最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件

基因工程32大腸桿菌克隆載體基因工程32大腸桿菌克隆載體1所有克隆質(zhì)粒中，最多的一類是以大腸桿菌為宿主的。因為：過去50年內(nèi)，這種細(xì)菌在基礎(chǔ)研究中一直扮演著中心角色；已積累大量有關(guān)大腸桿菌的微生物學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)知識；事實上所有關(guān)于基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)研究都是以大腸桿菌為材料而開展的。所有克隆質(zhì)粒中，最多的一類是以大腸桿菌為宿主的。2最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件3最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件4最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件5最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件6最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件7最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件83.1.3pBR322的家譜pBR322作為一個克隆載體的方便性決非偶然，它在被設(shè)計時就定好了要擁有這些特點。構(gòu)建pBR322的步驟簡述如圖。它的構(gòu)建是一件曲折而艱巨的操作，用到了全部巧妙的基因操作技術(shù)。pBR322實際上由3個在自然界存在的天然質(zhì)粒拼接而成。3.1.3pBR322的家譜pBR322作為一個克隆載體9最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件103.1.4其他大腸桿菌質(zhì)粒克隆載體pBR322質(zhì)粒是在20世紀(jì)70年代后期被構(gòu)建出來的，第一份描述它的用途的論文在1977發(fā)表。從那以后，人們構(gòu)建了大量其他的質(zhì)?？寺≥d體，它們大多數(shù)只是對pBR322作了少量修改。3.1.4其他大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體pBR322質(zhì)粒是在211pBR327—一個高拷貝數(shù)質(zhì)粒pBR327通過從pBR322中移除一個長1089bp的片段而構(gòu)建。片段的刪除并沒有損傷ampR和terR這兩個抗性基因，但改變了質(zhì)粒的復(fù)制能力和接合能力。pBR327與pBR322有兩點重要的不同

(1)pBR327的拷貝數(shù)比pBR322更高。每個大腸桿菌中可以存在30-45個質(zhì)粒分子。當(dāng)實驗的目標(biāo)是研究被克隆的基因功能的時候，有更高拷貝數(shù)的pBR327就更適合于用作載體?？截悢?shù)越高，被克隆的基因在細(xì)胞中所產(chǎn)生的效果就越容易被發(fā)現(xiàn)。pBR327—一個高拷貝數(shù)質(zhì)粒pBR327通過從pBR32212(2)1089bp片段的刪除，破壞了pBR322的接合能力，使pBR327不能把自己轉(zhuǎn)移到另外一個大腸桿菌細(xì)胞中去。這一點對生物防范很重要，避免了粗心的生物學(xué)家使重組后的質(zhì)粒從試管和細(xì)菌植株中逸出。相反，pBR322在理論上可以通過結(jié)合而進(jìn)入天然的大腸桿菌細(xì)胞中去，雖然事實上pBR322也有一定的安全措施減少這種情況的發(fā)生。當(dāng)被克隆的基因有潛在的危害性時，應(yīng)優(yōu)先選擇pBR327。(2)1089bp片段的刪除，破壞了pBR322的接合能力13最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件14pUC8—乳糖選擇質(zhì)粒pUC8也是一個源自于pBR322的質(zhì)粒，只保留了pBR322的復(fù)制起點和ampR基因。ampR基因的核酸序列也被改變了，不再包含唯一的限制性酶切位點。所有這些位點被集中到pUC8所攜帶的lacZ'基因中的一小段序列上。

pUC8所擁有的3個優(yōu)點使它成為最受歡迎的大腸桿菌克隆載體之一。pUC8—乳糖選擇質(zhì)粒pUC8也是一個源自于pBR322的質(zhì)15最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件16第一個優(yōu)點人們在構(gòu)建這個質(zhì)粒時，在它的復(fù)制起點上產(chǎn)生了一個偶然的突變，使得它在大腸桿菌內(nèi)的拷貝數(shù)達(dá)到了500-700（擴增以前的數(shù)目）。這樣可以在轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌細(xì)胞中獲得大量的目的DNA。第二個優(yōu)點在于重組體的識別只需一步，僅僅只要把待篩選的大腸桿菌鋪板到含有氨芐青霉素和X-gal的瓊脂培養(yǎng)基上。而pBR322和pBR327，重組體的篩選都需要把菌落從一種抗生素培養(yǎng)基原樣轉(zhuǎn)移到另一種抗生素培養(yǎng)基平板。一個用pUC8做載體的克隆實驗比選擇pBR322和pBR327要節(jié)約一半的時間。第一個優(yōu)點17第三個優(yōu)點是pUC8擁有多克隆單酶切位點，這使有兩個不同黏性末端的DNA片段(比如一端是被EcoRI酶切過的，另一端是被BamHI酶切過的)可以直接被克隆，而不需求助于加入連接片段的操作。其他的pUC載體，擁有不同的限制性酶切位點，具有更大的靈活性，允許更多種不同的DNA片段被克隆。此外，這些載體中的限制性酶切位點與存在于M13mp系列載體中的限制性酶切位點一樣，可以很方便的進(jìn)行DNA測序或體外誘變。第三個優(yōu)點是pUC8擁有多克隆單酶切位點，18最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件19pGEM3Z—克隆DNA的體外轉(zhuǎn)錄pGEM3Z與pUC載體很相似：都含有ampR和lacZ‘基因，在后者上有一個限制性酶切位點，而且兩個質(zhì)粒有著差不多完全相同的大小。區(qū)別：pGEM3Z多兩個短片段，每一個片段都可以充當(dāng)啟動子，黏附RNA聚合酶。外源DNA在限制性酶切位點被導(dǎo)入pGEM3Z載體，在限制性酶切位點的兩邊分別存在著這兩個啟動子序列。這就意味著，在試管里同時放入重組后的pGEM3Z質(zhì)粒和提純的RNA聚合酶，被克隆的DNA分子會指導(dǎo)合成相應(yīng)的RNA，發(fā)生轉(zhuǎn)錄。產(chǎn)生的RNA可用作雜交探針，也可用于研究RNA加工(如內(nèi)含子如何切除)，或是用于合成蛋白質(zhì)。pGEM3Z—克隆DNA的體外轉(zhuǎn)錄pGEM3Z與pUC載體很20最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件21被pGEM3Z和其他同類載體所攜帶的啟動子并不是被大腸桿菌RNA聚合酶識別的標(biāo)準(zhǔn)啟動子。實際上這些啟動子有的被T7噬菌體編碼的RNA聚合酶專一性識別，有的被SP6噬菌體編碼的RNA聚合酶專一性識別。當(dāng)大腸桿菌被其中某種噬菌體侵染時就合成這些RNA聚合酶，用以轉(zhuǎn)錄噬菌體基因。之所以在體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中選擇病毒RNA聚合酶，是因為它們有著相當(dāng)高的酶活，因此噬菌體基因一定能夠很快被轉(zhuǎn)錄出來，能夠在每分鐘合成1-2μgRNA，比標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌RNA聚合酶高效得多。被pGEM3Z和其他同類載體所攜帶的啟動子并不是被大腸桿菌R223.2基于M3噬菌體的克隆載體對任何克隆載體而言，最基本的要求是能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制。質(zhì)粒載體很容易滿足這個要求首先它有一個短的DNA序列能夠充當(dāng)復(fù)制起點，并且它復(fù)制所需要的酶也可以全部或大部分從宿主細(xì)胞獲得。精密的構(gòu)建操作，使最終形成的質(zhì)粒載體如pBR322成為一個完整而具備功能的復(fù)制子。3.2基于M3噬菌體的克隆載體對任何克隆載體而言，最基本23噬菌體，如M13的復(fù)制情況就較為復(fù)雜。噬菌體的DNA分子通常帶有幾個為復(fù)制所必需的基因，包括編碼噬菌體蛋白外殼的組分的基因和編碼噬菌體特有的復(fù)制酶的基因。改變或是刪除這些必需基因中的任一個，都會損傷或是毀壞噬菌體的復(fù)制能力。因此可供改變噬菌體DNA分子的自由度很小，而通常的噬菌體載體與原始分子的差別很小。噬菌體，如M13的復(fù)制情況就較為復(fù)雜。24以M13噬菌體為例，可以看出構(gòu)建噬菌體克隆載體的難度。一個正常的M13噬菌體的基因組是6.4kb，為緊緊擠在一起的10個基因所占據(jù)，每一個基因?qū)κ删w的復(fù)制都是必需的。在基因間只有一個僅長507bp的短序列，新的DNA必須從這里插入才不會損傷其他基因，還必須保證同樣處在這個短序列中的復(fù)制起點不被破壞。所以，只有一個很小的空間用于改造M13噬菌體。然而，M13有一個很吸引人的優(yōu)點：它使人們可以獲得單鏈的被克隆DNA。以M13噬菌體為例，可以看出構(gòu)建噬菌體克隆載體的難度。25最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件26最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件273.2.1M13mp2克隆載體的開發(fā)構(gòu)建M13克隆載體第一步，是把lacZ'基因?qū)氲绞删wM13的短序列中。產(chǎn)生了M13mpl，它在含有X-gal的瓊脂板上形成藍(lán)色的噬菌斑。M13mpl的lacZ'基因上不含有任何的限制性酶切位點，但在靠近基因起始位置的地方有一個GGATTC的序列。改變一個核苷酸就變成GAATTC，這是EcoRI的識別位點。這個改變是用體外誘變完成的，產(chǎn)生了M13mp2克隆載體。3.2.1M13mp2克隆載體的開發(fā)構(gòu)建M13克隆載體第28M13mp2有一個稍稍改變的lacZ'基因(第六個密碼子編碼天冬氨酰而不是天冬氨酸)，但轉(zhuǎn)染了M13mp2的細(xì)胞產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶仍然有著正常的功能。M13mp2是最簡單的M13克隆載體。有EcoRI黏性末端的DNA片段可以插入進(jìn)克隆位點，重組體可以通過在X-gal培養(yǎng)基上的噬菌斑得到識別。M13mp2有一個稍稍改變的lacZ'基因(第六個密碼子編碼29最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件303.2.2M13mp7—對稱的克隆位點開發(fā)M13克隆載體的下一步是在lacZ'基因上添加額外的酶切位點。通過在試管中合成一個叫做多接頭(polylinker)的寡核苷酸而實現(xiàn)。多接頭包含一系列的限制性酶切位點，有一個EcoRI的黏性末端。多接頭被插入到M13mp2克隆載體的EcoRI位點上，形成了一個更加復(fù)雜的載體，即M13mp7。3.2.2M13mp7—對稱的克隆位點開發(fā)M13克隆載體31M13mp7有4個可能的克隆位點：

EcoRI，BamHI，SalI和PstI。為了不完全破壞掉lacZ‘基因，在設(shè)計這個多接頭時，人們使得讀碼框在通過多接頭后沒發(fā)生改變。這樣，產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶雖然被改變了序列，但仍然有著正常的功能。

M13mp7有4個可能的克隆位點：32最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件33用EcoRI，BamHI，SalI中的任意一種去酶解M13mp7，整個多接頭或其一部分會被切掉。在其他DNA存在下，有3種連接可能發(fā)生：(1)插入的新DNA，(2)插入的多接頭。(3)載體自連。用EcoRI，BamHI，SalI中的任意一種去酶解M13m34新DNA的插入會阻礙β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生，因此重組體在含X-gal的瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生無色透明的噬菌斑。當(dāng)插入的片段是多接頭時，原來的M13mp7載體又再次形成了，噬茵斑是藍(lán)色的。如果是載體自連，噬菌斑應(yīng)該是什么顏色?多接頭又一次顯示其巧妙設(shè)計：不管用哪一個內(nèi)切酶酶解，自連的載體都會連成有功能的lacZ'基因，最終形成藍(lán)色的噬菌斑。因此，只有重組體產(chǎn)生無色透明的噬茵斑。新DNA的插入會阻礙β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生，因此重組體在含X-35最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件36由于攜帶對稱的克隆位點，無論新的DNA是通過BamHI，SalI或PstI中的哪一個酶切位點插入載體，都可以用EcoRI從重組后的分子中切除。由于攜帶對稱的克隆位點，無論新的DNA是通過BamHI，Sa37最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件383.2.3更復(fù)雜的M13載體越精巧的M13載體有更復(fù)雜的多接頭被插入到lacZ'基因中。M13mp8：它是pUC8的對應(yīng)物。和pUC8一樣，它允許插入有不同的兩個黏性末端的DNA片段。M13mp8姐妹載體M13mp9有一個相同的多接頭，但是多接頭的方向相反，這使得它有另外一個優(yōu)點。當(dāng)把一個DNA片段克隆進(jìn)M13mp8后，可以用兩種限制性內(nèi)切酶把它再切下來，然后把它連入M13mp9，那么這片段在載體中就有了相反的方向。3.2.3更復(fù)雜的M13載體越精巧的M13載體有更復(fù)雜的39這個特點在DNA測序中很重要，因為核苷酸序列從多接頭的末端一直讀進(jìn)插入的DNA片段。通常從測序?qū)嶒炛兄荒茏x出約600個堿基，如果插入的DNA超過這個長度，就有一個末端的序列讀不出來。一種解決的方法就是把DNA換個方向，再插入到姐妹載體中。用這個新得到的克隆，測序?qū)嶒灳涂梢缘玫搅硪欢说男蛄?。這個特點在DNA測序中很重要，因為核苷酸序列從多接頭的末端一40最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件41還有其他的M13載體可成對選擇使用。與M13mp8/9很相似的有：M13mplO/11；M13mpl8/19；但是它們有不同的多接頭，即，有不同的限制性酶切位點。還有其他的M13載體可成對選擇使用。423.2.4M13和質(zhì)粒的雜交載體盡管M13可以產(chǎn)生單鏈DNA，這使它顯得非常有用，但它有很大一個缺點。用M13作載體時，可以容納的DNA片段大小非常有限，通常認(rèn)為100bp是上限，特殊情況下克隆的片段長度可達(dá)1kb。為了解決這個問題，人們把M13基因組的一部分和質(zhì)粒DNA結(jié)合在一起，構(gòu)建了一種新型的載體，叫做噬菌體質(zhì)粒(plagemids)。3.2.4M13和質(zhì)粒的雜交載體盡管M13可以產(chǎn)生單鏈D43pEMBL8是一個噬菌體質(zhì)粒：通過把M13基因組中一個1300bp的片段導(dǎo)入pUC8中而構(gòu)建。M13在形成被分泌的噬菌體顆粒前有一種酶使雙鏈DNA變成單鏈DNA，而被導(dǎo)入的那一段M13DNA則含有被這種酶識別的信號序列。雖然這段序列從M13的基因組中被分離出來，但功能仍然還在。所以，pEMBL8也可以被轉(zhuǎn)化成單鏈的DNA，并能以有缺陷的噬菌體顆粒的形式被分泌出來。用作pEMBL8克隆實驗的宿主大腸桿菌必須隨后被正常的M13噬菌體感染。正常的M13噬菌體是作為輔助噬菌體(helperphage)，提供必要的復(fù)制酶和蛋白質(zhì)外殼。pEMBL8是一個噬菌體質(zhì)粒：44pEMBL8由于是從pUC8發(fā)展來的，同樣也有插入多接頭的lacZ’基因，重組體可以通過在含有X-gal的培養(yǎng)基上的噬菌斑而被鑒定出來?？梢杂胮EMBL8產(chǎn)生長度達(dá)到10kb的單鏈DNA片段，這極大地擴展了M13克隆系統(tǒng)的使用范圍。pEMBL8由于是從pUC8發(fā)展來的，同樣也有插入多接頭的l45最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件463.3基于λ噬菌體的克隆載體基于λ噬菌體構(gòu)建克隆載體時，必須解決兩個難題：(1)λ噬菌體的DNA分子僅能再增加5％，即新增加的DNA長度不能超過3kb。一旦DNA的總長超過了52kb，不能包裝進(jìn)入噬菌體的頭部，也就不能形成感染性的病毒顆粒。這嚴(yán)重制約了插入DNA片段的長度，限制了λ噬菌體載體的使用。(2)λ噬菌體基因組很大，對于幾乎每一種限制性內(nèi)切酶識別位點都不是單一的。所以，無法按我們的需要去酶切和按順序重新裝成有功能的基因組。3.3基于λ噬菌體的克隆載體基于λ噬菌體構(gòu)建克隆載體時，47最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件483.3.1從λ噬菌體基因組移除部分片段而不損傷其生存能力發(fā)現(xiàn)：一個大的DNA片段可以刪除。該片段位于λDNA的中部，刪除后并不影響噬菌體侵染大腸桿菌的能力。去掉這個非必需片段，可以減小15kb。即，可以在噬菌體包裝前加入18kb的外源DNA。這一段非必需片段實際上包含一些基因，它們和λ噬菌體整合與脫離大腸桿菌染色體相關(guān)。刪除掉這一部分，λ噬菌體成為一個非溶源性的噬菌體，進(jìn)行裂解循環(huán)。這樣無需誘導(dǎo)就可以形成噬菌斑，這對于一個克隆載體來說本身就是一個理想的特點。3.3.1從λ噬菌體基因組移除部分片段而不損傷其生存能力49最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件503.3.2用自然選擇來篩選那些缺少酶切位點的λ噬菌體即使從λ噬菌體基因組中移掉那個大片段，對于大多數(shù)內(nèi)切酶來說還是有太多的識別位點。如果僅僅要移除一兩個這樣的識別位點，我們可以通過體外突變來解決。例如，想要去掉一個EcoRI的位點GAATTC，可以把它突變成GGATTC，不會被EcoRI切開。但是，即使現(xiàn)在，要想改變一個DNA分子上的好幾個位點，體外突變?nèi)圆皇且粋€有效方法。3.3.2用自然選擇來篩選那些缺少酶切位點的λ噬菌體即使51實際上，可以用自然選擇來選出那些缺少不需要的酶切位點的λ噬菌體。選用可以產(chǎn)生EcoRI的大腸桿菌做寄主，這樣大多數(shù)的噬菌體DNA就被酶解掉了，但有少量的幸存者并產(chǎn)生了噬菌斑。這些突變λ噬菌體缺少一個或者好幾個EcoRI識別位點。幾個這樣的感染循環(huán)過后，得到的λ噬菌體是缺失全部或大多數(shù)EcoRI位點的突變體。實際上，可以用自然選擇來選出那些缺少不需要的酶切位點的λ噬菌52最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件533.3.3插入載體和置換載體解決包裝限制和多酶切位點的問題后，就可以著手開發(fā)各種基于λ噬菌體的克隆載體。最先產(chǎn)生的兩類載體:λ插入載體(insertion)λ置換載體(替換載體)(replacement)3.3.3插入載體和置換載體解決包裝限制和多酶切位點的問54插入載體插入載體的構(gòu)建過程：去掉一大段非必需片段，剩下的兩段再連接起來。為了順利地插入新的DNA，一個插入載體必須至少包含一個單酶切位點。插入的DNA片段的長度依賴于刪除掉的非必需片段的長度。插入載體插入載體的構(gòu)建過程：55兩個常用的插入載體：(1)λgtl0可以插入超過8kb的外源DNA。外源DNA通過EcoRI單酶切位點插入cI基因，并使該基因失活，使得重組體的噬菌斑是清澈的而不是混濁的。(2)λZAPⅡ可以插入超過10kb的外源DNA。攜帶的lacZ‘基因上有一個多接頭，外源基因插入到這個多接頭上6個酶切位點中的任何一個，都會使該基因失活，從而使重組體的噬菌斑是無色清澈的而不是藍(lán)色的。兩個常用的插入載體：56最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件57置換載體一個λ置換載體有克隆所需限制性內(nèi)切酶識別的兩個位點，而在這兩個位點之間的DNA片段將會被外源的DNA所置換。通常被置換的那段DNA（克隆術(shù)語中稱為填充片段）含有其他的一些限制性酶切位點，可被切成許多小片段，因此在克隆實驗中它重新被插入的可能性相當(dāng)小。置換載體可攜帶的DNA片段長度通常超過插入載體。重組體的篩選往往基于它的大小：沒有重組的載體因為太小而不能被包裝進(jìn)入λ噬菌體的頭部。置換載體一個λ置換載體有克隆所需限制性內(nèi)切酶識別的兩個位點，58最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件59兩個常用的置換載體：(1)λEMBL4可以攜帶超過20kb的外源DNA。在填充片段的兩邊有成對的EcoRI，BamHI和SalI的酶切位點。用這3種酶中的任意一種進(jìn)行酶切都可以除去填充片段，所以可以支持有不同黏性末端的DNA。重組體的篩選可以基于它的大小，也可以應(yīng)用Spi表型。兩個常用的置換載體：60最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件61(2)λGEM11和λGEMl2都可以攜帶23kb的外源DNA（接近理論上的最大值）。在填充片段的兩邊各有一個多接頭，含有7個不同的限制性酶切位點。這兩個載體多接頭略有不同，但最外面的一個都是SfiI酶切位點(GGCCNNNNNGGCC)。這個序列極其罕見，不太可能出現(xiàn)在被克隆的DNA片段中。因此可以用SfiI把克隆后的DNA片段完整地切下來。和λEMBL4相似，可以根據(jù)大小和Spi表型篩選重組體。(2)λGEM11和λGEMl262最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件63最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件643.3.4用λ插入載體或置換載體

進(jìn)行克隆實驗用λ噬菌體載體進(jìn)行克隆和用質(zhì)粒載體相似：限制性酶酶切載體，加入新的DNA，連接混合物，產(chǎn)物分子轉(zhuǎn)染大腸桿菌。

這種實驗需要把載體通過cos位點由氫鍵連接，以環(huán)狀分子形式存在。這種轉(zhuǎn)染的方法在大多數(shù)情況下令人滿意，但效率不高。如果增加一兩步操作，可以獲得更多的重組體。3.3.4用λ插入載體或置換載體

進(jìn)行克隆實驗用λ噬菌體65首先，要使用λ噬菌體載體的線狀分子。當(dāng)線狀分子被相應(yīng)的酶酶切后，便形成了左右兩個相互分離的片段。連接被克隆的DNA和載體的左右兩個片段，連接的結(jié)果可能有好幾種不同的排列，其中包含一些由重復(fù)序列組成的連環(huán)體，重復(fù)的單位是：λ載體的左片段—被克隆的DNA—λ載體的右片段。如果被插入的DNA是正確的大小，那么分隔這些重復(fù)序列的cos相隔正確的距離，能夠用于體外包裝。產(chǎn)生重組后的噬菌體可以感染大腸桿菌。用這種方法，經(jīng)過體外包裝，可以獲得大量的重組分子。首先，要使用λ噬菌體載體的線狀分子。66最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件673.3.5用黏端質(zhì)粒對大的

DNA片段進(jìn)行克隆基于λ噬菌體的克隆載體中，最復(fù)雜的形式是黏端質(zhì)粒。黏端質(zhì)粒是噬菌體DNA和大腸桿菌質(zhì)粒兩者的雜交體。設(shè)計的基礎(chǔ)：把噬菌體DNA裝進(jìn)噬菌體頭部的酶，僅僅只需要被包裝的分子擁有cos位點就能夠發(fā)揮作用。在體外包裝系統(tǒng)中除了λ基因組外，任何長度在37kb和52kb之間的DNA分子，只要兩端含有cos位點，就能被包裝進(jìn)噬菌體頭部。3.3.5用黏端質(zhì)粒對大的

DNA片段進(jìn)行克隆基于λ噬菌體68最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件69黏端質(zhì)粒基本上算是一個攜帶cos位點的質(zhì)粒。因為它缺少所有的λ噬菌體基因且不能產(chǎn)生噬菌斑，因此它需要有其他的篩選標(biāo)記，如氨芐青霉素耐藥性基因，也要有質(zhì)粒復(fù)制起點。采用黏端質(zhì)粒的克隆實驗步驟如下:從單酶切位點切開黏端質(zhì)粒;加入新的DNA片段(這些片段通常是不完全酶切的產(chǎn)物，完全酶切后產(chǎn)生的片段對于黏端質(zhì)粒來說太小了);進(jìn)行連接反應(yīng)，形成連環(huán)體。

黏端質(zhì)?；旧纤闶且粋€攜帶cos位點的質(zhì)粒。70如果插入的DNA大小合適，體外包裝系統(tǒng)從cos位點切開連環(huán)體，把重組后的黏端質(zhì)粒包裝進(jìn)成熟的噬菌體顆粒。用這些λ噬菌體去感染大腸桿菌，但不會產(chǎn)生噬菌斑，把感染后的大腸桿菌培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基平板上，只有那些有抗生素抗性的菌落才能生長。所有的菌落都是重組體，因為那些沒有重組的線性的黏端質(zhì)粒太小，根本不可能被包裝進(jìn)噬菌體頭部。如果插入的DNA大小合適，體外包裝系統(tǒng)從cos位點切開連環(huán)體71最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件723.4λ載體和其他高容量的載體

使基因組文庫得以建立基于λ噬菌體的載體的主要用途是克隆那些不能被質(zhì)?；騇13載體所操作的DNA大片段。插入的外源DNA片段：M13載體：不超過3kb質(zhì)粒：不超過8kb置換載體λEMBL4：達(dá)到20kb某些黏端質(zhì)粒：40kb。3.4λ載體和其他高容量的載體

使基因組文庫得以建立基于73這種可以克隆如此之大的DNA片段的能力，使得人們可以建立基因組文庫?；蚪M文庫：一套覆蓋某個生物體所有DNA的重組體克隆。例如，一個大腸桿菌的基因組文庫，包含所有的大腸桿菌基因。據(jù)此，可以抽提出任何我們所感興趣的基因加以研究。基因組文庫可以保存很多年，也可以很容易在研究組織間相互傳播。這種可以克隆如此之大的DNA片段的能力，使得人們可以建立基因74當(dāng)要建立基因組文庫時，面臨一個重要的問題：一個基因組文庫到底需要多少個克隆?可以用下面的公式計算：N=ln(1-P)／ln(1-a／b)N指所需要的克隆的個數(shù)，P是得到所有基因的可能性，a是插入到載體中去的DNA片段的平均大小，b是基因組的大小。當(dāng)要建立基因組文庫時，面臨一個重要的問題：一個基因組文庫到底75最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件76從幾十萬個克隆中一個個篩選出感興趣的基因是不明智的。減少克隆數(shù)的方法：方法一：開發(fā)能夠攜帶更大DNA片段的克隆載體。細(xì)菌人工染色體（BACs）：基于F質(zhì)粒構(gòu)建的新載體。F質(zhì)粒相對較大，由它開發(fā)的載體有著比普通質(zhì)粒載體大很多的容量。BAC能夠插入超過300kb的DNA片段，由此使人類基因組文庫的克隆數(shù)下降到30000個。從幾十萬個克隆中一個個篩選出感興趣的基因是不明智的。77基于噬菌體P1發(fā)展而來的載體

P1優(yōu)于λ的地方：能夠在它的蛋白質(zhì)外殼中擠進(jìn)110kb的DNA?；谑删wP1設(shè)計的黏端質(zhì)?？梢杂糜诳寺￠L度從75kb到100kb的DNA。還有一種載體，結(jié)合了P1載體和BAC的特點，稱為由P1衍生的人工染色體(P1-derivedartificialchromosome，PAC)，同樣也擁有超過300kb的容量?；谑删wP1發(fā)展而來的載體783.5其他細(xì)菌的克隆載體人們還開發(fā)了為其他一些細(xì)菌服務(wù)的載體。這些載體中，有的只對特定宿主有效的質(zhì)粒載體；有的是能夠在許多宿主中復(fù)制的廣譜宿主質(zhì)粒；還有少數(shù)幾個是從噬菌體開發(fā)出來的克隆載體。大多數(shù)這些載體的性質(zhì)和用法都和大腸桿菌的載體很相似。3.5其他細(xì)菌的克隆載體人們還開發(fā)了為其他一些細(xì)菌服務(wù)的79

結(jié)束語謝謝大家聆聽！?。?0

結(jié)束語謝謝大家聆聽?。?！80基因工程32大腸桿菌克隆載體基因工程32大腸桿菌克隆載體81所有克隆質(zhì)粒中，最多的一類是以大腸桿菌為宿主的。因為：過去50年內(nèi)，這種細(xì)菌在基礎(chǔ)研究中一直扮演著中心角色；已積累大量有關(guān)大腸桿菌的微生物學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)知識；事實上所有關(guān)于基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)研究都是以大腸桿菌為材料而開展的。所有克隆質(zhì)粒中，最多的一類是以大腸桿菌為宿主的。82最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件83最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件84最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件85最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件86最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件87最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件883.1.3pBR322的家譜pBR322作為一個克隆載體的方便性決非偶然，它在被設(shè)計時就定好了要擁有這些特點。構(gòu)建pBR322的步驟簡述如圖。它的構(gòu)建是一件曲折而艱巨的操作，用到了全部巧妙的基因操作技術(shù)。pBR322實際上由3個在自然界存在的天然質(zhì)粒拼接而成。3.1.3pBR322的家譜pBR322作為一個克隆載體89最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件903.1.4其他大腸桿菌質(zhì)粒克隆載體pBR322質(zhì)粒是在20世紀(jì)70年代后期被構(gòu)建出來的，第一份描述它的用途的論文在1977發(fā)表。從那以后，人們構(gòu)建了大量其他的質(zhì)粒克隆載體，它們大多數(shù)只是對pBR322作了少量修改。3.1.4其他大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體pBR322質(zhì)粒是在291pBR327—一個高拷貝數(shù)質(zhì)粒pBR327通過從pBR322中移除一個長1089bp的片段而構(gòu)建。片段的刪除并沒有損傷ampR和terR這兩個抗性基因，但改變了質(zhì)粒的復(fù)制能力和接合能力。pBR327與pBR322有兩點重要的不同

(1)pBR327的拷貝數(shù)比pBR322更高。每個大腸桿菌中可以存在30-45個質(zhì)粒分子。當(dāng)實驗的目標(biāo)是研究被克隆的基因功能的時候，有更高拷貝數(shù)的pBR327就更適合于用作載體。拷貝數(shù)越高，被克隆的基因在細(xì)胞中所產(chǎn)生的效果就越容易被發(fā)現(xiàn)。pBR327—一個高拷貝數(shù)質(zhì)粒pBR327通過從pBR32292(2)1089bp片段的刪除，破壞了pBR322的接合能力，使pBR327不能把自己轉(zhuǎn)移到另外一個大腸桿菌細(xì)胞中去。這一點對生物防范很重要，避免了粗心的生物學(xué)家使重組后的質(zhì)粒從試管和細(xì)菌植株中逸出。相反，pBR322在理論上可以通過結(jié)合而進(jìn)入天然的大腸桿菌細(xì)胞中去，雖然事實上pBR322也有一定的安全措施減少這種情況的發(fā)生。當(dāng)被克隆的基因有潛在的危害性時，應(yīng)優(yōu)先選擇pBR327。(2)1089bp片段的刪除，破壞了pBR322的接合能力93最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件94pUC8—乳糖選擇質(zhì)粒pUC8也是一個源自于pBR322的質(zhì)粒，只保留了pBR322的復(fù)制起點和ampR基因。ampR基因的核酸序列也被改變了，不再包含唯一的限制性酶切位點。所有這些位點被集中到pUC8所攜帶的lacZ'基因中的一小段序列上。

pUC8所擁有的3個優(yōu)點使它成為最受歡迎的大腸桿菌克隆載體之一。pUC8—乳糖選擇質(zhì)粒pUC8也是一個源自于pBR322的質(zhì)95最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件96第一個優(yōu)點人們在構(gòu)建這個質(zhì)粒時，在它的復(fù)制起點上產(chǎn)生了一個偶然的突變，使得它在大腸桿菌內(nèi)的拷貝數(shù)達(dá)到了500-700（擴增以前的數(shù)目）。這樣可以在轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌細(xì)胞中獲得大量的目的DNA。第二個優(yōu)點在于重組體的識別只需一步，僅僅只要把待篩選的大腸桿菌鋪板到含有氨芐青霉素和X-gal的瓊脂培養(yǎng)基上。而pBR322和pBR327，重組體的篩選都需要把菌落從一種抗生素培養(yǎng)基原樣轉(zhuǎn)移到另一種抗生素培養(yǎng)基平板。一個用pUC8做載體的克隆實驗比選擇pBR322和pBR327要節(jié)約一半的時間。第一個優(yōu)點97第三個優(yōu)點是pUC8擁有多克隆單酶切位點，這使有兩個不同黏性末端的DNA片段(比如一端是被EcoRI酶切過的，另一端是被BamHI酶切過的)可以直接被克隆，而不需求助于加入連接片段的操作。其他的pUC載體，擁有不同的限制性酶切位點，具有更大的靈活性，允許更多種不同的DNA片段被克隆。此外，這些載體中的限制性酶切位點與存在于M13mp系列載體中的限制性酶切位點一樣，可以很方便的進(jìn)行DNA測序或體外誘變。第三個優(yōu)點是pUC8擁有多克隆單酶切位點，98最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件99pGEM3Z—克隆DNA的體外轉(zhuǎn)錄pGEM3Z與pUC載體很相似：都含有ampR和lacZ‘基因，在后者上有一個限制性酶切位點，而且兩個質(zhì)粒有著差不多完全相同的大小。區(qū)別：pGEM3Z多兩個短片段，每一個片段都可以充當(dāng)啟動子，黏附RNA聚合酶。外源DNA在限制性酶切位點被導(dǎo)入pGEM3Z載體，在限制性酶切位點的兩邊分別存在著這兩個啟動子序列。這就意味著，在試管里同時放入重組后的pGEM3Z質(zhì)粒和提純的RNA聚合酶，被克隆的DNA分子會指導(dǎo)合成相應(yīng)的RNA，發(fā)生轉(zhuǎn)錄。產(chǎn)生的RNA可用作雜交探針，也可用于研究RNA加工(如內(nèi)含子如何切除)，或是用于合成蛋白質(zhì)。pGEM3Z—克隆DNA的體外轉(zhuǎn)錄pGEM3Z與pUC載體很100最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件101被pGEM3Z和其他同類載體所攜帶的啟動子并不是被大腸桿菌RNA聚合酶識別的標(biāo)準(zhǔn)啟動子。實際上這些啟動子有的被T7噬菌體編碼的RNA聚合酶專一性識別，有的被SP6噬菌體編碼的RNA聚合酶專一性識別。當(dāng)大腸桿菌被其中某種噬菌體侵染時就合成這些RNA聚合酶，用以轉(zhuǎn)錄噬菌體基因。之所以在體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中選擇病毒RNA聚合酶，是因為它們有著相當(dāng)高的酶活，因此噬菌體基因一定能夠很快被轉(zhuǎn)錄出來，能夠在每分鐘合成1-2μgRNA，比標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌RNA聚合酶高效得多。被pGEM3Z和其他同類載體所攜帶的啟動子并不是被大腸桿菌R1023.2基于M3噬菌體的克隆載體對任何克隆載體而言，最基本的要求是能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制。質(zhì)粒載體很容易滿足這個要求首先它有一個短的DNA序列能夠充當(dāng)復(fù)制起點，并且它復(fù)制所需要的酶也可以全部或大部分從宿主細(xì)胞獲得。精密的構(gòu)建操作，使最終形成的質(zhì)粒載體如pBR322成為一個完整而具備功能的復(fù)制子。3.2基于M3噬菌體的克隆載體對任何克隆載體而言，最基本103噬菌體，如M13的復(fù)制情況就較為復(fù)雜。噬菌體的DNA分子通常帶有幾個為復(fù)制所必需的基因，包括編碼噬菌體蛋白外殼的組分的基因和編碼噬菌體特有的復(fù)制酶的基因。改變或是刪除這些必需基因中的任一個，都會損傷或是毀壞噬菌體的復(fù)制能力。因此可供改變噬菌體DNA分子的自由度很小，而通常的噬菌體載體與原始分子的差別很小。噬菌體，如M13的復(fù)制情況就較為復(fù)雜。104以M13噬菌體為例，可以看出構(gòu)建噬菌體克隆載體的難度。一個正常的M13噬菌體的基因組是6.4kb，為緊緊擠在一起的10個基因所占據(jù)，每一個基因?qū)κ删w的復(fù)制都是必需的。在基因間只有一個僅長507bp的短序列，新的DNA必須從這里插入才不會損傷其他基因，還必須保證同樣處在這個短序列中的復(fù)制起點不被破壞。所以，只有一個很小的空間用于改造M13噬菌體。然而，M13有一個很吸引人的優(yōu)點：它使人們可以獲得單鏈的被克隆DNA。以M13噬菌體為例，可以看出構(gòu)建噬菌體克隆載體的難度。105最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件106最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件1073.2.1M13mp2克隆載體的開發(fā)構(gòu)建M13克隆載體第一步，是把lacZ'基因?qū)氲绞删wM13的短序列中。產(chǎn)生了M13mpl，它在含有X-gal的瓊脂板上形成藍(lán)色的噬菌斑。M13mpl的lacZ'基因上不含有任何的限制性酶切位點，但在靠近基因起始位置的地方有一個GGATTC的序列。改變一個核苷酸就變成GAATTC，這是EcoRI的識別位點。這個改變是用體外誘變完成的，產(chǎn)生了M13mp2克隆載體。3.2.1M13mp2克隆載體的開發(fā)構(gòu)建M13克隆載體第108M13mp2有一個稍稍改變的lacZ'基因(第六個密碼子編碼天冬氨酰而不是天冬氨酸)，但轉(zhuǎn)染了M13mp2的細(xì)胞產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶仍然有著正常的功能。M13mp2是最簡單的M13克隆載體。有EcoRI黏性末端的DNA片段可以插入進(jìn)克隆位點，重組體可以通過在X-gal培養(yǎng)基上的噬菌斑得到識別。M13mp2有一個稍稍改變的lacZ'基因(第六個密碼子編碼109最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件1103.2.2M13mp7—對稱的克隆位點開發(fā)M13克隆載體的下一步是在lacZ'基因上添加額外的酶切位點。通過在試管中合成一個叫做多接頭(polylinker)的寡核苷酸而實現(xiàn)。多接頭包含一系列的限制性酶切位點，有一個EcoRI的黏性末端。多接頭被插入到M13mp2克隆載體的EcoRI位點上，形成了一個更加復(fù)雜的載體，即M13mp7。3.2.2M13mp7—對稱的克隆位點開發(fā)M13克隆載體111M13mp7有4個可能的克隆位點：

EcoRI，BamHI，SalI和PstI。為了不完全破壞掉lacZ‘基因，在設(shè)計這個多接頭時，人們使得讀碼框在通過多接頭后沒發(fā)生改變。這樣，產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶雖然被改變了序列，但仍然有著正常的功能。

M13mp7有4個可能的克隆位點：112最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件113用EcoRI，BamHI，SalI中的任意一種去酶解M13mp7，整個多接頭或其一部分會被切掉。在其他DNA存在下，有3種連接可能發(fā)生：(1)插入的新DNA，(2)插入的多接頭。(3)載體自連。用EcoRI，BamHI，SalI中的任意一種去酶解M13m114新DNA的插入會阻礙β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生，因此重組體在含X-gal的瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生無色透明的噬菌斑。當(dāng)插入的片段是多接頭時，原來的M13mp7載體又再次形成了，噬茵斑是藍(lán)色的。如果是載體自連，噬菌斑應(yīng)該是什么顏色?多接頭又一次顯示其巧妙設(shè)計：不管用哪一個內(nèi)切酶酶解，自連的載體都會連成有功能的lacZ'基因，最終形成藍(lán)色的噬菌斑。因此，只有重組體產(chǎn)生無色透明的噬茵斑。新DNA的插入會阻礙β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生，因此重組體在含X-115最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件116由于攜帶對稱的克隆位點，無論新的DNA是通過BamHI，SalI或PstI中的哪一個酶切位點插入載體，都可以用EcoRI從重組后的分子中切除。由于攜帶對稱的克隆位點，無論新的DNA是通過BamHI，Sa117最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件1183.2.3更復(fù)雜的M13載體越精巧的M13載體有更復(fù)雜的多接頭被插入到lacZ'基因中。M13mp8：它是pUC8的對應(yīng)物。和pUC8一樣，它允許插入有不同的兩個黏性末端的DNA片段。M13mp8姐妹載體M13mp9有一個相同的多接頭，但是多接頭的方向相反，這使得它有另外一個優(yōu)點。當(dāng)把一個DNA片段克隆進(jìn)M13mp8后，可以用兩種限制性內(nèi)切酶把它再切下來，然后把它連入M13mp9，那么這片段在載體中就有了相反的方向。3.2.3更復(fù)雜的M13載體越精巧的M13載體有更復(fù)雜的119這個特點在DNA測序中很重要，因為核苷酸序列從多接頭的末端一直讀進(jìn)插入的DNA片段。通常從測序?qū)嶒炛兄荒茏x出約600個堿基，如果插入的DNA超過這個長度，就有一個末端的序列讀不出來。一種解決的方法就是把DNA換個方向，再插入到姐妹載體中。用這個新得到的克隆，測序?qū)嶒灳涂梢缘玫搅硪欢说男蛄?。這個特點在DNA測序中很重要，因為核苷酸序列從多接頭的末端一120最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件121還有其他的M13載體可成對選擇使用。與M13mp8/9很相似的有：M13mplO/11；M13mpl8/19；但是它們有不同的多接頭，即，有不同的限制性酶切位點。還有其他的M13載體可成對選擇使用。1223.2.4M13和質(zhì)粒的雜交載體盡管M13可以產(chǎn)生單鏈DNA，這使它顯得非常有用，但它有很大一個缺點。用M13作載體時，可以容納的DNA片段大小非常有限，通常認(rèn)為100bp是上限，特殊情況下克隆的片段長度可達(dá)1kb。為了解決這個問題，人們把M13基因組的一部分和質(zhì)粒DNA結(jié)合在一起，構(gòu)建了一種新型的載體，叫做噬菌體質(zhì)粒(plagemids)。3.2.4M13和質(zhì)粒的雜交載體盡管M13可以產(chǎn)生單鏈D123pEMBL8是一個噬菌體質(zhì)粒：通過把M13基因組中一個1300bp的片段導(dǎo)入pUC8中而構(gòu)建。M13在形成被分泌的噬菌體顆粒前有一種酶使雙鏈DNA變成單鏈DNA，而被導(dǎo)入的那一段M13DNA則含有被這種酶識別的信號序列。雖然這段序列從M13的基因組中被分離出來，但功能仍然還在。所以，pEMBL8也可以被轉(zhuǎn)化成單鏈的DNA，并能以有缺陷的噬菌體顆粒的形式被分泌出來。用作pEMBL8克隆實驗的宿主大腸桿菌必須隨后被正常的M13噬菌體感染。正常的M13噬菌體是作為輔助噬菌體(helperphage)，提供必要的復(fù)制酶和蛋白質(zhì)外殼。pEMBL8是一個噬菌體質(zhì)粒：124pEMBL8由于是從pUC8發(fā)展來的，同樣也有插入多接頭的lacZ’基因，重組體可以通過在含有X-gal的培養(yǎng)基上的噬菌斑而被鑒定出來?？梢杂胮EMBL8產(chǎn)生長度達(dá)到10kb的單鏈DNA片段，這極大地擴展了M13克隆系統(tǒng)的使用范圍。pEMBL8由于是從pUC8發(fā)展來的，同樣也有插入多接頭的l125最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件1263.3基于λ噬菌體的克隆載體基于λ噬菌體構(gòu)建克隆載體時，必須解決兩個難題：(1)λ噬菌體的DNA分子僅能再增加5％，即新增加的DNA長度不能超過3kb。一旦DNA的總長超過了52kb，不能包裝進(jìn)入噬菌體的頭部，也就不能形成感染性的病毒顆粒。這嚴(yán)重制約了插入DNA片段的長度，限制了λ噬菌體載體的使用。(2)λ噬菌體基因組很大，對于幾乎每一種限制性內(nèi)切酶識別位點都不是單一的。所以，無法按我們的需要去酶切和按順序重新裝成有功能的基因組。3.3基于λ噬菌體的克隆載體基于λ噬菌體構(gòu)建克隆載體時，127最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件1283.3.1從λ噬菌體基因組移除部分片段而不損傷其生存能力發(fā)現(xiàn)：一個大的DNA片段可以刪除。該片段位于λDNA的中部，刪除后并不影響噬菌體侵染大腸桿菌的能力。去掉這個非必需片段，可以減小15kb。即，可以在噬菌體包裝前加入18kb的外源DNA。這一段非必需片段實際上包含一些基因，它們和λ噬菌體整合與脫離大腸桿菌染色體相關(guān)。刪除掉這一部分，λ噬菌體成為一個非溶源性的噬菌體，進(jìn)行裂解循環(huán)。這樣無需誘導(dǎo)就可以形成噬菌斑，這對于一個克隆載體來說本身就是一個理想的特點。3.3.1從λ噬菌體基因組移除部分片段而不損傷其生存能力129最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件1303.3.2用自然選擇來篩選那些缺少酶切位點的λ噬菌體即使從λ噬菌體基因組中移掉那個大片段，對于大多數(shù)內(nèi)切酶來說還是有太多的識別位點。如果僅僅要移除一兩個這樣的識別位點，我們可以通過體外突變來解決。例如，想要去掉一個EcoRI的位點GAATTC，可以把它突變成GGATTC，不會被EcoRI切開。但是，即使現(xiàn)在，要想改變一個DNA分子上的好幾個位點，體外突變?nèi)圆皇且粋€有效方法。3.3.2用自然選擇來篩選那些缺少酶切位點的λ噬菌體即使131實際上，可以用自然選擇來選出那些缺少不需要的酶切位點的λ噬菌體。選用可以產(chǎn)生EcoRI的大腸桿菌做寄主，這樣大多數(shù)的噬菌體DNA就被酶解掉了，但有少量的幸存者并產(chǎn)生了噬菌斑。這些突變λ噬菌體缺少一個或者好幾個EcoRI識別位點。幾個這樣的感染循環(huán)過后，得到的λ噬菌體是缺失全部或大多數(shù)EcoRI位點的突變體。實際上，可以用自然選擇來選出那些缺少不需要的酶切位點的λ噬菌132最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件1333.3.3插入載體和置換載體解決包裝限制和多酶切位點的問題后，就可以著手開發(fā)各種基于λ噬菌體的克隆載體。最先產(chǎn)生的兩類載體:λ插入載體(insertion)λ置換載體(替換載體)(replacement)3.3.3插入載體和置換載體解決包裝限制和多酶切位點的問134插入載體插入載體的構(gòu)建過程：去掉一大段非必需片段，剩下的兩段再連接起來。為了順利地插入新的DNA，一個插入載體必須至少包含一個單酶切位點。插入的DNA片段的長度依賴于刪除掉的非必需片段的長度。插入載體插入載體的構(gòu)建過程：135兩個常用的插入載體：(1)λgtl0可以插入超過8kb的外源DNA。外源DNA通過EcoRI單酶切位點插入cI基因，并使該基因失活，使得重組體的噬菌斑是清澈的而不是混濁的。(2)λZAPⅡ可以插入超過10kb的外源DNA。攜帶的lacZ‘基因上有一個多接頭，外源基因插入到這個多接頭上6個酶切位點中的任何一個，都會使該基因失活，從而使重組體的噬菌斑是無色清澈的而不是藍(lán)色的。兩個常用的插入載體：136最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件137置換載體一個λ置換載體有克隆所需限制性內(nèi)切酶識別的兩個位點，而在這兩個位點之間的DNA片段將會被外源的DNA所置換。通常被置換的那段DNA（克隆術(shù)語中稱為填充片段）含有其他的一些限制性酶切位點，可被切成許多小片段，因此在克隆實驗中它重新被插入的可能性相當(dāng)小。置換載體可攜帶的DNA片段長度通常超過插入載體。重組體的篩選往往基于它的大?。簺]有重組的載體因為太小而不能被包裝進(jìn)入λ噬菌體的頭部。置換載體一個λ置換載體有克隆所需限制性內(nèi)切酶識別的兩個位點，138最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件139兩個常用的置換載體：(1)λEMBL4可以攜帶超過20kb的外源DNA。在填充片段的兩邊有成對的EcoRI，BamHI和SalI的酶切位點。用這3種酶中的任意一種進(jìn)行酶切都可以除去填充片段，所以可以支持有不同黏性末端的DNA。重組體的篩選可以基于它的大小，也可以應(yīng)用Spi表型。兩個常用的置換載體：140最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件141(2)λGEM11和λGEMl2都可以攜帶23kb的外源DNA（接近理論上的最大值）。在填充片段的兩邊各有一個多接頭，含有7個不同的限制性酶切位點。這兩個載體多接頭略有不同，但最外面的一個都是SfiI酶切位點(GGCCNNNNNGGCC)。這個序列極其罕見，不太可能出現(xiàn)在被克隆的DNA片段中。因此可以用SfiI把克隆后的DNA片段完整地切下來。和λEMBL4相似，可以根據(jù)大小和Spi表型篩選重組體。(2)λGEM11和λGEMl2142最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件143最新基因工程32大腸桿菌克隆載體課件1443.3.4用λ插入載體或置換載體

進(jìn)行克隆實驗用λ噬菌體載體進(jìn)行克隆和用質(zhì)粒載體相似：限制性酶酶切載體，加入新的DNA，連接混合物，產(chǎn)物分子轉(zhuǎn)染大腸桿菌。

這種實驗需要把載體通過cos位點由氫鍵連接，以環(huán)狀分子形式存在。這種轉(zhuǎn)染的方法在大多數(shù)情況下令人滿意，但效率不高。如果增加一兩步操作，可以獲得更多的重組體。3.3.4用λ插入載體或置換載體

進(jìn)行克隆實驗用λ噬菌體145首先，要使用λ噬菌體載體的線狀分子。當(dāng)線狀分子被相應(yīng)的酶酶切后，便形成了左