(fā)酵條件控制983.酶的分離和提純1）酶的用途及對(duì)酶純度的要求：科學(xué)研究——需要最高的純度，必要時(shí)需要結(jié)晶醫(yī)用——需要很高的純度，避免不良反應(yīng)食品工業(yè)——在安全性的基礎(chǔ)上，純度可低一些工業(yè)用——在達(dá)到一定酶活性的基礎(chǔ)上，對(duì)純度要求不高3.酶的分離和提純1）酶的用途及對(duì)酶純度的要求：992）酶的分離提純?cè)诿干a(chǎn)中投入成本很大蛋白酶的濃度很低，而分離提純的費(fèi)用往往隨著產(chǎn)物初始濃度的下降呈指數(shù)式上升。細(xì)胞破碎液或發(fā)酵液存在大量與目標(biāo)酶蛋白性質(zhì)類似、分子量接近。酶對(duì)環(huán)境條件敏感，環(huán)境中的蛋白酶容易作用于目標(biāo)酶，使其失活。2）酶的分離提純?cè)诿干a(chǎn)中投入成本很大1003）在實(shí)現(xiàn)目的的情況，可直接用整個(gè)細(xì)胞作為生物催化劑細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)酶的活性很高，可以滿足工業(yè)過(guò)程對(duì)酶活的要求胞內(nèi)酶的催化作用必須依賴于輔酶，可以利用細(xì)胞內(nèi)的輔酶再生系統(tǒng)所需要的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程需要細(xì)胞內(nèi)幾種酶的共同參與3）在實(shí)現(xiàn)目的的情況，可直接用整個(gè)細(xì)胞作為生物催化劑1014）酶的分離提純的步驟在此過(guò)程中，保持酶的活性是最為關(guān)鍵的。因此，全部操作必須在低溫下進(jìn)行，一般在0～5℃間，還要防止重金屬失活、防止－SH被氧化，不能過(guò)度攪拌等4）酶的分離提純的步驟102細(xì)胞破碎的方法：動(dòng)物細(xì)胞比較容易破碎，通過(guò)一般的研磨器、勻漿器、搗碎機(jī)等可達(dá)到目的細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，破碎需要用超聲波、細(xì)菌磨、溶菌酶、某些化學(xué)溶劑（如甲苯、去氧膽酸納）或凍融等處理破碎后的分離方法：過(guò)濾、沉降等細(xì)胞破碎的方法：103酶的分離純化鹽析法：eg（NH4）SO4、Nacl，Na2SO4、使E↓析出之后需超鹽處有機(jī)溶劑沉淀法：用30～60%的乙醇、丙酮、異丙醇等，保持低溫-10～-15℃等電沉淀法：調(diào)節(jié)到PI使之絮聚、沉降。層析法：親和層析，離子交換層析，凝膠過(guò)濾曾析，吸附層析等酶的保存：低溫、干燥、避光、避氧。酶的分離純化104四、酶催化反應(yīng)機(jī)理及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（一）酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)（二）酶催化反應(yīng)的機(jī)理（三）酶催化反應(yīng)的速率理論（四）酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)四、酶催化反應(yīng)機(jī)理及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（一）酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)105（一）酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)反應(yīng)條件溫和：常溫、常壓、接近中性的pH值催化效率高。以分子比表示，酶催化比非催化的反應(yīng)速度高108－1020倍，比其他催化反應(yīng)高107－1013。

舉例1：H2O2→H2O＋O2（ⅰ）Fe2+催化10-5mol/s（ⅱ）H2O2E催化105mol/sE的催化能力高1010倍

舉例2：已知催化反應(yīng)最快的是碳酸酐酶。CO2＋H2O→H2CO3每個(gè)E分子每秒可催化6×105個(gè)CO2分子與水堿H2CO3比非酶催化快107倍。（一）酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)106酶的作用專一性。通常把酶作用的物質(zhì)稱為該酶的底物（substrate)。一種酶只作用于一種或一類底物。反應(yīng)專一性（鍵專一性）：這些酶的專一性較低，能夠催化具有相同化學(xué)鍵或基團(tuán)的底物進(jìn)行某種類型的反應(yīng)。如酯酶底物專一性：只能催化特定底物發(fā)生特定的反應(yīng)。如脲酶只能催化尿素，而且只能是水解反應(yīng)立體化學(xué)專一性：表現(xiàn)為對(duì)底物的構(gòu)象有特殊的要求。如L－乳酸脫氫酶只能催化L-乳酸的氧化，而對(duì)D-乳酸則不起作用。酶的作用專一性。通常把酶作用的物質(zhì)稱為該酶的底物（subst107酶的催化活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)。輔助因子分為輔酶和輔基輔酶：與酶蛋白松弛結(jié)合，可以通過(guò)透析或其他方法將其從全酶中除去，如NADH，ATP及各種維生素輔基：以共價(jià)鍵和酶蛋白質(zhì)結(jié)合，不易透析除去，如Ca2+、Co2+、Zn2+、Mg2+等金屬離子酶的催化活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)。108酶易失活。凡使蛋白質(zhì)變性的因素都能使酶破壞而完全失去活性酶活力的調(diào)節(jié)控制。在各種水平上進(jìn)行，酶水平的調(diào)控方式包括：抑制調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素調(diào)控等。酶易失活。凡使蛋白質(zhì)變性的因素都能使酶破壞而完全失去活性109（二）酶的催化反應(yīng)機(jī)理1酶的活性中心指酶分子中直接和底物結(jié)合，并和酶的催化作用直接有關(guān)的部位。（1）結(jié)合基團(tuán)：與S結(jié)合的基團(tuán)。（2）催化基團(tuán)：直接參與催化反應(yīng)的基團(tuán)。酶的活性部位，不僅決定酶的專一性，同時(shí)對(duì)E的催化性質(zhì)起決定作用?；钚圆课坏幕鶊F(tuán)都是必需基團(tuán)，必需基團(tuán)還包括活性部位以外的，對(duì)維持空間構(gòu)象必需的基團(tuán)。（二）酶的催化反應(yīng)機(jī)理1酶的活性中心110第八章-酶工程（一）課件1112關(guān)于酶催化的專一性作用機(jī)制假說(shuō)（1）鎖－鑰匙學(xué)說(shuō)：1890年Fisher提出。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為酶的天然構(gòu)象是剛性的，如果底物分子結(jié)構(gòu)上存在著微小的差別，就不能契入酶分子中，從而不能被酶催化。2關(guān)于酶催化的專一性作用機(jī)制假說(shuō)112（2）誘導(dǎo)－契合假說(shuō):Koshland提出當(dāng)酶分子與底物接近時(shí)，酶蛋白受底物分子的誘導(dǎo)，其構(gòu)象發(fā)生了有利于底物結(jié)合的變化，酶與底物在此基礎(chǔ)上互補(bǔ)楔合，進(jìn)行反應(yīng)。（2）誘導(dǎo)－契合假說(shuō):Koshland提出113第八章-酶工程（一）課件1143.中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)：底物先與酶結(jié)合成不穩(wěn)定的中間絡(luò)合物，然后再分解釋放出酶與底物證實(shí)：H2O2+過(guò)氧化物酶（H2O2—過(guò)氧化物酶）

（褐色）

（紅色）

645\587\548\498nm

561\550nm（H2O2—過(guò)氧化物酶）+AH2過(guò)氧化物酶+A+2H2O（紅色）（褐色）

3.中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)：底物先與酶結(jié)合成不穩(wěn)定的中間絡(luò)合物，然后115（三）酶催化反應(yīng)的速率理論1概念：在反應(yīng)體系中，任何反應(yīng)分子都有進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的可能，但只有能量達(dá)到或超過(guò)某一限度（能閾）的活化分子，才能在碰撞中起化學(xué)反應(yīng)。能閾——活化能：活化分子處于活化態(tài)，活化態(tài)與常態(tài)的能量差，也就是分子由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)所需的能量稱為活化能。達(dá)到或超過(guò)能閾的分子——活化分子活化分子越多——反應(yīng)速度越快。提高活化分子數(shù)量的途徑①對(duì)反應(yīng)體系加熱，照射②降低活化能（三）酶催化反應(yīng)的速率理論1概念：1162.酶高效催化的理論酶催化能夠降低活化能，是非酶催化1/3以下。2.酶高效催化的理論117（1）鄰近和定向效應(yīng)鄰近效應(yīng)：指酶、底物結(jié)合形成絡(luò)合物時(shí)，底物分子與底物分子之間、酶的催化集團(tuán)與底物分子之間，絡(luò)合形成“大分子”，局部反應(yīng)基團(tuán)的有效濃度得到了極大的提高，從而使反應(yīng)速率大大增加定向效應(yīng)：指反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán)之間、酶的催化基團(tuán)之間與底物的反應(yīng)基團(tuán)之間的正確取向，使反應(yīng)速率增大。（1）鄰近和定向效應(yīng)118（2）酸堿催化：指通過(guò)瞬時(shí)地向反應(yīng)物提供質(zhì)子或從反應(yīng)物中汲取質(zhì)子，以穩(wěn)定過(guò)度態(tài)、加速反應(yīng)的一類催化反應(yīng)機(jī)制。（2）酸堿催化：指通過(guò)瞬時(shí)地向反應(yīng)物提供質(zhì)子或從反應(yīng)物中汲取119（3）張變和扭曲效應(yīng)：E與S誘導(dǎo)契合過(guò)程中，E受S誘導(dǎo)而變構(gòu)，同時(shí)變化的E分子使S分子中的敏感鍵產(chǎn)生“張力”或“變形”，使敏感鍵易于斷裂。（3）張變和扭曲效應(yīng)：120（4）共價(jià)催化：E與S形成一個(gè)反應(yīng)活性很高的不穩(wěn)定的共價(jià)中間產(chǎn)物，加快反應(yīng)。共價(jià)催化的最一般形式是催化劑的親核基團(tuán)對(duì)底物中親電子的碳原子進(jìn)行攻擊，形成共價(jià)中間物。第八章-酶工程（一）課件121（5）多元催化與協(xié)同效應(yīng)酶的催化作用是一個(gè)綜合的結(jié)果，是要通過(guò)側(cè)鏈基團(tuán)協(xié)同作用來(lái)完成的。（5）多元催化與協(xié)同效應(yīng)122（四）酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)1概念熱力學(xué)：研究一個(gè)反應(yīng)能否進(jìn)行，進(jìn)行的程度（反應(yīng)物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的多少），只考慮始態(tài)、終態(tài)，不考慮歷程（如何反應(yīng)）?；瘜W(xué)動(dòng)力學(xué)：研究（1）反應(yīng)速度（2）反應(yīng)條件對(duì)速度的影響（3）反應(yīng)步驟（4）反應(yīng)機(jī)理（以便估價(jià)、控制、應(yīng)用）。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：研究酶促反應(yīng)的速度和影響此速度的各種因素以及反應(yīng)歷程。（四）酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)1概念1232底物濃度[S]對(duì)酶促反應(yīng)速度V與底物濃度[S]的關(guān)系Michaelis&Menten提出的著名的米氏方程根據(jù)如下現(xiàn)象的觀測(cè)當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)候，反應(yīng)速率與底物濃度成正比，即符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，反應(yīng)速率與底物濃度無(wú)關(guān)，即符合零級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)當(dāng)酶的濃度大大小于底物濃度時(shí)，反應(yīng)速率與酶的加入量成正比2底物濃度[S]對(duì)酶促反應(yīng)速度V與底物濃度[S]的關(guān)系Mi124根據(jù)中間絡(luò)合物假說(shuō)，Michaelis&Menten提出單底物酶催化的反應(yīng)機(jī)理如下：式中，E代表游離酶，ES為酶與底物的復(fù)合物；S為底物；P為產(chǎn)物；k+1,K-1,k+2為相應(yīng)各步反應(yīng)的反應(yīng)速率常數(shù)。根據(jù)中間絡(luò)合物假說(shuō)，Mich