蒼術(shù)揮發(fā)油化學(xué)成分及其抗菌活性的研究

時珍國醫(yī)國藥2011年第22卷第3期LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL．22NO．3［8］KlschH，LütjohannD，LudwigM，etal．Polymorphisminthecho-lesterol24S－h(huán)ydroxylasegeneisassociatedwithAlzheimer＇sdisease．MolPsychiatry．2002，7（8）：899．［9］BorroniB，ArchettiS，AgostiC，etal．IntronicCYP46polymorphismalongwithApoEgenotypeinsporadicAlzheimerDisease：fromriskfac-2004，25（6）：747．torstodiseasemodulators［J］．NeurobiolAging，［10］LaunerLJ，WhiteLR，PetrovitchH，etal．Cholesterolandneuro-pathologicmarkersofAD：apopulation－basedautopsystudy［J］．Neurology，2001，23（8）：1447．［11］RefoloLM，PappollaMA，LaFrancoisJ，etal．Acholesterol－loweringdrugreducesbeta－amyloidpathologyinatransgenicmousemodelofJ］．NeurobiolDis，2001，8（5）：890．Alzheimer＇sdisease［［12］SimonsM，KellerP，DeStrooperB，etal．Cholesteroldepletioninhib-itsthegenerationofbeta－amyloidinhippocampalneurons［J］．ProcNatlAcadSciUSA，1998，26（11）：6460．［13］FrearsER，StephensDJ，WaltersCE，etal．Theroleofcholesterolinthebiosynthesisofbeta－amyloid．Neuroreport，1999，3；10（8）：1699．［14］WolozinB．Cholesterol，statinsanddementia［J］．CurrOpinLipidol，2004，15（6）：667．［15］王懷星，賴世隆，孫景波．補腎益智方治療老年性癡呆模型大鼠J］．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，20（10）：771．的行為學(xué)測試［［16］耿勁松，周愛玲，茅家慧，等．腦益康對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬NGF－TrkAmRNA表達(dá)的影響［J］．中國老年學(xué)雜志，2009，29（2）：152．［17］余銳，肖飛，李曉光，等．去癡靈脂溶性提取物血清抑制M146L細(xì)胞分泌β淀粉樣蛋白［J］．中國新藥雜志，2006，15（13）：1061．［18］張建民，胡愉，王紅，等．中藥復(fù)方CHPⅡ?qū)DAPPV717Ⅰ轉(zhuǎn)．解剖學(xué)報，2004，35（6）：622．基因小鼠腦組織病變的影響［J］［19］張婷，董克禮．益智健腦顆粒對阿爾茨海默病患者腦脊液β淀．中國老年學(xué)雜志，2007，27（6）：粉樣蛋白含量的影響［J］1080．著降低（P＜0．01）（表5，圖1，圖2），免疫印跡法顯示大鼠腦海馬區(qū)Aβ的IOD值及AβIOD/β－actinIOD比值均顯著降低（P＜0．01）（圖3，表6，圖4），說明腦益康中藥復(fù)方通過抑制膽固醇原降低了大鼠血脂水平，使大鼠腦海馬區(qū)Aβ合成減少，從位合成，而顯著改善高膽固醇血癥大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。因此，降低膽固醇可以作為減少Aβ生成治療AD的新靶點，腦益康中藥復(fù)方的應(yīng)用對于改善阿爾茨海默病行為學(xué)損害、降低減少紅細(xì)胞聚集性及改善血液粘度、減少血清CHO及LDL－C、腦內(nèi)海馬區(qū)Aβ沉積具有較好的治療作用，具有進(jìn)一步研究、開發(fā)和應(yīng)用的前景。參考文獻(xiàn)：［1］Kivipelto，M．，HelkalaE．L．，LaaksoM．P．，etal．MidlifevascularriskfactorsandAlzheimer＇sdiseaseinlaterlife：longitudinal，popula-．BMJ，2001，16；322（7300）：1447．tionbasedstudy［J］［2］PuglielliL，TanziRE，KovacsDM．Alzheimer＇sdisease：thecholester-．NatNeurosci，2003，6（4）：345．olconnection［J］［3］KivipeltoM，SolomonA．CholesterolasariskfactorforAlzheimer＇sdis-ease－epidemiologicalevidence［J］．ActaNeurolScandSuppl，2006，185：50．［4］SchneiderA，Schulz－SchaefferW，HartmannT，etal．Cholesteroldepletionreducesaggregationofamyloid－betapeptideinhippocampalneurons［J］．NeurobiolDis．2006，23（3）：573．［5］王躍春．Y型電迷宮在大鼠學(xué)習(xí)記憶功能測試中的合理應(yīng)用［J］．2005，14：69．中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，［6］SparksDL，ScheffSW，HunsakerJC3mletal．InductionofAlzheimer－likebeta－amyloidimmunoreactivityinthebrainsofrabbitswithdi-．ExpNeurol，1994，126（1）：88．etarycholesterol［J］［7］RefoloLM，MalesterB，LaFrancoisJ，etal．Hypercholesterolemiaac-celeratestheAlzheimer＇samyloidpathologyinatransgenicmousemodel［J］．NeurobiolDis，2000，7（4）：321．蒼術(shù)揮發(fā)油化學(xué)成分及其抗菌活性的研究郭金鵬，王萍，孫如寶，史云，劉雪林*（中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所，北京100071）摘要：目的研究蒼術(shù)揮發(fā)油的化學(xué)成分及抗菌活性。方法運用水蒸氣蒸餾法從蒼術(shù)根莖中提取揮發(fā)油，用氣相色譜－質(zhì)譜（GC－MS）聯(lián)用技術(shù)對其揮發(fā)油組分進(jìn)行分離和鑒定，運用氣相色譜面積歸一化法確定各組分的相對含量；對蒼術(shù)的揮發(fā)油做了抗菌試驗。結(jié)果蒼術(shù)的揮發(fā)油中主要成分為β－胺葉油醇（24%）、二苯基－4－甲醛（18%）、β－胺葉烯、α－胺葉油醇和茅術(shù)醇等。其揮發(fā)油對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、銅綠假單胞等病原菌有顯著地抑制和滅活作用。結(jié)論實驗結(jié)果為綜合開發(fā)利用蒼術(shù)醫(yī)藥資源提供了理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：蒼術(shù)；揮發(fā)油；氣相色譜－質(zhì)譜法；抗菌活性DOI標(biāo)識：doi：10．3969/j．issn．1008-0805．2011．03．0200805（2011）03-0566-02中圖分類號：R285．5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1008-蒼術(shù)（RhizomaAtractylodis）又名赤術(shù)，為菊科蒼術(shù)屬植物茅蒼術(shù)Atractylodeslancea（Thunb．）DC．或北蒼術(shù)Atractylodeschinensis（DC．）Koidz．的干燥根莖，南蒼術(shù)又稱茅蒼術(shù)。早在漢。明代李時珍在《本草綱代，張仲景就說蒼術(shù)“能避一切惡氣”“能除惡氣，目》中也記載蒼術(shù)古今病疫及歲旦，入家往往燒蒼術(shù)。近代張山雷《本草正義》以辟邪氣，故時疫之病多用之”記載：“芳香辟穢，蒼術(shù)勝四時不正之氣，故時疫之病多用之。最能驅(qū)。用蒼除穢濁惡氣。陰霾之域，久曠之屋，宜焚此物而后居人”術(shù)熏蒸空氣，具有解郁避穢的作用，其主要殺菌活性成分為揮發(fā)油。蒼術(shù)煙熏消毒應(yīng)用于病房、產(chǎn)房、手術(shù)室等取得滿意效［1，2］，果但對其活性成分、殺菌機制、應(yīng)用劑型等缺乏深入研究。本實驗通過對蒼術(shù)有效成分的提取并進(jìn)行實驗室抗菌性能研究，05-26；修訂日期：2010-10-12收稿日期：2010-基金項目：北京市自然科學(xué)基金項目（No．7063088）），作者簡介：郭金鵬（1977-男（漢族），山東陵縣人，現(xiàn)任中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所助理研究員，博士學(xué)位，主要從事病原微生物和抗微生物天然產(chǎn)物研究工作．），通訊作者簡介：劉雪林（1963-男（漢族），河南輝縣人，現(xiàn)任中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所研究員，博士學(xué)位，主要從事疾病預(yù)防控制工作．*·566·LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL．22NO．3時珍國醫(yī)國藥2011年第22卷第3期為其臨床應(yīng)用和新劑型的開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。1材料與儀器1．1材料藥材產(chǎn)地：北蒼術(shù)，北京市燕北飲片廠，批號為040916。1．2試劑無水硫酸鈉、乙醚、氯化鈉（均為分析純，北京化學(xué)試水為蒸餾水。MH肉湯，肉湯培養(yǎng)基，普通瓊脂平板培養(yǎng)劑廠），基?？咕钚詫嶒炈脴?biāo)準(zhǔn)菌株凍干品購自中國疾病預(yù)防控制北京藥品生藥制品鑒定所、中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心，并由我中心、中心實驗室保存。1．3儀器Finnigan－TraceDSQ型GC/MS儀（美國熱電公司），GC（美國安捷倫科技有限公司，AgilentGC6890N，F(xiàn)ID），打漿機，96孔培養(yǎng)板，水蒸氣蒸餾裝置，普通培養(yǎng)箱。2方法2．1蒼術(shù)揮發(fā)油的提取水蒸氣蒸餾器提取法：將北蒼術(shù)根莖粉碎成干粉，稱量500g蒼術(shù)干粉，裝入10000ml水蒸氣蒸餾提取器中，加人6000ml蒸餾水提取，溫度控制在100℃附近，待提取器約6h，即停止提取。用分液漏斗去支管中流下的液體為無色時，除下部蒸餾水即得油狀粗提物，密封后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。提取率?）=油狀液體體積/樣品重量×100%。2．2GC－MS工作條件Finnigan－TraceDSQ型GC/MS儀，色譜柱型號：ThermoTR－5－MS毛細(xì)管質(zhì)譜柱（30m×0．25mm×0．33μm），色譜條件：載氣為高純氦氣，流量1．0ml/min進(jìn)樣口3min，5℃/min升至80℃，柱溫60℃，保持1min，溫度150℃，10℃/min升至180℃，保持3min，15℃/min升至250℃，保持5min，掃描模式：全掃描，質(zhì)量范圍30～350amu，電離方式EI，電子能量70eV，離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃。定量定性方法：各色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)聯(lián)用儀的計算機譜庫檢索進(jìn)行定性，質(zhì)譜數(shù)據(jù)為NIST譜庫。各組分的相對含量是根據(jù)總離子流是相對檢出量而言。圖由計算機采用峰面積歸一法計算而得，2．3抗菌實驗抗菌實驗菌株為大腸埃希菌等。實驗菌液配置24h培養(yǎng)，方法：將細(xì)菌接種于MH肉湯，置普通培養(yǎng)箱37℃，比6培養(yǎng)基使用肉湯濁法進(jìn)行計數(shù)。用培養(yǎng)液調(diào)配成10CFU/ml，培養(yǎng)基和普通瓊脂平板培養(yǎng)基，采用微量二倍連續(xù)梯度稀釋法測［3］定MIC，平板轉(zhuǎn)種法測定MBC。MIC的測定：將蒼術(shù)揮發(fā)油溶于含5%Tween80的肉湯，并進(jìn)行二倍連續(xù)梯度稀釋，將各濃度樣品液分別加到96孔培養(yǎng)板，0．15ml/孔。再依次加入濃度為106CFU/ml的實驗菌液50μl/24h孔。同時設(shè)立細(xì)菌對照。放置于濕盒內(nèi)于普通培養(yǎng)箱37℃，培養(yǎng)，觀察，無細(xì)菌生長孔的最小藥物濃度為最小抑菌濃度（MIC）。MBC的測定：依次將細(xì)菌未生長孔（≥MIC）的培養(yǎng)物用無菌生理鹽水稀釋20倍，分別吸取0．05ml點種于瓊脂平板，置普24h培養(yǎng)，無細(xì)菌生長接種區(qū)域所對應(yīng)的最小藥通培養(yǎng)箱37℃，物濃度為最小殺菌濃度（MBC）。3結(jié)果3．1蒼術(shù)揮發(fā)油成分分析蒼術(shù)揮發(fā)油經(jīng)GC－MS分離分析的總離子流圖如圖1，分離出17個組分，各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后所得的質(zhì)譜圖，采用計算機譜庫檢索，人工譜圖解析，按個峰的質(zhì)譜碎片與文獻(xiàn)核對，對基峰、質(zhì)荷比和相對豐度等方面進(jìn)行比較，分別對各峰加以確認(rèn)，其中含量最多的是β－胺葉油醇（24%），依次為二苯基－4－甲醛、β胺葉烯、α－胺葉油醇和茅術(shù)醇等，未檢出蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素。二苯基－4－甲醛是本實驗中檢出含量第二高的化合物，約占18%，該成分的檢出在多數(shù)文獻(xiàn)中未見報道，但與［4］［5］典靈輝、黃昌全的報道一致，該物質(zhì)的生物活性以及在蒼術(shù)抗菌殺菌過程中所起的作用還有待探討。蒼術(shù)揮發(fā)油提取的方法不同以及所選溶劑的不同，是影［6］響抽提成分的重要因素。賈春曉等利用蒸餾萃取法和索氏提取法分別進(jìn)行了實驗，索氏提取法鑒定出22種化合物，蒸無水乙餾萃取法鑒定出了49種化合物；并分別用二氯甲烷、醚和正己烷做溶劑抽提，結(jié)果提取成分也各不相同。本次實主要集中在C15等倍半驗所用方法檢出有效成分近二十種，萜類成分，未檢出C10等小分子物質(zhì)，可能與提取方式以及MS的分離條件有關(guān)。圖1蒼術(shù)揮發(fā)油總離子流程圖3．2抗菌活性結(jié)果分析蒼術(shù)揮發(fā)油對8個標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC和MBC如表1，從表中結(jié)果可以看出蒼術(shù)揮發(fā)油對實驗所選用的8個實驗菌株均有明顯的抑制作用和滅活作用，能有效地抵抗常見致病菌的感染。蒼術(shù)揮發(fā)油對大腸埃希菌ATCC8099株的MIC值是0．78μl/ml，表明蒼術(shù)揮發(fā)油對此細(xì)菌有較明顯的抑制作用；蒼術(shù)揮發(fā)油對鼠傷寒沙門氏菌ATCC50013株、株腸炎沙門氏菌50040株、金黃色葡萄球菌ATCC25923株、銅綠假單胞菌ATCC27853株的MIC值均為1．56μl/ml，表明蒼術(shù)揮發(fā)油對這4種細(xì)菌也有明顯的抑制作用；蒼術(shù)揮發(fā)油對其它三種細(xì)菌的MIC值相對較大一些，但也表現(xiàn)出一定的抑菌活性。蒼術(shù)揮發(fā)油對實驗的8個菌株均有抑制作用。蒼術(shù)揮發(fā)油對大腸埃希菌的MBC值是1．56μl/ml，表明蒼術(shù)揮發(fā)油對此細(xì)菌有顯著的殺滅作用；蒼術(shù)揮發(fā)油對腸炎沙門菌株和金黃色葡萄球菌株的MBC值分別為3．13μl/ml，表明蒼術(shù)揮發(fā)油對這兩個細(xì)菌也有明顯的殺滅作用；蒼術(shù)揮發(fā)油對實驗的8個菌株均有殺滅作用。蒼術(shù)揮發(fā)油對大腸埃腸炎沙門菌株和金黃色葡萄球菌ATCC株的抑制作希菌株、用和滅活作用較為顯著。表1蒼術(shù)揮發(fā)油對標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC和MBC值μl·ml－1最小抑菌濃度MIC0．781．561．566．253．131．566．251．56最小殺菌濃度MBC1．566．253．1312．512．53．1312．56．25標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC8099株傷寒沙門氏菌ATCC50097株腸炎沙門氏菌ATCC50040株鼠傷寒沙門氏菌ATCC50013株福氏志賀菌ATCC51253株金黃色葡萄球菌ATCC25923株白色念珠菌ATCC10231株銅綠假單胞菌ATCC27853株4討論用水蒸氣蒸餾法提取蒼術(shù)中的揮發(fā)油，分析其揮發(fā)油成分和含量以及對其揮發(fā)油生物活性的初步實驗，為綜合利用和開發(fā)這一傳統(tǒng)醫(yī)藥資源提供了理論依據(jù)。通過對蒼術(shù)揮發(fā)油化學(xué)成分分析可知其成分復(fù)雜多樣，與文獻(xiàn)報道的菊屬其他植物揮發(fā)油化［7］以萜類為主，這進(jìn)一步證學(xué)成分中的一些主要成分是一致的，明物種與其化學(xué)組成具有一定的相關(guān)性，其中的主要化學(xué)成分對該屬植物的鑒定有參考價值，但由于種類、地域和來源的不同揮發(fā)油化學(xué)組成會存在著一定的差異，這意味著揮發(fā)油的生物活性也存在著差異。抗菌實驗結(jié)果表明蒼術(shù)揮發(fā)油對實驗所選用的8個實驗菌株均有明顯的抑制作用和滅活作用，這和蒼術(shù)作為空［8，9］，氣消毒劑具有廣譜抗菌作用的結(jié)果相一致這里僅對其揮發(fā)·567·時珍國醫(yī)國藥2011年第22卷第3期LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL．22NO．32004，32（2）：32．化工，油的抗菌殺菌生物活性做了初步實驗，由于蒼術(shù)揮發(fā)油化學(xué)成分協(xié)正杰，張忠義，等．蒼術(shù)超臨界CO2萃取物化學(xué)成分分析其揮發(fā)油主要成分抗菌生物活性實驗有待于進(jìn)一［5］黃昌全，的復(fù)雜多樣性，［J］．中藥材，2001，24（10）：726．步深入研究。參考文獻(xiàn)：［1］陳小青，李慧靈，曾松芳，等．蒼術(shù)特劑型燃燒法空氣消毒的觀察［J］．護(hù)理學(xué)雜志，2002，17（2）：14．［2］毛又玲，陳學(xué)芹．四種室內(nèi)空氣消毒方法的效果觀察［J］．護(hù)士進(jìn)修1997，12（6）：8．雜志，［3］徐小平，李卓成，肖建德，等．蒼術(shù)消毒劑殺菌性能的實驗觀察［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2003，13（9）：843．［4］典靈輝，梁勇，寧艷平．蒼術(shù)揮發(fā)油成分GC－MC分析［J］．廣州［6］賈春曉，毛多斌，張文葉，等．大別山野生蒼術(shù)揮發(fā)油化學(xué)成分研究［J］．中藥材，2004，27（8）：571．［7］李迎春．北蒼術(shù)超臨界CO2萃取產(chǎn)物的成分分析［J］．測試學(xué)報，2001，20（1）：46．［8］金詩風(fēng)，王汝清，周光鑲，等．蒼術(shù)煙熏對空氣消毒效果的觀察［J］．2003，20（3）：198．中國消毒學(xué)雜志，［9］施綺云，薛廣波，胡世杰．蒼術(shù)復(fù)方消毒劑對空氣中微生物殺滅效J］．中國消毒學(xué)雜志，1995，12（2）：114．果的檢測［天麻素對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元的保護(hù)作用*徐紀(jì)偉，陳旭東，劉喜民，康紅玉，孫丹華（漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南漯河462002）摘要：目的探討天麻素對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元的影響。方法制作脊髓損傷模型，分為假手術(shù)組，生理鹽水治療組，天麻素治療組，每組25只。用Nissl染色檢測神經(jīng)元的活性，檢測動物術(shù)后BBB運動評分。結(jié)果天麻素治療組較生理鹽神經(jīng)元的尼氏體的含量較多，差異具有顯著性；天麻素治療組的BBB運動評分明顯優(yōu)于生理鹽水治療組。結(jié)水治療組，論天麻素能夠改善脊髓損傷區(qū)域的微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)元的生長。關(guān)鍵詞：天麻素；脊髓損傷；尼氏體DOI標(biāo)識：doi：10．3969/j．issn．1008-0805．2011．03．0210805（2011）03-0568-02中圖分類號：R322．81文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1008-成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷后，往往造成災(zāi)難性——脊髓損傷（spinalcordiniury，SCI）導(dǎo)致神經(jīng)功能不易的后果—大量恢復(fù)。這主要是因為損傷組織不能進(jìn)行真正意義上的再生，的神經(jīng)元調(diào)亡，不能形成功能性突觸聯(lián)系，從而導(dǎo)致永久的神經(jīng)功能缺失。CNS再生困難主要是因為傷后為神經(jīng)元提供營養(yǎng)的微環(huán)境破壞，從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。本實驗通過注射天麻素（Gastrodin）來改善損傷區(qū)的微環(huán)境，觀察神經(jīng)元中尼氏體表達(dá)，采用BBB運動功能評分檢測動物機體恢復(fù)狀況，從而探討天麻素的神經(jīng)保護(hù)作用及可能機制。1材料1．1實驗動物及試劑SD雌性大鼠75只，體質(zhì)量250～300g。動物分為假手術(shù)組，生理鹽水治療組，天麻素治療組。每組于術(shù)3，7，14，21d各處死5只動物取材。后1，天麻素、焦油紫、乙醇、乙醚、氯仿、二甲苯。1．2動物模型制作損傷組（單純脊髓橫斷組/天麻素治療組）：以40mg/kg體質(zhì)量腹腔內(nèi)注射戊巴妥鈉麻醉大鼠后，將大鼠俯臥位固定于實驗臺上，取后正中切開皮膚及皮下，顯露出T9至T10棘突及椎板，用手術(shù)刀完全切斷脊髓，沖洗傷口，縫合傷口，無菌敷料覆蓋，建立大鼠脊髓橫斷損傷模型。生理鹽水治療組：按照損傷組一樣進(jìn)行手術(shù)，剪斷脊髓。假手術(shù)組：按照損傷組一樣進(jìn)行手術(shù)，但不剪斷脊髓。天麻素治療組在傷后即刻在蛛網(wǎng)膜下注射5mg的天麻素；生理鹽水治療組給予等量生理鹽水；假手術(shù)組不給藥。以后每天l周后停藥。給同量藥1次，1．3組織固定、取材與切片術(shù)后規(guī)