原核生物的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控

關(guān)于原核生物的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控第一頁，共六十頁，2022年，8月28日第二頁，共六十頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄

(

transcription

)——生物體以DNA為模板按5’3’方向合成RNA的過程轉(zhuǎn)錄RNADNA

第三頁，共六十頁，2022年，8月28日參

與

轉(zhuǎn)

錄

的

物

質(zhì)：原料:4種NTP

(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA

酶:RNA聚合酶其他蛋白質(zhì)因子第四頁，共六十頁，2022年，8月28日A.原核生物的轉(zhuǎn)錄一、轉(zhuǎn)錄概述二、轉(zhuǎn)錄的基本過程三、大腸桿菌RNA聚合酶四、轉(zhuǎn)錄的機(jī)制第五頁，共六十頁，2022年，8月28日一、轉(zhuǎn)錄概述第六頁，共六十頁，2022年，8月28日起始點

(startpoint)：合成第一個RNA堿基的位置，用“+1”表示。啟動子(promoter)：位于轉(zhuǎn)錄起始點前，和RNA聚合酶結(jié)合的一段DNA序列。終止子

(terminator)：使RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。轉(zhuǎn)錄單位

(transcriptionunit)：從啟動子到終止子間的一段DNA序列。基本術(shù)語：第七頁，共六十頁，2022年，8月28日上游序列：基因中起始點前面的序列，用

“-”

表示下游序列：在起始點后面的序列，用

“+”

表示初級轉(zhuǎn)錄本：剛轉(zhuǎn)錄完成的RNA產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄泡：RNA聚合酶與啟動子結(jié)合后形成的DNA解旋區(qū)。轉(zhuǎn)錄泡可和RNA聚合酶一起沿DNA鏈移動，RNA合成在轉(zhuǎn)錄泡內(nèi)進(jìn)行。基本術(shù)語：第八頁，共六十頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄泡的結(jié)構(gòu)當(dāng)RNA聚合酶沿DNA模板移動時，它打開泡前的DNA雙螺旋（在解鏈點打開），并在復(fù)鏈點使DNA復(fù)原。轉(zhuǎn)錄泡的長度隨增長反應(yīng)階段而異，在12-20bp之間(17bp)，但其中的RNA-DNA雜合雙螺旋區(qū)域比這個長度要短(12bp)。第九頁，共六十頁，2022年，8月28日二、轉(zhuǎn)錄的基本過程1.識別啟動子RNA聚合酶識別啟動子，并在啟動子處結(jié)合形成一個“轉(zhuǎn)錄泡”，轉(zhuǎn)錄泡內(nèi)的DNA雙鏈解開，為RNA合成提供模板。轉(zhuǎn)錄泡有義鏈模板鏈，反義鏈第十頁，共六十頁，2022年，8月28日2.轉(zhuǎn)錄起始a.轉(zhuǎn)錄起始無需引物。b.流產(chǎn)起始：轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個核苷酸短鏈的過程是通過啟動子階段，此時RNA聚合酶一直處于啟動子區(qū)域，新生RNA鏈與DNA模板鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重新開始，這一過程稱為流產(chǎn)起始。c.啟動子清除：一旦RNA聚合酶成功地合成9個以上核苷酸并離開啟動子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄就進(jìn)入正常的延伸階段，這一過程稱為啟動子清除。d.通過啟動子的時間代表一個啟動子的強(qiáng)弱，時間越短表明該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率越高。第十一頁，共六十頁，2022年，8月28日3.鏈的延伸RNA聚合酶沿DNA模板鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程。大腸桿菌RNA聚合酶的活性一般為每秒50-90個核苷酸。酶移動時局部解旋DNA；酶經(jīng)過之后，

DNA又重新形成雙螺旋。第十二頁，共六十頁，2022年，8月28日4.鏈的終止和釋放當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)成雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都從模板上釋放出來，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。第十三頁，共六十頁，2022年，8月28日三、大腸桿菌RNA聚合酶1.RNA聚合酶的功能a.RNA合成b.合成起始和終止位點的識別c.確定與DNA結(jié)合位點的結(jié)合與脫離的時間等第十四頁，共六十頁，2022年，8月28日核心酶

coreenzyme全酶

holoenzyme全酶至少含5個亞基：2、、’、，是轉(zhuǎn)錄起始所必需的。2、和’亞基組成核心酶，種間基本沒有變化；因子存在廣泛的種間變異，用于識別不同的啟動子。2.RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)第十五頁，共六十頁，2022年，8月28日2)

因子的功能：使RNA聚合酶特異性地與啟動子結(jié)合。大腸桿菌中最常見的因子是70核心酶不能區(qū)分DNA的啟動子和其它序列，它與DNA非選擇性結(jié)合形成松散型復(fù)合體。因子是通過將核心酶對非特異序列的親和力降低104倍，同時增加其對啟動子的親和力來幫助啟動子識別的。RNA鏈延伸至8-9nt時，因子會從RNA聚合酶中釋放出來，它可以再與其他核心酶結(jié)合重新起始轉(zhuǎn)錄。第十六頁，共六十頁，2022年，8月28日3.RNA聚合酶在細(xì)胞內(nèi)的分布形式1)很少有游離的核心酶和全酶2)細(xì)胞內(nèi)因子數(shù)量只有核心酶的30%，因此在任何時刻只有1/3的聚合酶能以全酶的形式存在。第十七頁，共六十頁，2022年，8月28日四、轉(zhuǎn)錄的機(jī)制1.啟動子識別和轉(zhuǎn)錄起始1)在RNA聚合酶開始鏈延長前，它與DNA的相互作用經(jīng)歷了4個階段：a.RNA聚合酶與處于堿基配對狀態(tài)的啟動子序列結(jié)合形成閉合復(fù)合物。b.DNA的初始解旋導(dǎo)致DNA與聚合酶形成開放復(fù)合物，這一過程稱為緊密結(jié)合。c.進(jìn)行多次流產(chǎn)起始d.起始成功后，聚合酶釋放因子，形成聚合酶-DNA-新生RNA的三聚復(fù)合物，RNA鏈開始延伸。第十八頁，共六十頁，2022年，8月28日RNApol是如何發(fā)現(xiàn)正確的起點而啟動基因轉(zhuǎn)錄的呢？第十九頁，共六十頁，2022年，8月28日1)啟動子的識別取決于共有序列保守性序列：每個啟動子都包括一個能被RNA聚合酶識別的特征DNA序列。共有序列：是根據(jù)保守性序列總結(jié)出的一種理想序列，它的每一個位置代表了很多實際序列中最經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的堿基。典型的啟動子有3個共有序列：-35序列、-10序列和起始點序列-35序列-10序列起始點TTGACATATAATAC－TG16-18bp5-8bp+1Pribnow框Sextama框第二十頁，共六十頁，2022年，8月28日細(xì)菌啟動子有４個保守性特征：轉(zhuǎn)錄起始點：開始堿基90%是嘌呤，G比A更常見。-10序列：起始點上游一個6bp區(qū)，這個六聚體的中心靠近起始點上游的第10堿基對，它的共有序列是TATAAT。-10序列是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點，是聚合酶啟動DNA解旋的序列。因此，-10序列可通過影響開放復(fù)合物的形成速度而控制轉(zhuǎn)錄。-35序列：也是一個六聚體，其中心位于-35堿基對處，它的共有序列是TTGACA，是RNA聚合酶的識別位點。-35和-10序列之間的距離十分重要，在90%的啟動子中變動在16和18個堿基之間，兩序列間為17bp時轉(zhuǎn)錄效率最高。-35序列-10序列起始點TTGACATATAATAC－TG16-18bp5-8bp+1第二十一頁，共六十頁，2022年，8月28日啟動子的突變影響它所控制的基因的轉(zhuǎn)錄水平而不改變轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：

下降突變：TATAAT

AATAAT

上升突變：TATGTT

TATATT-35序列的作用是為RNA聚合酶的識別提供信號，而-10序列使復(fù)合物由閉合轉(zhuǎn)化為開放。所以我們可以認(rèn)為-35序列包括一個識別結(jié)構(gòu)域，而-10序列包括一個解鏈結(jié)構(gòu)域。起始點周圍的堿基序列對起始作用也有影響，起始轉(zhuǎn)錄區(qū)間（+1→+30）影響RNA聚合酶沿啟動子滑動的速度從而影響啟動子的強(qiáng)度。第二十二頁，共六十頁，2022年，8月28日4)

轉(zhuǎn)錄起始的效率不同啟動子的起始效率有差異。不同啟動子與全酶的結(jié)合緊密程度不同，結(jié)合的緊密程度與啟動子起始轉(zhuǎn)錄的效率有關(guān)。轉(zhuǎn)錄起始受調(diào)節(jié)蛋白控制。啟動子上游序列可能增強(qiáng)啟動子的活性。負(fù)超螺旋狀態(tài)有利于轉(zhuǎn)錄起始，是因為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)需較少的自由能，就可使起始復(fù)合物中的雙鏈解開。第二十三頁，共六十頁，2022年，8月28日5)特定類型基因的轉(zhuǎn)錄由不同的因子控制在細(xì)胞中不止一種因子RNA聚合酶起始一些基因的轉(zhuǎn)錄需要特殊的因子不同大腸桿菌因子識別不同的啟動子在噬菌體中通過因子的改變控制不同時期基因的表達(dá)。第二十四頁，共六十頁，2022年，8月28日2.RNA鏈的延伸a.全酶結(jié)合在啟動子后，開始不斷的流產(chǎn)起始，直至移出啟動子區(qū)域，才進(jìn)行鏈的延伸。b.當(dāng)RNA聚合酶全酶剛結(jié)合上DNA時，它覆蓋75-80bp，從-55延伸至+20，在起始階段它保持著這個位置。c.進(jìn)入鏈延伸階段后，因子被釋放，RNA聚合酶不再覆蓋-55到-35的DNA，只剩下約60bp被RNA聚合酶所覆蓋。第二十五頁，共六十頁，2022年，8月28日3.

鏈的終止RNA鏈停止增長，并與DNA模板鏈分離。終止子：促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列，在RNA水平上通過轉(zhuǎn)錄出的終止子序列形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)而起作用?？煞譃閮深悾翰灰蕾囉谝蜃拥慕K止子（內(nèi)在終止子）依賴于因子的終止子第二十六頁，共六十頁，2022年，8月28日（1）不依賴于因子的終止子核心酶可以在沒有任何其它輔助因子的情況下，在某些終點終止，這些位點稱為不依賴于因子的終止子

。特征：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中包含發(fā)卡狀的二級結(jié)構(gòu)（7-20bp）和3’末端連續(xù)4個或更多的U殘基，發(fā)卡莖部結(jié)構(gòu)中富含G-C。第二十七頁，共六十頁，2022年，8月28日2)依賴于因子（rho）的終止子需要Rho的存在才能終止反應(yīng)。特征：在終止點前有一段富含C但缺乏G的區(qū)段。這段堿基越長，終止效率越高。第二十八頁，共六十頁，2022年，8月28日因子：46KD的蛋白，功能形式是六聚體，是RNA聚合酶的一個輔助因子，只在鏈終止時起作用。因子具有ATPase的活性，結(jié)合在終止點上游的RNA新生鏈的某個位置，然后可能沿RNA鏈向RNA聚合酶移動，如果趕上暫停在終止點的RNA聚合酶，合成就終止。如果沒有因子因子存在，聚合酶暫停在終止子后，又繼續(xù)RNA合成。第二十九頁，共六十頁，2022年，8月28日B.原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控一、基因表達(dá)的調(diào)控水平二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控－操縱子三、操縱子的一般類型四、乳糖操縱子五、色氨酸操縱子第三十頁，共六十頁，2022年，8月28日一、基因表達(dá)的調(diào)控水平1.DNA水平：基因丟失、擴(kuò)增、重排、甲基化等2.轉(zhuǎn)錄水平：轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)是最為經(jīng)濟(jì)的一種方式。3.轉(zhuǎn)錄后加工水平：RNA初級轉(zhuǎn)錄本本身可以是調(diào)節(jié)的目標(biāo)。例如，它的穩(wěn)定性與它能否被翻譯有關(guān)。4.翻譯水平：和轉(zhuǎn)錄水平一樣，翻譯水平的調(diào)控也包括起始和終止的調(diào)控。機(jī)體可以在基因表達(dá)過程的任何階段進(jìn)行調(diào)控，一般以轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控為主。第三十一頁，共六十頁，2022年，8月28日二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控－操縱子操縱子是原核生物基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控的基本形式。一個操縱子包括一個上游的調(diào)控區(qū)和一個以上的結(jié)構(gòu)基因組成。調(diào)控區(qū)包含啟動子和操縱基因兩部分。該區(qū)控制連鎖在一起的多個基因的轉(zhuǎn)錄。1.操縱子第三十二頁，共六十頁，2022年，8月28日2.結(jié)構(gòu)基因：編碼蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn)物的任何基因。細(xì)菌的結(jié)構(gòu)基因常以基因簇的形式存在?；虼刂谢虻木幋a產(chǎn)物功能上是相關(guān)的。例如，編碼同一代謝途徑中酶的基因常存在于同一基因簇?；虼刂谢蚰苁軉我粏幼拥墓餐刂?，結(jié)果是整簇基因或者都表達(dá)或者都不表達(dá)。二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控－操縱子第三十三頁，共六十頁，2022年，8月28日例如：lac基因簇（乳糖操縱子中的三個結(jié)構(gòu)基因）

-半乳糖苷分解酶

-半乳糖苷透性酶硫代半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶Plac原核生物操縱子中的全部結(jié)構(gòu)基因從同一個啟動子開始轉(zhuǎn)錄成一個多順反子的mRNA分子。第三十四頁，共六十頁，2022年，8月28日二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控－操縱子3.操縱基因：是原核生物的操縱子中調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點，為控制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。4.調(diào)節(jié)基因：僅指參與其他基因表達(dá)調(diào)控的RNA和蛋白質(zhì)的編碼基因。調(diào)節(jié)基因編碼的調(diào)節(jié)蛋白通過與DNA上的操縱基因結(jié)合而控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵。第三十五頁，共六十頁，2022年，8月28日5.反式作用因子與順式作用元件基因表達(dá)的產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或RNA）從合成的場所擴(kuò)散到目標(biāo)場所而發(fā)揮作用的過程稱為反式作用（trans-acting），此基因表達(dá)產(chǎn)物被稱為反式作用因子（trans-actingfactor）

。反式作用因子通常為蛋白質(zhì)或RNA，其特征為可以從合成地擴(kuò)散到目標(biāo)場所發(fā)揮作用。二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控－操縱子第三十六頁，共六十頁，2022年，8月28日順式作用元件（cis-actingfactor）是指對結(jié)構(gòu)基因表達(dá)有調(diào)節(jié)活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同處在一個DNA分子上的基因。順式作用元件通常不編碼蛋白質(zhì)，多位于基因旁側(cè)或內(nèi)含子中。順式作用（cis-acting）的概念用于任一不轉(zhuǎn)變?yōu)槿魏纹渌问降腄NA序列，它只在原位發(fā)揮DNA序列的作用，僅影響與其物理上相連的DNA序列的活性。基因活性的調(diào)控主要通過反式作用因子（通常是蛋白質(zhì)）和順式作用元件（通常在DNA上）相互作用而實現(xiàn)。第三十七頁，共六十頁，2022年，8月28日位于轉(zhuǎn)錄開始和結(jié)束位置上的DNA序列如啟動子、終止子都是典型的順式作用元件，能受同一類反式作用因子RNA聚合酶的識別。操縱基因（O）是位于操縱子前端部分的順式作用元件，它能和調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。調(diào)節(jié)蛋白是調(diào)節(jié)基因的表達(dá)產(chǎn)物，是參與操縱子調(diào)節(jié)的反式作用因子。第三十八頁，共六十頁，2022年，8月28日6.負(fù)調(diào)控與正調(diào)控負(fù)調(diào)控：基因的表達(dá)處于啟動狀態(tài)，但是調(diào)節(jié)蛋白與操縱基因的結(jié)合關(guān)閉了基因的表達(dá)。第三十九頁，共六十頁，2022年，8月28日正調(diào)控：基因的表達(dá)處于關(guān)閉狀態(tài)，調(diào)節(jié)蛋白與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因才能表達(dá)。第四十頁，共六十頁，2022年，8月28日7.誘導(dǎo)作用和阻抑作用細(xì)菌應(yīng)答某種特定物質(zhì)出現(xiàn)而合成特定酶的過程，稱為誘導(dǎo)作用（induction）。大腸桿菌乳糖操縱子是這種機(jī)制最好的范例。如果某種小分子物質(zhì)能夠開啟操縱子的轉(zhuǎn)錄，這種小分子物質(zhì)就叫做誘導(dǎo)物（inducer）。誘導(dǎo)物在誘導(dǎo)物－抑制子復(fù)合體中使抑制子失去抑制作用。二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控－操縱子第四十一頁，共六十頁，2022年，8月28日三、操縱子的一般類型1.誘導(dǎo)型操縱子調(diào)節(jié)基因（R）組成型表達(dá)抑制子與抑制子作用的的小分子物質(zhì)是誘導(dǎo)物，通常是即將被分解的糖或代謝物。只有當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，抑制子被失活，操縱子才表達(dá)，表達(dá)的產(chǎn)物(酶)分解該誘導(dǎo)物。利用類似自然誘導(dǎo)物的物質(zhì)可以誘導(dǎo)基因表達(dá)，但不能被酶分解，這類誘導(dǎo)物稱為義務(wù)誘導(dǎo)物（安慰誘導(dǎo)物），如IPTG（異丙基--D-硫代半乳糖苷）。第四十二頁，共六十頁，2022年，8月28日mRNARPOABCDNARI產(chǎn)物RPOABCDNARmRNA＋I(xiàn)ABC不表達(dá)RI:

無活性的抑制子表達(dá)R:有活性的抑制子無I例如：誘導(dǎo)物存在時：誘導(dǎo)物缺乏時：第四十三頁，共六十頁，2022年，8月28日2.阻遏型操縱子調(diào)節(jié)基因組成型表達(dá)能被輔阻遏物激活的抑制子。和抑制子相互作用的小分子物質(zhì)是輔阻遏物，通常是合成代謝的末端產(chǎn)物，例如氨基酸。只有當(dāng)缺乏輔阻遏物時，操縱子才表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物是合成該輔阻遏物所必需的。三、操縱子的一般類型第四十四頁，共六十頁，2022年，8月28日例如：mRNARPOABCDNAR產(chǎn)物RPOABCDNACo-RmRNAABC不表達(dá)表達(dá)+Co缺乏輔阻遏物時：輔阻遏物存在時：Co-R:

有活性的抑制子R:無活性的抑制子第四十五頁，共六十頁，2022年，8月28日四、乳糖操縱子1.結(jié)構(gòu)基因：a.乳糖操縱子包括-6000bpofDNA。b.乳糖操縱子（lactoseoperon，lac）的三個結(jié)構(gòu)基因成簇排列，編碼參與β-半乳糖苷（如乳糖）分解代謝所需的三種蛋白質(zhì)：lacZ編碼β-半乳糖苷酶，lacY編碼β-半乳糖苷透性酶，lacA編碼β-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙?；浮５谒氖?，共六十頁，2022年，8月28日lacI基因（調(diào)節(jié)基因）正好與結(jié)構(gòu)基因相鄰，但它不與結(jié)構(gòu)基因?qū)儆谕晦D(zhuǎn)錄單位，它有自己獨立的轉(zhuǎn)錄單位，含有自己的啟動子和終止子。lacI編碼可擴(kuò)散的產(chǎn)物，理論上它不必位于結(jié)構(gòu)基因附近。將lacI基因轉(zhuǎn)移到其他任何地方都能很好地發(fā)揮作用，因此lacI的表達(dá)產(chǎn)物屬于反式作用因子。Lac阻抑蛋白的單體結(jié)構(gòu)：包含幾個獨立的結(jié)構(gòu)域第四十七頁，共六十頁，2022年，8月28日lacI基因的表達(dá)產(chǎn)物稱為乳糖操縱子阻抑蛋白（lacrepressor）。LacI阻抑蛋白通過與操縱基因結(jié)合使Lac操縱子處于不活躍狀態(tài)。因此，乳糖操縱子的調(diào)控屬于負(fù)調(diào)控。第四十八頁，共六十頁，2022年，8月28日3.誘導(dǎo)物的添加影響了阻抑蛋白與操縱基因的結(jié)合能力，使阻抑蛋白從操縱基因上釋放出來，從而啟動轉(zhuǎn)錄。第四十九頁，共六十頁，2022年，8月28日乳糖第五十頁，共六十頁，2022年，8月28日五、色氨酸操縱子色氨酸操縱子的基本特征：5個結(jié)構(gòu)基因，trpE,D,C,B,A。

控制區(qū)包括：啟動子，操縱基因，前導(dǎo)序列和弱化子

。

調(diào)節(jié)基因trpR與操縱基因trpO不連在一起。色氨酸是一個輔阻遏物，與trpR產(chǎn)物構(gòu)成有活性的抑制復(fù)合體。

表達(dá)通過阻遏和弱化兩種方式控制。第五十一頁，共六十頁，2022年，8月28日2.阻遏方式Trp操縱基因序列長21bp，是trp阻抑蛋白的作用位點。五、色氨酸操縱子第五十二頁，共六十頁