華大結題報告-1.23小數(shù)據(jù)處理信息分析已知miRNA新可選項

項目介紹項目編 r物分析Oryzasa數(shù)據(jù)處理；標準信息分析；已知mRNA分析；新mRNA分析；可選項分差異MXAAvs數(shù)據(jù)庫版本mpsnoRNABasemr2dPansnoRNADa

11Mar14

hp://wwwmr2dseaseorg/樣樣*已知mRNA數(shù)據(jù)庫mRBase中有的mRNAmRNA使用mRNA預測軟件預測出來的mRNA 統(tǒng)計樣 數(shù)

）的個

位點數(shù)

新miRNA的 統(tǒng)計樣 miRNA數(shù)

數(shù) （miRNA::相應

）的個

位點差異分析統(tǒng)計樣顯著差異的已知miRNA的個顯著差異的新miRNAMXAAvsHSeq深度 所得的SmaRNA(sRNA)幾乎涵蓋所有的RNA，包括mRNA、sRNA、pRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、repeatassocatesRNA、exon或ntron降解片段等，其中mRNA、sRNA以及pRNA是研究的熱點。對于 所得的序列的鑒定，生物信息分析上般通過與各類已知的數(shù)據(jù)庫進行比對、尋找樣品與數(shù)據(jù)庫之間在組位置上的覆蓋等方法，對sRNA進行注釋分類，同時選取沒有被注釋上的sRNA，使用華大自主開發(fā)的軟件Mreap或Mrdeep預測新mRNA。在mRNA鑒定的基礎上，針對實際樣品信息采用靈活的差異分析策略可以找到生物體不同組間或不同 間的表達差異的mRNA，針對所有鑒定的mRNA和表達差異的mRNA通過靶 ：RNAhybrd,mRanda,targetscan,PITA;植物:psRobot,TargetFnder）進行靶位點確認，然后可通過對靶位點所在 的GO功能注釋以及KEGG pathway注釋，最終可以得到mRNA在生物體中參與的生命活動的 個清晰的生物信息圖譜。 實驗簡小分子RNA是生物體內(nèi)類重要的特殊分子，誘導 轉(zhuǎn)錄和翻譯等諸多生命活動的調(diào)控過程?；贖Seq高通量 技術的小RNA數(shù)字化分 (SBSsequencngbysynthess)，可減少因二級結構造成的段區(qū)域的缺失。并具有所需樣品量少，高通量，高精確性，擁有簡單易操作的自動化平臺和功能強大等特點，次性獲得數(shù)百萬條小分子RNA序列，能夠快速全面地鑒定該物種在該狀態(tài)下的小分子RNA并發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA，構建樣品之間的小分子RNA差異表達譜，為小分子RNA功能研究提供有力工具。按樣品分為兩種實驗方法，如下圖：圖1植物 樣品的實驗流

*提取樣品總RNAPAGE膠分離不同片段大小的RNA。切取1830nt之間的條帶，回收SmaRNA制5’接頭連接體系，混勻離心，適溫反應定時間，再用PAGE膠純回收5’連接產(chǎn)物；配制3’接頭連接體系，混勻離心，適溫反應定時間，再用PAGE膠純化回收3’連接產(chǎn)物；配制反轉(zhuǎn)錄體系，在PCR儀上適溫反應定時間，使連接產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄成雙，再配制PCR反應體系，在PCR儀上按照定程序進行擴增；使用PAGE膠對PCR產(chǎn)物進行切膠回收純化，回收產(chǎn)物溶于EBsouton，完成文庫構建；構建好的文庫使用Agent2100Boanayzer和ABIStepOnePusReaTmePCRSystem進行質(zhì)量和產(chǎn)量的檢測圖2動物樣品的實驗流*提取樣品總RNA，使用PAGE膠分離不同片段大小的RNA。切取1830nt之間的條帶，回收SmaRNA；配制3’連接體系，混勻離心，適溫連接段時間；配制5’連接體系，包括3’端連接產(chǎn)物，混勻后離心，適溫連接段時間；配制反轉(zhuǎn)錄體系，在PCR儀上適溫反應定時間，使連接產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄成雙鏈，再配制PCR反應體系，在PCR儀上按照定程序進行擴增；使用PAGE膠對PCR產(chǎn)物進行切膠回收純化，回收產(chǎn)物溶于EBsouton，完成文庫構建；構建好的文庫使用Agent2100Boanayzer和ABIStepOnePusReaTmePCRSystem進行質(zhì)量和產(chǎn)量的檢1.2.2HSeq所得49nt序列，通過過濾得到可信的目標序列，對這些序列的質(zhì)量、長度及樣品間公共序列進行統(tǒng)計。通過目標序列分類注釋，可以獲得樣品中包含的各組分及表達量信息。對未注釋的小RN段來進行新mRNA的預測；對已知mRNA和新mRNA進行差異分析、聚類分析、靶預測和對靶的GO功能注釋以及KEGGpathway注釋。整個流程如圖3信息分析流專有名定將剪切的段，反轉(zhuǎn)錄，加接頭得到DN段，經(jīng)過儀單所得到的堿基序列，是原始數(shù)序列（ags）的種數(shù)過濾后的相同序列分種o已知m通過mRBase數(shù)據(jù)庫里鑒定到的m新m通過軟件預測得到的mKEGG是系統(tǒng)分析產(chǎn)物在細胞中的代謝途徑以及這些產(chǎn)物的功能的數(shù)據(jù)庫，利用KEGG可以 步研究在生物學上步到數(shù)據(jù)處對過濾后的數(shù)據(jù)畫堿基組成和質(zhì)量值分布圖，直觀地查看數(shù)據(jù)質(zhì)量情況。如果樣品有多個ane 數(shù)據(jù)，每個ane 數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估都會展示，簡稱L*。左圖是堿基組成圖：橫坐標表示堿基在tags上的位置，縱坐標表示在不同位置上各種堿基(ATCGN)的比例;右圖是堿基質(zhì)量圖：橫坐標表示堿基在tags上的位置，縱坐標表示在不同位置上各種堿基(ATCGN)的質(zhì)量L1的堿基組成圖和堿基質(zhì)量圖L1結數(shù)據(jù)質(zhì)量

類類read個百分比oahghqua0nser00smaerhan00cean類read個百分比oahghqua0nser0 0smaerhan0cean0以上表格每行每列的意oa H hghqua 般認為在第130個堿基中不含N，質(zhì)量值低于10位點不超過4個且質(zhì)量值低于13的位點不超過6個的片段為高質(zhì)量nsersmaerhancean長度分布：tags的長度分布。橫坐標表示tags長度，縱坐標表示不同tag長度下tags結標準信息分通過SOAP或bowte將sRNA定位 組，分析tags 組上的表達和分布情況組比對 Toa Mappngo 66 Toa Mappngo 67以上表格每行每列的意UnqueToasRNA總比對上組部所有sRNA的種數(shù)及百分所有sRNA的總數(shù)及百分比對上組的sRNA總數(shù)及百分比對組的sRNA種數(shù)及百小 段在各 上的分布情

上分布的tags的片段數(shù)。0上方表示分布在 正鏈上的片段數(shù)，用藍色表示；0下方表示分布在 結通過bast或bowte將sRNA和mRBase數(shù)據(jù)庫比對，鑒定出已知mRNA,這些已知mRNA可用于后續(xù)分析若m中無該物種mN信息(或該物種的前體少于個，比對到miN中（動物、植物）的mRN的成熟體序列結果示意如下：表達序mmR166ammmm表達序mmR166am mmm結知09090*圖“長度在18~30nt的小RNA片段首位堿基偏向性”：橫坐標表示已知mRNA的長度?？v坐標表示不同長度的已知mRNA的首位堿基分別是AUCG的百分比*圖“sR 段各位點堿基偏向性”：橫坐標表示已知 RNA的各堿基位點?？v坐標各堿基位點上的堿基分別是AUCG的百分比 小 段各位點堿基偏向性 小 段各位點堿基偏向性前體比對細節(jié)文件展示如下 結mR結將sRNA通過程序進行repeat注釋，篩選和去除同repeat相關的序列橫坐標表示各小類重復序列?？v坐標表示不同小類重復序列的tags種類（帶unq的圖）和總數(shù)（帶tota的圖）結通過bast或bowte將sRNA和Genbank數(shù)據(jù)庫比對，篩選和去除同rRNA,scRNA,snoRNA,snRNA,tRNA等相關的序列左圖表示比對到Genbank數(shù)據(jù)庫中各類非編碼sRNA的tags的種數(shù)（unq）；右圖表示比對到Genbank數(shù)據(jù)庫中各類非編碼sRNA的tags的總數(shù) ）結通過bast或bowte將sRNA和Rfam數(shù)據(jù)庫比對，篩選和去除同rRNA,scRNA,snoRNA,snRNA,tRNA等相關的序列左圖表示比對到Rfam數(shù)據(jù)庫中各類非編碼sRNA的tags的種數(shù)（unq）；右圖表示比對到Rfam數(shù)據(jù)庫中各類非編碼sRNA的tags的總數(shù) ）結將sRNA比對到外顯子和內(nèi)含子，篩選和去除同外顯子和內(nèi)含子等相關左圖表示比對到外顯子和內(nèi)含子的正義鏈和反義鏈的tags的種數(shù)（unq）；右圖表示比對到外顯子和內(nèi)含子的正義鏈和反義鏈的tags的總數(shù) ）匹配內(nèi)含子、外顯子的小RNA統(tǒng)計結將所有sRNA與各類RNA的比對情況進行總結:左圖表示比對到各類非編碼sRNA的tags的種數(shù)（unq）；右圖表示比對到各類非編碼sRNA的tags的總數(shù)（tota 注：如果后面“可選項分析”里分析了snoRNA和p RNA這兩種數(shù)據(jù)庫的注釋，這兩個分析同樣也要進行統(tǒng)計，排除這些注釋上的tags。snoRNA注釋歸入rRNAetc。小RNA在各類中的分布結使用mrdeep（該軟件適用動物）或mreap（該軟件適用于動植物）對未注釋上的且比對上 間區(qū)的sRNAs預測新mRNA，繪制新mRNA的二級樣品新miRNA的種新miRNA的總表達新miRNA二級結構圖新miRNA二級結構圖結mRnovemrnovemrnovemrnovem結 分表格解說表示該物種中存在這類mRNA，表示該物種中不存在這類mRNA物M物MMMM++++++++Zea++++++++結已知miRNAExpdff方法：對兩個樣品中表達的已知mRNA統(tǒng)計，判斷在兩樣品之間的表達量是否存在顯著性差異，并分別使用og2rato、Scatterpot圖比較兩者共同表達的mRNA表達的差異DEGseq:鑒定表達差 的R語言DESeq:基于負二項分布的差異表達分析的R包,要求有生物學 *圖中橫坐標表示樣品或樣品組，縱坐標：紅色長方形表示 表達量的og值，紅色長方形中的黑色橫線表示所 表達量的平均ogsmR000000000000000結MXAA-vs-MXBA的聚類圖(點擊查看小聚類在各樣品的表達模式結 對已知 RNA進行 預測，用多個軟件進行預測，取交集或并集作為預測結果 預測軟件有RNAhybrd、mRanda、targetscan、PITA，至少選 種做靶 預測。運行時間：targetscan<mRanda<PITA<RNAhybrd。最好選用mRanda、targetscan、PITA。植物：可選的 預測軟件psRobot和TargetFnder，至少選 種做 預測軟miRNA數(shù)軟miRNA數(shù)靶數(shù)（miRNA::相應靶）的個靶位點數(shù) 位點預測統(tǒng)計軟 miRNA數(shù) 數(shù) （miRNA::相應 ）的個 位點數(shù)結 預對差異表達的已知 RNA進行 預測，用多個軟件進行預測，取交集或并集作為預測結果 預測軟件有RNAhybrd、mRanda、targetscan、PITA，至少選 種做靶 預測。運行時間：targetscan<mRanda<PITA<RNAhybrd。最好選用mRanda、targetscan、PITA。植物：可選的 預測軟件psRobot和TargetFnder，至少選 種做 預測 軟 miRNA數(shù) 數(shù) （miRNA::相應

）的個 位點數(shù)

各種 結GeneOntoogy（簡稱GO）是個國際標準化 功能分類體系，提供 套動態(tài)更新的標準詞匯表（controedvocabuary）來全面描述生物體 產(chǎn)物的屬性。GO總共有三個ontoogy，分別描 的分子功能（moecuarfuncton）、所處的細胞位置（ceuarcomponent）、參與的生物過程（boogcaproces）GO富集情

下圖是采用Goseq和topseq繪制的 般展示富集最高的前10個GO term的拓撲學結構圖 GO條

該GO條目下的個

該GO條目個

P- 矯正的P-968GO條該GO條目下靶因的個該GO條目個P-矯正的P-37580220022003800GO條該GO條目下該GO條目下P-矯正的P-的個6313665172311該GO條目下該GO條目GO條的個個P-矯正的P-240686010GO條該GO條目下靶因的個該GO條目個P-矯正的P-58209000003500該GO條該GO條GO條下靶個下個P-矯正的P-13166271GO功能分*橫坐標表示GO細胞組分和元件、分子功能,和生物過程三個大類的各小分類，左縱坐標表 比例，右縱坐標表 個數(shù)GO功能分析的結果(MXAA)(點擊查看結GeneOntoogy（簡稱GO）是個國際標準化 功能分類體系，提供 套動態(tài)更新的標準詞匯表（controedvocabuary）來全面描述生物體 產(chǎn)物的屬性。GO總共有三個ontoogy，分別描 的分子功能（moecuarfuncton）、所處的細胞位置（ceuarcomponent）、參與的生物過程（boogcaproces）GO富集情下圖是采用Goseq和topseq繪制的， 般展示富集最高的前10個GOterm的拓撲學結

該GO條目下靶的該GO條目下 470050該GO條目下的個該GO條目個350220023002400該GO條該GO條GO條下的個下個P-矯正的P-0502200GO功能分*橫坐標表示GO細胞組分和元件、分子功能,和生物過程三個大類的各小分類，左縱坐標表 比例，右縱坐標表 個數(shù)結 參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。同所有target gene的Pathway分析

樣，我們提供了相同形式的結果來展示pathwayMXBA的KEGG分析結果(點擊查看通路圖展示如下MXAA的KEGG分析結果(點擊查看通路圖展示如下結 參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。同所有targetgene的Pathway分析 樣，我們提供了相同形式的結果來展示pathway富MXAA-vs-MXBA的KEGG分析結果(點擊查看通路圖展示如下結mRNA成熟體的28位被稱作序列，是高度保守的。mRNA在其序列(2～8nt)發(fā)生突變，直接導致靶位點發(fā)生改變。因此在我們的分析過程中，在允許個堿基錯配的條件下，將和該物種mRNA前體比對但是未注釋上mRNA的sRNA序列與mRBase數(shù)據(jù)庫中成熟體進行匹配，從而尋找發(fā)生了堿基編輯的mRNA。當只有和該物種mRNA前體比對注釋才有此分有堿基編輯tag總有堿基編輯tag總無堿基編輯tag總3有堿基編輯tag有堿基編輯tag總無堿基編輯tag總3細節(jié)，結果示意如堿基編AoC 堿基編輯細節(jié)的解說：mRNA堿基編輯情況mRNA前體序列成熟體序列和成熟體相關的ags，通過序列可以看出堿基編輯情Expdff方法：對兩個樣品中表達的新mRNA統(tǒng)計，判斷在兩樣品之間的表達量是否存在顯著性差異，并分別使用og2rato、Scatterpot圖比較兩者共同表達的mRNA表達量的DEGseq:鑒定表達差 的R語言包DESeq:基于負二項分布的差異表達分析的R包,要求有生物學重復*圖中橫坐標表示樣品或樣品組，縱坐標：紅色長方形表示 表達量的og值，紅色長方形中的黑色橫線表示所 表達量的平均ogsmRnovemr00novemrnovemr00009novemr009結MXAA-vs-MXBA的聚類圖(點擊查看小聚類在各樣品的的表達模式圖如結 預對新 RNA進行 預測，用多個軟件進行預測，取交集或并集作為預測結果動物：可選 預測軟件有RNAhybrd、mRanda、targetscan、PITA，至少 種做 預測。運行時間：targetscan<mRanda<PITA<RNAhybrd。好選用mRanda、targetscan、PITA植物：可選的 預測軟件psRobot和TargetFnder，至少選 種做 預測 位點預測統(tǒng)計軟 miRNA數(shù) 數(shù) （miRNA::相應 ）的個 位點數(shù)

軟miRNA數(shù)軟miRNA數(shù)靶數(shù)（miRNA::相應）的個靶位點數(shù)結 預對差異表達的新 RNA進行 預測，用多個軟件進行預測，取交集或并集作為預測結果 預測軟件有RNAhybrd、mRanda、targetscan、PITA，至少選 種做靶 預測。運行時間：targetscan<mRanda<PITA<RNAhybrd。最好選用mRanda、targetscan、PITA。植物：可選的 預測軟件psRobot和TargetFnder，至少選 種做 預測 軟 miRNA數(shù) 數(shù) （miRNA::相應 ）的個 位點數(shù)各種 結GeneOntoogy（簡稱GO）是個國際標準化 功能分類體系，提供 套動態(tài)更新的標準詞匯表（controedvocabuary）來全面描述生物體 產(chǎn)物的屬性。GO總共有三個ontoogy，分別描 的分子功能（moecuarfuncton）、所處的細胞位置（ceuarcomponent）、參與的生物過程（boogcaproces）GO富集情下圖是采用Goseq和topseq繪制的， 般展示富集最高的前10個GOterm的拓撲學結GO的idGO條該GO因的個該GO條目下基個P-矯正的P- 0800GO條該GO條目下靶因的個該GO條目下因個P-矯正的P-13pas00000GO該GO條目靶的個該GO條目個P-矯正的P-51723GO條該GO條目下靶因的個該GO條目下因個P-矯正的P-588000GO條該GO條目下的個該GO條目個P-矯正的P-379203090該GO條目 GO條該GO條目P-矯正的P-靶個3228511168GO功能分*橫坐標表示GO細胞組分和元件、分子功能,和生物過程三個大類的各小分類，左縱坐標表 比例，右縱坐標表 個數(shù)結GeneOntoogy（簡稱GO）是個國際標準化 功能分類體系，提供 套動態(tài)更新的標準詞匯表（contro