遺傳性疾病的分子診斷課件

分子診斷的臨床應(yīng)用上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗系

樊綺詩分子診斷的臨床應(yīng)用上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗系1

用分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測基因而達(dá)到診斷疾病的目的是生物學(xué)者在分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的最初階段就有的設(shè)想。上世紀(jì)70年代人們開始在實驗室進(jìn)行研究，80年代以來，基因檢測在許多國家已成為常規(guī)檢驗項目，主要用于感染性和遺傳性疾病等的診斷。用分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測基因而達(dá)到21953年Watson和Crick提出脫氧核糖核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。1990年人類基因組計劃正式啟動。2001年2月科學(xué)家宣布完成人類基因組的全部序列圖。1953年Watson和Crick提出脫氧核糖核酸的雙螺3DNA重組技術(shù)(DNArecombination)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenictechnique)基因組學(xué)(genomics)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)基因治療(genotherapy)生物芯片(biochip)等技術(shù)已應(yīng)用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對疾病機理的認(rèn)識、疾病的診斷、預(yù)防和治療產(chǎn)生了深刻的影響。DNA重組技術(shù)(DNArecombination)4分子診斷不僅能早期對疾病作出確切的診斷，也能確定個體對疾病的易感性，判別致病基因攜帶者并對疾病的分期、分型、療效監(jiān)測和預(yù)后作出判斷。分子診斷已成為實驗診斷學(xué)的一個重要組成部分，成為一門新的學(xué)科。

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分子診斷不僅能早期對疾病作出確切的診5一、基因檢測在感染性疾病中的應(yīng)用一、基因檢測在感染性疾病中的應(yīng)用6SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷2003年4月，香港研究者Peiris等報告了50例嚴(yán)重型急性呼吸道綜合征(seriousacuterespiratorysyndrome,SARS)病人的臨床表現(xiàn)和病毒學(xué)研究結(jié)果。一種新的冠狀病毒(Coronavirus)是SARS的致病原因。

(Lancet,2003,361:9365)SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷2003年4月，香港研究者Pe7遺傳性疾病的分子診斷8檢測標(biāo)本痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液、血漿、糞便。檢測方法1.逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR(Reverse-NestedPCR)2.逆轉(zhuǎn)錄-實時PCR(Reverse-RealtimePCR)檢測標(biāo)本9有報道顯示，在可能SARS病人中病毒的檢出率為100%。在疑似SARS病人中的檢出率為23%。所有健康接觸者中未檢測到病毒。有報道顯示，在可能SARS病人中病毒的檢出10另一項研究顯示檢測病毒的3種方法（血清學(xué)檢測、病毒分離、PCR技術(shù)）中，PCR技術(shù)的檢出率最高。另一項研究顯示11討論PCR技術(shù)在疾病的早期即可獲得陽性結(jié)果(早于血清轉(zhuǎn)換期）。SARS患者中的陽性率約為80%，提示(當(dāng)時的)PCR方法有較高的特異性但靈敏度較差，陰性結(jié)果不能排除病毒感染。對照中的陰性率約為98%~100%。討論PCR技術(shù)在疾病的早期即可獲得陽性結(jié)果(早于血清轉(zhuǎn)換期12討論痰液中病毒RNA濃度極高，說明病毒從呼吸道排放是主要傳播途徑。血清中檢測到極低濃度的病毒RNA，提示病毒復(fù)制不僅發(fā)生于呼吸道。病人恢復(fù)晚期的糞便中存在病毒RNA，說明糞便可能也是一種傳播途徑。鼻、咽拭子中含有的病毒RNA顯著少于痰液，提示不適合作為標(biāo)本（有可能漏檢）。討論痰液中病毒RNA濃度極高，說明病毒從呼吸道排放是主要傳13SARS相關(guān)冠狀病毒基因檢測必須注意的問題必須在規(guī)范的基因擴增實驗室中進(jìn)行。應(yīng)采取必要的質(zhì)控規(guī)程，包括陽性對照和陰性對照。陽性結(jié)果時必須對原始樣本重復(fù)檢驗：或者擴增另一個基因片段或在另一個實驗室對同一樣本進(jìn)行檢測。SARS相關(guān)冠狀病毒基因檢測必須注意的問題必須在規(guī)范的基因擴14HPV基因的檢測

在預(yù)防宮頸癌中的作用

HPV基因的檢測

在預(yù)防宮頸癌中的作15宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，每年約有50萬左右新發(fā)病例。我國每年有新發(fā)病例約13.15萬，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的26%。

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二16持續(xù)的人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染是引起宮頸癌和癌前病變的必要因素，93.0%-99.7%的宮頸癌組織中均可檢測到HPVDNA。高危型HPV-16和HPV-18分別占宮頸癌的50%和14%。高危型HPV的持續(xù)感染可使患宮頸癌的風(fēng)險增加250倍。

持續(xù)的人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus17HPVDNA的檢測方法實時定量PCR(RealtimePCR)核酸擴增技術(shù)核酸雜交捕獲（HybridCaptureⅡ，HCⅡ）核酸雜交+信號放大技術(shù)HPVDNA的檢測方法18HCⅡ可一次檢測所有致癌的13種高危型HPV。敏感度：對CINⅡ、Ⅲ和癌的檢出率為98%。陰性預(yù)期值：對高度鱗狀上皮細(xì)胞病變或更高度病變的陰性預(yù)期值99.9%HCⅡ可一次檢測所有致癌的13種高危型HPV。19細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為意義不明確的非典型細(xì)胞時，HPV基因的檢測能預(yù)測受檢者患宮頸癌的風(fēng)險。細(xì)胞學(xué)檢查+HPV基因的檢測是宮頸癌前病變和宮頸癌篩查的最佳方法，成為預(yù)防宮頸癌的關(guān)鍵。細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為意義不明確的非典型細(xì)胞時，HPV基因的檢測能20基因檢測在監(jiān)測移植物排斥中的作用

基因檢測在監(jiān)測移植物排斥中的作用21關(guān)于多瘤病毒人類多瘤病毒中常見的3種病毒：BK、JC、SV40。BK病毒于1971年首次從腎臟移植受體的尿液中分離出。病毒主要在宿主的細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。關(guān)于多瘤病毒人類多瘤病毒中常見的3種病毒：BK、JC、SV422在美國，10歲以上的正常人群中60%～80%有BK病毒感染史。感染的病毒多潛伏于腎小管上皮細(xì)胞和尿道上皮細(xì)胞中。BK病毒的重新激活大部分是由于免疫機制缺陷或大量使用免疫抑制劑后。

在美國，10歲以上的正常人群中60%～80%有BK病毒感染史23腎臟移植術(shù)后大量使用免疫抑制劑，使BK病毒重新激活，大量復(fù)制。BK病毒復(fù)制進(jìn)一步發(fā)展，成為BK病毒感染的腎間質(zhì)性腎?。˙KVAN）。BKVAN患者中60%~70%會發(fā)生遠(yuǎn)期的腎臟移植失敗。腎臟移植術(shù)后大量使用免疫抑制劑，使BK病毒重新激活，大量復(fù)制24BK病毒感染已經(jīng)成為腎臟移植遠(yuǎn)期失敗的重要原因之一。BK病毒感染越來越受到關(guān)注。BK病毒感染已經(jīng)成為腎臟移植遠(yuǎn)期失敗的重要原因之一。25早期無臨床癥狀，后期癥狀與腎移植排斥和藥物毒性反應(yīng)相似，易引起漏診和誤診。BK病毒感染和移植排斥治療原則相反：BK病毒感染需要降低免疫抑制劑量，而移植排斥則應(yīng)加大用量。早期無臨床癥狀，后期癥狀與腎移植排斥和藥物毒性反應(yīng)相似，易引26因此， 建立有效的BK病毒檢測和監(jiān)測體系是十分必要的。因此，27decoy細(xì)胞BK病毒感染的腎臟小管上皮細(xì)胞脫落至尿液。形態(tài)學(xué)檢測敏感性較好，但特異性差。細(xì)胞形態(tài)在尿液中很容易破壞。decoy細(xì)胞28BK病毒感染的檢測BK病毒復(fù)制的檢測血、尿中BK病毒核酸定量檢測尿液中decoy細(xì)胞檢查尿沉渣涂片原位雜交組織病理學(xué)檢查（判斷腎臟間質(zhì)性腎?。〣K病毒感染的檢測BK病毒復(fù)制的檢測29腎臟移植術(shù)后病人BK病毒檢測的研究對象瑞金醫(yī)院腎臟移植術(shù)后2個月~3年的患者95例正常人標(biāo)本60例研究方法尿沉渣細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測血、尿中BK病毒DNA的定量檢測腎臟移植術(shù)后病人BK病毒檢測的研究對象30結(jié)果95例患者的尿沉渣形態(tài)學(xué)檢查，35例患者的尿沉渣中出現(xiàn)可疑的病毒感染腎小管上皮細(xì)胞（decoy細(xì)胞）。結(jié)果95例患者的尿沉渣形態(tài)學(xué)檢查，35例患者的尿沉31尿液中BK病毒核酸定量檢測14例尿液中檢測到BKVDNA，病毒載量為4×103~2×109拷貝/ml，平均為5.6×105拷貝/ml。發(fā)生病毒尿的中位時間為移植術(shù)后14個月。尿液中BK病毒核酸定量檢測323例患者在臨床上出現(xiàn)不明原因的發(fā)熱、白細(xì)胞降低、緩慢的肌酐升高等癥狀，有1例甚至出現(xiàn)了尿道阻塞。臨床上認(rèn)為發(fā)生BKVAN的可能性較大，給予抗病毒治療。3例患者在臨床上出現(xiàn)不明原因的發(fā)熱、白細(xì)胞降低、緩慢的肌酐升33病例1、2治療前：尿液和血漿病毒核酸載量在104/ml~105/ml血肌酐分別為181μmol/L和168μmol/L治療后：血漿和尿液中BK病毒已檢測不出血肌酐降為160μmol/L和129μmol/L

病例1、2治療前：

34病例3治療前尿液中BK病毒核酸載量為2×109拷貝/ml尿沉渣細(xì)胞中見到大量decoy細(xì)胞和炎性細(xì)胞治療后尿液中BK病毒核酸載量降至105拷貝/ml尿沉渣細(xì)胞中decoy細(xì)胞明顯減少病例3治療前35討論文獻(xiàn)報道BK病毒的復(fù)制感染率為5%～60%，本研究中發(fā)生BK病毒復(fù)制的占14.7%。35例患者中發(fā)現(xiàn)decoy細(xì)胞，僅14例被證實存在病毒核酸，提示形態(tài)學(xué)檢查特異性差。腎臟移植的患者容易導(dǎo)致包括BK病毒在內(nèi)的多種病毒感染。討論文獻(xiàn)報道BK病毒的復(fù)制感染率為5%～60%，本研究中發(fā)36因此是否存在BK病毒感染，形態(tài)學(xué)僅作為篩查實驗。病毒核酸定量可有效地動態(tài)觀察病毒核酸的復(fù)制。因此37BK病毒核酸定量檢測用于檢測BK病毒是否復(fù)制為是否需要進(jìn)行病理學(xué)檢查提供依據(jù)監(jiān)測疾病和評價治療效果預(yù)防間質(zhì)性腎病，防止移植遠(yuǎn)期失敗BK病毒核酸定量檢測38二、遺傳性疾病的分子診斷二、遺傳性疾病的分子診斷39分子診斷能夠檢出家系中的致病基因攜帶者或高危個體，能夠在胎兒出生前判斷其是否為患者，因此分子診斷是降低單基因遺傳病發(fā)病率的根本措施。分子診斷能夠檢出家系中的致病基因攜帶者或高危個40單基因遺傳病是由于某一基因結(jié)構(gòu)的變化或基因表達(dá)異常而導(dǎo)致的疾病用分子生物學(xué)技術(shù)檢測致病基因的遺傳缺陷是診斷這類疾病最根本的手段。單基因遺傳病是由于某一基因結(jié)構(gòu)的變化或基因表達(dá)異常而導(dǎo)致的疾41遺傳性疾病中常見的分子異常致病基因異常而導(dǎo)致所載有的遺傳信息受到改變，而疾病的發(fā)生則是通過遺傳物質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)（或酶等）的表現(xiàn)異常所致?；蛲蛔冎饕c突變、片段性突變和動態(tài)性突變。遺傳性疾病中常見的分子異常致病基因異常而導(dǎo)致所載有的遺傳信息42點突變(pointmutation)包括錯義突變、無義突變、移碼突變。各種點突變所造成的后果：

蛋白質(zhì)分子量改變蛋白質(zhì)合成量下降無蛋白質(zhì)合成點突變(pointmutation)包括錯義突變、無義突43片段性突變(fragememtalmutation)核苷酸的丟失和增多缺失：基因中鹼基（遺傳物質(zhì)）的丟失插入：外來基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復(fù)基因重排：基因組中原來不在一起的基因由于某些原因組合排列在一起片段性突變(fragememtalmutation)核苷酸44動態(tài)性突變(dynamicmutation)以三核苷酸為單位的重復(fù)序列在傳遞過程中不穩(wěn)定，會發(fā)生擴展，即子代的重復(fù)次數(shù)往往較親代大為增加，因此又稱動態(tài)性突變。

脆性X綜合征：CGG重復(fù)少年脊髓型共濟失調(diào)：GAA重復(fù)

Huntington?。篊AG重復(fù)……動態(tài)性突變(dynamicmutation)以三核苷酸為單45遺傳性疾病基因診斷的策略（一）直接診斷策略

基因診斷的直接策略是通過各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。直接診斷由于是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。

遺傳性疾病基因診斷的策略（一）直接診斷策略46DMD的基因檢測

Duchennemusculardystrophy(DMD)是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X連鎖的遺傳性疾病，在3500個活產(chǎn)男嬰中即有一個患者。DMD基因的全長為250kb，有79個外顯子。DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%~70%。DMD的基因檢測Duchennemusculardys47（二）間接診斷策略

間接診斷的實質(zhì)是在家系中進(jìn)行連鎖分析，通過分析，可確定被檢個體來自雙親的同源染色體中的哪一條與疾病連鎖（致病染色體），從而判斷該個體是否帶有致病基因。

間接診斷不是尋找DNA的遺傳缺陷，而是通過分析DNA的遺傳標(biāo)志的多態(tài)性估計被檢者患病的可能性。（二）間接診斷策略間接診斷的實質(zhì)是在家48間接診斷：分析DNA的遺傳標(biāo)志的多態(tài)性

真核生物染色體DNA中存在許多不同程度的重復(fù)序列，根據(jù)DNA序列出現(xiàn)頻率的不同而分為不同類型。間接診斷：分析DNA的遺傳標(biāo)志的多態(tài)性真核生物染色體49單拷貝序列在基因組中僅出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，大多數(shù)基因(50%-80%)在單倍體中都為單拷貝。單拷貝序列50中度重復(fù)序列

重復(fù)次數(shù)為數(shù)十至數(shù)萬(<105)次，長度多在300-7000bp，多為不編碼序列，與單拷貝基因間隔排列。如Alu家族、KpnI家族、rRNA等。中度重復(fù)序列51高度重復(fù)序列存在于基因組的間隔區(qū)和基因的內(nèi)含子等非編碼區(qū)重復(fù)頻率可高達(dá)106以上，不轉(zhuǎn)錄具高度多態(tài)性，成為有效的遺傳標(biāo)記志已廣泛用于基因定位和基因診斷高度重復(fù)序列52雙等位基因(bi-allele）多態(tài)性：限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）第一代DNA遺傳標(biāo)記，所含信息量有限。

檢測技術(shù)：Southern印跡技術(shù)雙等位基因(bi-allele）多態(tài)性：53多等位基因多態(tài)性(multi-allele)小衛(wèi)星序列又稱串聯(lián)重復(fù)可變數(shù)目（variablenumbertandemrepeats，VNTR）第二代DNA遺傳標(biāo)志，屬高度重復(fù)序列以6~70bp為單位，以串聯(lián)形式排列，構(gòu)成數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列等位基因常常達(dá)10個以上，信息量比RFLP大檢測技術(shù)：PCR

多等位基因多態(tài)性(multi-allele)小衛(wèi)星序列54微衛(wèi)星序列(microsatellite)以2~6bp為單位(如CArepeat)，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)。在基因組中分布廣泛，重復(fù)次數(shù)可達(dá)幾十次，具高度多態(tài)性。檢測技術(shù)：PCR遺傳性疾病的分子診斷55單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepoly-morphism，SNP)第三代DNA的遺傳標(biāo)志，其多態(tài)性僅表現(xiàn)為單個核苷酸的變異。在人類基因組中的數(shù)目可達(dá)300萬個，是一種信息量非常大的標(biāo)記系統(tǒng)。

檢測技術(shù)：DNA芯片技術(shù)單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepoly56凝血因子Ⅷ(F8)基因的主要遺傳缺陷主要為點突變和基因缺失 缺失 169種

插入 28種

點突變 347種第22號內(nèi)含子倒位:40%-50%重型HA

凝血因子Ⅷ(F8)基因的主要遺傳缺陷主要為點突變和基因缺失57間接診斷的不確定性遺傳標(biāo)志所帶的信息有限新突變基因重組家系成員不完整間接診斷的不確定性遺傳標(biāo)志所帶的信息有限58三、基因檢測在多基因病中的應(yīng)用三、基因檢測在多基因病中的應(yīng)用59

多基因病具一定的遺傳因素，家庭發(fā)病率高于人群發(fā)病率，但是疾病的產(chǎn)生都以一定的環(huán)境條件為誘因，遺傳因素在其中所起作用程度各異。多基因病具一定的遺傳因素，家庭發(fā)病率高于人群發(fā)60多基因病中的遺傳因素是若干個易感基因微小作用的累加，某一易感基因結(jié)構(gòu)的變化不足以導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。多基因病中的遺傳因素是若干個易感基因微小作用的61

人類基因組多態(tài)性是多基因病基因診斷的基礎(chǔ)，易感基因多態(tài)性的檢測能幫助我們理解多基因病發(fā)生的機制，有助于對疾病的診斷和分類。人類基因組多態(tài)性是多基因病基因診斷的基礎(chǔ)，易感62高血壓候選基因多態(tài)性分析

在EH中的應(yīng)用前景

臨床分型靶器官損傷研究個體化治療高血壓候選基因多態(tài)性分析

在EH中的應(yīng)用前景63基因多態(tài)性與鹽敏感性高血壓

-內(nèi)收素 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶上皮鈉通道 血管緊張素原心鈉素 2腎上腺素能受體SAG蛋白亞單位3基因多態(tài)性與鹽敏感性高血壓-內(nèi)收素 血管緊張素轉(zhuǎn)換64基因多態(tài)性與高血壓靶器官損傷腦卒中

載脂蛋白E-纖維蛋白原血管緊張素原

血管緊張素II的1型受體內(nèi)皮型一氧化氮合酶心鈉素冠心病

副氧酶凝血因子V凝血因子VII載脂蛋白B基因多態(tài)性與高血壓靶器官損傷腦卒中65基因多態(tài)性檢測與個體化治療有朝一日，臨床醫(yī)師能根據(jù)病人易感基因的多態(tài)性設(shè)計有效的、個體化的治療方案，以達(dá)到最佳治療效果?；蚨鄳B(tài)性檢測與個體化治療有朝一日，臨床醫(yī)師能66ATG基因多態(tài)性研究目的：觀察ATG基因分型與限鈉鹽攝入及減輕體重后的血壓變化和高血壓發(fā)病率間的關(guān)系對象：1509例基因分析：ATG基因G-A多態(tài)性結(jié)果：三年后高血壓發(fā)生率（%）

對照組限鹽組減輕體重組AA型452825GG型324132

HuntSC,etal:Hypertension,1998;32:393-401ATG基因多態(tài)性研究目的：觀察ATG基因分型與限鈉鹽攝入及減67基因多態(tài)性分析指導(dǎo)抗高血壓藥物的選擇藥物種類基因

利尿劑-內(nèi)收素

ACE抑制劑ACE、AT1-受體阻滯劑G蛋白（Gs)基因多態(tài)性分析指導(dǎo)抗高血壓藥物的選擇藥物種類68四、腫瘤相關(guān)基因檢測

在腫瘤病情監(jiān)測中的應(yīng)用

四、腫瘤相關(guān)基因檢測

在腫瘤病情監(jiān)測中的69

腫瘤是由于遺傳物質(zhì)（腫瘤相關(guān)基因）發(fā)生突變而導(dǎo)致的疾病。腫瘤相關(guān)基因的突變只是增加了個體對腫瘤的易感性而并不一定馬上產(chǎn)生腫瘤，腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多步驟打擊的過程。腫瘤是由于遺傳物質(zhì)（腫瘤相關(guān)基因）發(fā)70實時定量RT-PCR技術(shù)

在急性早幼粒細(xì)胞白血病中的應(yīng)用實時定量RT-PCR技術(shù)

在急性早幼粒細(xì)胞白71初發(fā)APL的PML-RAR融合基因的拷貝數(shù)均大于1000。經(jīng)全反式維甲酸、ATRA+化療、三氧化二砷治療獲得緩解后，其PML-RAR融合基因的拷貝數(shù)明顯降低，并隨著鞏固治療的進(jìn)行而進(jìn)一步降低。初發(fā)APL的PML-RAR融合基因的拷貝數(shù)均大于1000。72長期無病生存的患者的PML-RAR融合基因的拷貝數(shù)均長期低于200。一旦患者的檢測值高于該值，則強烈提示復(fù)發(fā)的可能。長期無病生存的患者的PML-RAR融合基因的73CEA基因的定量檢測在監(jiān)測胃腸癌微轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用CEA基因的定量檢測74

CEA基因在消化系統(tǒng)上皮腺癌，尤其是直結(jié)腸癌和胃癌中高表達(dá)，而在正常成人體內(nèi)極少表達(dá)。CEA基因在消化系統(tǒng)上皮腺癌，尤其是直結(jié)腸癌和75

在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移時，外周血中有少量腫瘤細(xì)胞殘留。用PCR技術(shù)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可檢測到CEA基因的轉(zhuǎn)錄本。在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移時，外周血中有少量腫瘤細(xì)胞殘留。76

用靈敏、特異的熒光定量PCR技術(shù)檢測到這些腫瘤細(xì)胞中CEA基因的轉(zhuǎn)錄本，是發(fā)現(xiàn)腫瘤早期轉(zhuǎn)移的有效手段。用靈敏、特異的熒光定量PCR技術(shù)檢測到這些腫瘤77分子診斷的臨床應(yīng)用上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗系

樊綺詩分子診斷的臨床應(yīng)用上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗系78

用分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測基因而達(dá)到診斷疾病的目的是生物學(xué)者在分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的最初階段就有的設(shè)想。上世紀(jì)70年代人們開始在實驗室進(jìn)行研究，80年代以來，基因檢測在許多國家已成為常規(guī)檢驗項目，主要用于感染性和遺傳性疾病等的診斷。用分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測基因而達(dá)到791953年Watson和Crick提出脫氧核糖核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。1990年人類基因組計劃正式啟動。2001年2月科學(xué)家宣布完成人類基因組的全部序列圖。1953年Watson和Crick提出脫氧核糖核酸的雙螺80DNA重組技術(shù)(DNArecombination)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenictechnique)基因組學(xué)(genomics)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)基因治療(genotherapy)生物芯片(biochip)等技術(shù)已應(yīng)用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對疾病機理的認(rèn)識、疾病的診斷、預(yù)防和治療產(chǎn)生了深刻的影響。DNA重組技術(shù)(DNArecombination)81分子診斷不僅能早期對疾病作出確切的診斷，也能確定個體對疾病的易感性，判別致病基因攜帶者并對疾病的分期、分型、療效監(jiān)測和預(yù)后作出判斷。分子診斷已成為實驗診斷學(xué)的一個重要組成部分，成為一門新的學(xué)科。

MoleculardiagnosisMoleculardiagnostics

分子診斷不僅能早期對疾病作出確切的診82一、基因檢測在感染性疾病中的應(yīng)用一、基因檢測在感染性疾病中的應(yīng)用83SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷2003年4月，香港研究者Peiris等報告了50例嚴(yán)重型急性呼吸道綜合征(seriousacuterespiratorysyndrome,SARS)病人的臨床表現(xiàn)和病毒學(xué)研究結(jié)果。一種新的冠狀病毒(Coronavirus)是SARS的致病原因。

(Lancet,2003,361:9365)SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷2003年4月，香港研究者Pe84遺傳性疾病的分子診斷85檢測標(biāo)本痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液、血漿、糞便。檢測方法1.逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR(Reverse-NestedPCR)2.逆轉(zhuǎn)錄-實時PCR(Reverse-RealtimePCR)檢測標(biāo)本86有報道顯示，在可能SARS病人中病毒的檢出率為100%。在疑似SARS病人中的檢出率為23%。所有健康接觸者中未檢測到病毒。有報道顯示，在可能SARS病人中病毒的檢出87另一項研究顯示檢測病毒的3種方法（血清學(xué)檢測、病毒分離、PCR技術(shù)）中，PCR技術(shù)的檢出率最高。另一項研究顯示88討論PCR技術(shù)在疾病的早期即可獲得陽性結(jié)果(早于血清轉(zhuǎn)換期）。SARS患者中的陽性率約為80%，提示(當(dāng)時的)PCR方法有較高的特異性但靈敏度較差，陰性結(jié)果不能排除病毒感染。對照中的陰性率約為98%~100%。討論PCR技術(shù)在疾病的早期即可獲得陽性結(jié)果(早于血清轉(zhuǎn)換期89討論痰液中病毒RNA濃度極高，說明病毒從呼吸道排放是主要傳播途徑。血清中檢測到極低濃度的病毒RNA，提示病毒復(fù)制不僅發(fā)生于呼吸道。病人恢復(fù)晚期的糞便中存在病毒RNA，說明糞便可能也是一種傳播途徑。鼻、咽拭子中含有的病毒RNA顯著少于痰液，提示不適合作為標(biāo)本（有可能漏檢）。討論痰液中病毒RNA濃度極高，說明病毒從呼吸道排放是主要傳90SARS相關(guān)冠狀病毒基因檢測必須注意的問題必須在規(guī)范的基因擴增實驗室中進(jìn)行。應(yīng)采取必要的質(zhì)控規(guī)程，包括陽性對照和陰性對照。陽性結(jié)果時必須對原始樣本重復(fù)檢驗：或者擴增另一個基因片段或在另一個實驗室對同一樣本進(jìn)行檢測。SARS相關(guān)冠狀病毒基因檢測必須注意的問題必須在規(guī)范的基因擴91HPV基因的檢測

在預(yù)防宮頸癌中的作用

HPV基因的檢測

在預(yù)防宮頸癌中的作92宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，每年約有50萬左右新發(fā)病例。我國每年有新發(fā)病例約13.15萬，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的26%。

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二93持續(xù)的人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染是引起宮頸癌和癌前病變的必要因素，93.0%-99.7%的宮頸癌組織中均可檢測到HPVDNA。高危型HPV-16和HPV-18分別占宮頸癌的50%和14%。高危型HPV的持續(xù)感染可使患宮頸癌的風(fēng)險增加250倍。

持續(xù)的人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus94HPVDNA的檢測方法實時定量PCR(RealtimePCR)核酸擴增技術(shù)核酸雜交捕獲（HybridCaptureⅡ，HCⅡ）核酸雜交+信號放大技術(shù)HPVDNA的檢測方法95HCⅡ可一次檢測所有致癌的13種高危型HPV。敏感度：對CINⅡ、Ⅲ和癌的檢出率為98%。陰性預(yù)期值：對高度鱗狀上皮細(xì)胞病變或更高度病變的陰性預(yù)期值99.9%HCⅡ可一次檢測所有致癌的13種高危型HPV。96細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為意義不明確的非典型細(xì)胞時，HPV基因的檢測能預(yù)測受檢者患宮頸癌的風(fēng)險。細(xì)胞學(xué)檢查+HPV基因的檢測是宮頸癌前病變和宮頸癌篩查的最佳方法，成為預(yù)防宮頸癌的關(guān)鍵。細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為意義不明確的非典型細(xì)胞時，HPV基因的檢測能97基因檢測在監(jiān)測移植物排斥中的作用

基因檢測在監(jiān)測移植物排斥中的作用98關(guān)于多瘤病毒人類多瘤病毒中常見的3種病毒：BK、JC、SV40。BK病毒于1971年首次從腎臟移植受體的尿液中分離出。病毒主要在宿主的細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。關(guān)于多瘤病毒人類多瘤病毒中常見的3種病毒：BK、JC、SV499在美國，10歲以上的正常人群中60%～80%有BK病毒感染史。感染的病毒多潛伏于腎小管上皮細(xì)胞和尿道上皮細(xì)胞中。BK病毒的重新激活大部分是由于免疫機制缺陷或大量使用免疫抑制劑后。

在美國，10歲以上的正常人群中60%～80%有BK病毒感染史100腎臟移植術(shù)后大量使用免疫抑制劑，使BK病毒重新激活，大量復(fù)制。BK病毒復(fù)制進(jìn)一步發(fā)展，成為BK病毒感染的腎間質(zhì)性腎?。˙KVAN）。BKVAN患者中60%~70%會發(fā)生遠(yuǎn)期的腎臟移植失敗。腎臟移植術(shù)后大量使用免疫抑制劑，使BK病毒重新激活，大量復(fù)制101BK病毒感染已經(jīng)成為腎臟移植遠(yuǎn)期失敗的重要原因之一。BK病毒感染越來越受到關(guān)注。BK病毒感染已經(jīng)成為腎臟移植遠(yuǎn)期失敗的重要原因之一。102早期無臨床癥狀，后期癥狀與腎移植排斥和藥物毒性反應(yīng)相似，易引起漏診和誤診。BK病毒感染和移植排斥治療原則相反：BK病毒感染需要降低免疫抑制劑量，而移植排斥則應(yīng)加大用量。早期無臨床癥狀，后期癥狀與腎移植排斥和藥物毒性反應(yīng)相似，易引103因此， 建立有效的BK病毒檢測和監(jiān)測體系是十分必要的。因此，104decoy細(xì)胞BK病毒感染的腎臟小管上皮細(xì)胞脫落至尿液。形態(tài)學(xué)檢測敏感性較好，但特異性差。細(xì)胞形態(tài)在尿液中很容易破壞。decoy細(xì)胞105BK病毒感染的檢測BK病毒復(fù)制的檢測血、尿中BK病毒核酸定量檢測尿液中decoy細(xì)胞檢查尿沉渣涂片原位雜交組織病理學(xué)檢查（判斷腎臟間質(zhì)性腎?。〣K病毒感染的檢測BK病毒復(fù)制的檢測106腎臟移植術(shù)后病人BK病毒檢測的研究對象瑞金醫(yī)院腎臟移植術(shù)后2個月~3年的患者95例正常人標(biāo)本60例研究方法尿沉渣細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測血、尿中BK病毒DNA的定量檢測腎臟移植術(shù)后病人BK病毒檢測的研究對象107結(jié)果95例患者的尿沉渣形態(tài)學(xué)檢查，35例患者的尿沉渣中出現(xiàn)可疑的病毒感染腎小管上皮細(xì)胞（decoy細(xì)胞）。結(jié)果95例患者的尿沉渣形態(tài)學(xué)檢查，35例患者的尿沉108尿液中BK病毒核酸定量檢測14例尿液中檢測到BKVDNA，病毒載量為4×103~2×109拷貝/ml，平均為5.6×105拷貝/ml。發(fā)生病毒尿的中位時間為移植術(shù)后14個月。尿液中BK病毒核酸定量檢測1093例患者在臨床上出現(xiàn)不明原因的發(fā)熱、白細(xì)胞降低、緩慢的肌酐升高等癥狀，有1例甚至出現(xiàn)了尿道阻塞。臨床上認(rèn)為發(fā)生BKVAN的可能性較大，給予抗病毒治療。3例患者在臨床上出現(xiàn)不明原因的發(fā)熱、白細(xì)胞降低、緩慢的肌酐升110病例1、2治療前：尿液和血漿病毒核酸載量在104/ml~105/ml血肌酐分別為181μmol/L和168μmol/L治療后：血漿和尿液中BK病毒已檢測不出血肌酐降為160μmol/L和129μmol/L

病例1、2治療前：

111病例3治療前尿液中BK病毒核酸載量為2×109拷貝/ml尿沉渣細(xì)胞中見到大量decoy細(xì)胞和炎性細(xì)胞治療后尿液中BK病毒核酸載量降至105拷貝/ml尿沉渣細(xì)胞中decoy細(xì)胞明顯減少病例3治療前112討論文獻(xiàn)報道BK病毒的復(fù)制感染率為5%～60%，本研究中發(fā)生BK病毒復(fù)制的占14.7%。35例患者中發(fā)現(xiàn)decoy細(xì)胞，僅14例被證實存在病毒核酸，提示形態(tài)學(xué)檢查特異性差。腎臟移植的患者容易導(dǎo)致包括BK病毒在內(nèi)的多種病毒感染。討論文獻(xiàn)報道BK病毒的復(fù)制感染率為5%～60%，本研究中發(fā)113因此是否存在BK病毒感染，形態(tài)學(xué)僅作為篩查實驗。病毒核酸定量可有效地動態(tài)觀察病毒核酸的復(fù)制。因此114BK病毒核酸定量檢測用于檢測BK病毒是否復(fù)制為是否需要進(jìn)行病理學(xué)檢查提供依據(jù)監(jiān)測疾病和評價治療效果預(yù)防間質(zhì)性腎病，防止移植遠(yuǎn)期失敗BK病毒核酸定量檢測115二、遺傳性疾病的分子診斷二、遺傳性疾病的分子診斷116分子診斷能夠檢出家系中的致病基因攜帶者或高危個體，能夠在胎兒出生前判斷其是否為患者，因此分子診斷是降低單基因遺傳病發(fā)病率的根本措施。分子診斷能夠檢出家系中的致病基因攜帶者或高危個117單基因遺傳病是由于某一基因結(jié)構(gòu)的變化或基因表達(dá)異常而導(dǎo)致的疾病用分子生物學(xué)技術(shù)檢測致病基因的遺傳缺陷是診斷這類疾病最根本的手段。單基因遺傳病是由于某一基因結(jié)構(gòu)的變化或基因表達(dá)異常而導(dǎo)致的疾118遺傳性疾病中常見的分子異常致病基因異常而導(dǎo)致所載有的遺傳信息受到改變，而疾病的發(fā)生則是通過遺傳物質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)（或酶等）的表現(xiàn)異常所致?；蛲蛔冎饕c突變、片段性突變和動態(tài)性突變。遺傳性疾病中常見的分子異常致病基因異常而導(dǎo)致所載有的遺傳信息119點突變(pointmutation)包括錯義突變、無義突變、移碼突變。各種點突變所造成的后果：

蛋白質(zhì)分子量改變蛋白質(zhì)合成量下降無蛋白質(zhì)合成點突變(pointmutation)包括錯義突變、無義突120片段性突變(fragememtalmutation)核苷酸的丟失和增多缺失：基因中鹼基（遺傳物質(zhì)）的丟失插入：外來基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復(fù)基因重排：基因組中原來不在一起的基因由于某些原因組合排列在一起片段性突變(fragememtalmutation)核苷酸121動態(tài)性突變(dynamicmutation)以三核苷酸為單位的重復(fù)序列在傳遞過程中不穩(wěn)定，會發(fā)生擴展，即子代的重復(fù)次數(shù)往往較親代大為增加，因此又稱動態(tài)性突變。

脆性X綜合征：CGG重復(fù)少年脊髓型共濟失調(diào)：GAA重復(fù)

Huntington病：CAG重復(fù)……動態(tài)性突變(dynamicmutation)以三核苷酸為單122遺傳性疾病基因診斷的策略（一）直接診斷策略

基因診斷的直接策略是通過各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。直接診斷由于是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。

遺傳性疾病基因診斷的策略（一）直接診斷策略123DMD的基因檢測

Duchennemusculardystrophy(DMD)是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X連鎖的遺傳性疾病，在3500個活產(chǎn)男嬰中即有一個患者。DMD基因的全長為250kb，有79個外顯子。DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%~70%。DMD的基因檢測Duchennemusculardys124（二）間接診斷策略

間接診斷的實質(zhì)是在家系中進(jìn)行連鎖分析，通過分析，可確定被檢個體來自雙親的同源染色體中的哪一條與疾病連鎖（致病染色體），從而判斷該個體是否帶有致病基因。

間接診斷不是尋找DNA的遺傳缺陷，而是通過分析DNA的遺傳標(biāo)志的多態(tài)性估計被檢者患病的可能性。（二）間接診斷策略間接診斷的實質(zhì)是在家125間接診斷：分析DNA的遺傳標(biāo)志的多態(tài)性

真核生物染色體DNA中存在許多不同程度的重復(fù)序列，根據(jù)DNA序列出現(xiàn)頻率的不同而分為不同類型。間接診斷：分析DNA的遺傳標(biāo)志的多態(tài)性真核生物染色體126單拷貝序列在基因組中僅出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，大多數(shù)基因(50%-80%)在單倍體中都為單拷貝。單拷貝序列127中度重復(fù)序列

重復(fù)次數(shù)為數(shù)十至數(shù)萬(<105)次，長度多在300-7000bp，多為不編碼序列，與單拷貝基因間隔排列。如Alu家族、KpnI家族、rRNA等。中度重復(fù)序列128高度重復(fù)序列存在于基因組的間隔區(qū)和基因的內(nèi)含子等非編碼區(qū)重復(fù)頻率可高達(dá)106以上，不轉(zhuǎn)錄具高度多態(tài)性，成為有效的遺傳標(biāo)記志已廣泛用于基因定位和基因診斷高度重復(fù)序列129雙等位基因(bi-allele）多態(tài)性：限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）第一代DNA遺傳標(biāo)記，所含信息量有限。

檢測技術(shù)：Southern印跡技術(shù)雙等位基因(bi-allele）多態(tài)性：130多等位基因多態(tài)性(multi-allele)小衛(wèi)星序列又稱串聯(lián)重復(fù)可變數(shù)目（variablenumbertandemrepeats，VNTR）第二代DNA遺傳標(biāo)志，屬高度重復(fù)序列以6~70bp為單位，以串聯(lián)形式排列，構(gòu)成數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列等位基因常常達(dá)10個以上，信息量比RFLP大檢測技術(shù)：PCR

多等位基因多態(tài)性(multi-allele)小衛(wèi)星序列131微衛(wèi)星序列(microsatellite)以2~6bp為單位(如CArepeat)，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)。在基因組中分布廣泛，重復(fù)次數(shù)可達(dá)幾十次，具高度多態(tài)性。檢測技術(shù)：PCR遺傳性疾病的分子診斷132單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepoly-morphism，SNP)第三代DNA的遺傳標(biāo)志，其多態(tài)性僅表現(xiàn)為單個核苷酸的變異。在人類基因組中的數(shù)目可達(dá)300萬個，是一種信息量非常大的標(biāo)記系統(tǒng)。

檢測技術(shù)：DNA芯片技術(shù)單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepoly133凝血因子Ⅷ(F8)基因的主要遺傳缺陷主要為點突變和基因缺失 缺失 169種

插入 28種

點突變 347種第22號內(nèi)含子倒位:40%-50%重型HA

凝血因子Ⅷ(F8)基因的主要遺傳缺陷主要為點突變和基因缺失134間接診斷的不確定性遺傳標(biāo)志所帶的信息有限新突變基因重組家系成員不完整間接診斷的不確定性遺傳標(biāo)志所帶的信息有限135三、基因檢測在多基因病中的應(yīng)用三、基因檢測在多基因病中的應(yīng)用136

多基因病具一定的遺傳因素，家庭發(fā)病率高于人群發(fā)病率，但是疾病的產(chǎn)生都以一定的環(huán)境條件為誘因，遺傳因素在其中所起作用程度各異。多基因病具一定的遺傳因素，家庭發(fā)病率高于人群發(fā)137多基因病中的遺傳因素是若干個易感基因微小作用的累加，某一易感基因結(jié)構(gòu)的變化不足以導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。多基因病中的遺傳因素是若干個易感基因微小作用的138

人類基因組多態(tài)性是多基因病基因診斷的基礎(chǔ)，易感基因多態(tài)性的檢測能幫助我們理解多基因病發(fā)生的機制，有助于對疾病的診斷和分類。人類基因組多態(tài)性是多基因病基因診斷的基礎(chǔ)，易感139高血壓候選基因多態(tài)性分析

在EH中的應(yīng)用前景

臨床分型