冷凍保存技術(shù)-胚胎冷凍保存課件

冷凍保存技術(shù)---胚胎冷凍保存

胚胎冷凍保存是將胚胎保存在-196℃超低溫的液氮（或其他抗凍保護(hù)劑）中做長期保存?？墒古咛ヒ浦膊皇軙r間地點(diǎn)的限制，從而達(dá)到提高胚胎移植效率，長期保存優(yōu)良基因的目的。胚胎冷凍技術(shù)為建立優(yōu)良品種的胚胎庫提供了條件，還可以長期保存珍貴或?yàn)l臨滅絕的動物資源。研究和優(yōu)化胚胎冷凍保存技術(shù)對胚胎工程的發(fā)展有重要的意義。

抗凍保護(hù)劑胚胎冷凍的關(guān)鍵是減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成對胚胎的損傷。對于胚胎的冷凍和解凍，一50~-15℃是一個致死溫度區(qū)。在這個溫度區(qū)細(xì)胞容易形成大的冰晶。加入抗凍保護(hù)劑能避免冰晶的形成。分類：滲透型冷凍保護(hù)劑；非滲透性冷凍保護(hù)劑滲透型冷凍保護(hù)劑屬于細(xì)胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑，一般小分子物質(zhì)，在0℃以上很容易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。機(jī)理：在進(jìn)行胚胎冷凍時，保護(hù)劑使水分子從細(xì)胞內(nèi)滲透出，減少了細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成；同時保護(hù)劑與水分子形成氫鍵，降低了凍結(jié)部分的電解質(zhì)濃度從而減少了冷凍過程對細(xì)胞的損傷。常見的滲透型冷凍保護(hù)劑有：甘油、二甲基要亞砜（DMSO）、丙二醇和乙二醇等。冷凍方法冷凍保護(hù)液常用pH7.2~7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）來配制，也可用生理鹽水或M199來配制。在實(shí)際應(yīng)用中，緩慢冷凍法經(jīng)常只使用一種抗凍保護(hù)劑；快速冷凍和玻璃化冷凍常應(yīng)用多種康冷凍保護(hù)劑，如甘油、丙二醇和乙二醇或者乙二醇和丙二醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖?，F(xiàn)有保存方法有4種：常規(guī)冷凍法；一步冷凍法；程序冷凍法和玻璃化冷凍化。（書本中著重講述后兩種）常規(guī)冷凍法也叫慢速冷凍法、逐步降溫法?；静襟E：將采集到的胚胎用培養(yǎng)液洗滌后置入有不同冷凍保護(hù)劑(甘油或二甲亞楓(DMSO)等)濃度的三種冷凍液中(冷凍液濃度由低到高，最終濃度1．4M)，每種冷凍液中平衡5分鐘。然后將胚胎和冷凍液裝入細(xì)管中封口、標(biāo)記，放入冷凍儀中進(jìn)行冷凍。冷凍速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此溫度誘發(fā)結(jié)晶，平衡10分鐘。然后，以0．3℃／分的速率降溫至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。胚胎解凍后，需按胚胎進(jìn)入冷凍液時的相反濃度，即從高到低濃度脫除冷凍保護(hù)劑，每步5分鐘，最后置入含20％血清的PBS保護(hù)液中洗滌3次，徹底脫除冷凍保護(hù)劑?；蛘邔⒔鈨龊蟮呐咛シ湃?．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分鐘，再用上述PBS液洗滌3次。一步冷凍法也叫一步細(xì)管法。該方法是由慢速冷凍法改進(jìn)而來，細(xì)管內(nèi)的冷凍液和蔗糖液是分開的，因此，在細(xì)管內(nèi)用蔗糖液可一步脫除甘油抗凍劑，從而利于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。程序冷凍法也叫慢速冷凍法、逐步降溫法。所用冷凍保護(hù)劑一般為：二甲亞砜（DMSO）、氨基酸、丙三醇（甘油）、1,2-丙二醇等。該法采用較低濃度的冷凍保護(hù)劑，對胚胎毒性損害小，解凍后存活率較高。但因其操作繁瑣，降溫速度慢，致使所需時間長，需要特殊的降溫裝置，在不具備實(shí)驗(yàn)條件的場所不能使用此法進(jìn)行胚胎冷凍。目前國內(nèi)外均較少使用。影響因素包括：抗凍保護(hù)劑的選擇與濃度、植冰和降溫速度、解凍方法、抗凍的脫出等大致基本步驟如下：不論是細(xì)胞滲透性還是細(xì)胞非滲透性的保護(hù)劑都主要是為了給細(xì)胞造成脫水狀態(tài)，但脫水的同時不能影響到細(xì)胞的生存；減少細(xì)胞外大冰晶的形成對細(xì)胞造成的損害也是冷凍應(yīng)注意的方面之一。業(yè)已證實(shí)，單純就低溫保存而言，影響細(xì)胞冷凍保存的關(guān)鍵因素，是細(xì)胞冷凍和復(fù)溫過程中，必須兩次經(jīng)過冰晶形成和重結(jié)晶的中間損傷溫度區(qū)。在冷凍過程中，如果含水量過多，細(xì)胞可能毀于過度冰晶形成。但脫水過度，細(xì)胞也可能死亡。理想的冷凍方案是：①找到細(xì)胞含水過多和脫水過度之間的平衡點(diǎn)；②合適劑量的冷凍保護(hù)劑，既可以取代細(xì)胞質(zhì)膜周圍的水分子，又避免“溶質(zhì)效應(yīng)”；③合適的冷凍速率。將胚胎在含20%小妞血清的PBS溶液中清洗兩次將洗滌過的胚胎在室溫條件下加入含1.4mol|L甘油和20%小牛血清的PBS的冷凍液中平衡10min將胚胎專一到含有10%甘油+20%小牛血清的PBS溶液中，立即轉(zhuǎn)入胚胎冷凍習(xí)慣將習(xí)慣在液氮冠頸部預(yù)冷5min后投入液氮中保存解凍時將液氮中取出細(xì)管，在空氣中平衡7s，迅速