高精度PCR技術(shù)在肝病診療中的價(jià)值課件

PCR技術(shù)在肝病診療中的價(jià)值

病毒性肝炎感染世界性流行，是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球60億人口中，約20億人曾感染過(guò)或正感染HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有60萬(wàn)人死于與HBV感染相關(guān)的肝病。近年來(lái)，我國(guó)在慢性乙型肝炎（乙肝）防治領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展?！笆晃濉敝卮髠魅静ｍ?xiàng)計(jì)劃病毒性肝炎重大研究專項(xiàng)啟動(dòng)2009年，我國(guó)病毒性肝炎領(lǐng)域最重要的進(jìn)展是國(guó)家“十一五”重大傳染病專項(xiàng)計(jì)劃:“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項(xiàng)啟動(dòng)（見(jiàn)表1）。這是“十一五”期間與“載人航天與探月工程、大型飛機(jī)”等相平行的16個(gè)重大專項(xiàng)計(jì)劃之一。主要內(nèi)容臨床對(duì)高靈敏度乙肝病毒核酸定量的需求我國(guó)乙肝病毒核酸定量PCR檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀艾迪康提供兩種高靈敏度病毒核酸檢測(cè)血清HBVDNA水平是臨床上評(píng)價(jià)HBV復(fù)制情況的“金標(biāo)準(zhǔn)”HBVDNAHBVDNA貫穿感染者的終生ALT正常增高或者波動(dòng)正常增高或者波動(dòng)免疫耐受期免疫清除期非活動(dòng)或低（非）復(fù)制期再活動(dòng)期肝組織學(xué)無(wú)明顯異常,或輕度炎癥纖維化中度或嚴(yán)重炎癥、纖維化快速進(jìn)展無(wú)炎癥或僅有輕度炎癥中度或嚴(yán)重炎癥、肝纖維化臨床診斷慢性HBV攜帶者HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化非活動(dòng)性HBsAg攜帶者HBeAg陰性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化LokAS,etal.Hepatology.2009;50:661-662LiawYF,LiverInternational,2009,29(s1):100-1-72012：HBVDNAdetectionandHBVDNAlevelmeasurementareessentialforthediagnosis,decisiontotreatandsubsequentmonitoringofpatients(A1).Follow-upusingrealtimePCRquantificationassaysisstronglyrecommendedbecauseoftheirsensitivity,specificity,accuracyandbroaddynamicrange[38–41](A1).2009：Recently,HBVDNAassaysthatutilizereal-timePCRtechnologywithimprovedsensitivity(5-10IU/mL)andwiderdynamicrange(upto8-9log10IU/mL)havebecomeavailable乙肝治療指南：美國(guó)和歐洲Hepatology,2009JHepatol,2012HepatolInt，2012乙肝治療共識(shí)：2012亞太(1)HepatolInt，2012乙肝治療共識(shí)：2012亞太(3)HBVDNA載量檢測(cè)在治療優(yōu)化路線圖中的作用抗病毒治療前病毒基線的準(zhǔn)確測(cè)定：—適宜抗病毒治療患者選擇、抗病毒治療方案的確定、抗病毒療效的預(yù)測(cè)與后續(xù)療效比對(duì)抗病毒治療過(guò)程中療效的評(píng)估和方案優(yōu)化、耐藥突變檢測(cè)和治療終點(diǎn)的確認(rèn)抗病毒優(yōu)化治療停藥后隨訪及復(fù)發(fā)再治的判斷隱匿性病毒性肝炎的診斷高靈敏度核酸定量檢測(cè)的臨床意義HBV核酸定量PCR檢測(cè)的國(guó)際指南要求超敏感性（Hypersensitivity）—HBV最低檢測(cè)限＜10-15IU/ml寬線性范圍（widerdynamicrange）—涵蓋101~109IU/ml高特異性（Highspecificity）可重復(fù)性好（Repeatability）主要內(nèi)容臨床對(duì)高靈敏度乙肝病毒核酸定量的需求我國(guó)乙肝病毒核酸定量PCR檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀艾迪康提供兩種高靈敏度病毒核酸檢測(cè)HBVDNA檢測(cè)臨床應(yīng)用斑點(diǎn)雜交（Dot-blothybridization）非定量PCR（Non-PCRbasedquantitativeHBVDNAassays定量PCR-basedquantitativeHBVDNAassays1980s1990s2000s血清HBVDNA定量目前多以熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)作為檢測(cè)手段；HBVDNA定量的表達(dá)多以拷貝/毫升（copies/ml）或國(guó)際單位/毫升（IU/ml）表達(dá)，二者之間粗略的換算方法為1IU/ml=5copies/ml。血清HBVDNA定量檢測(cè)的發(fā)展方向?yàn)楦呙舾行裕╯ensitivity）和更寬的動(dòng)態(tài)范圍（dynamicrange）。國(guó)產(chǎn)HBVDNAPCR試劑性能現(xiàn)狀中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012現(xiàn)有的國(guó)產(chǎn)試劑在檢測(cè)靈敏度、線性范圍、可重復(fù)性等方面無(wú)法滿足臨床上日益增加的對(duì)HBVDNA定量準(zhǔn)確性和靈敏度的要求

部分試劑缺乏內(nèi)參，影響定量準(zhǔn)確性

主要內(nèi)容臨床對(duì)高靈敏度乙肝病毒核酸定量的需求我國(guó)乙肝病毒核酸定量PCR檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀艾迪康提供兩種高靈敏度病毒核酸檢測(cè)20例患者組成特點(diǎn)--9例服用ETV、11例服用ADV（48周）--10例大三陽(yáng)、8例小三陽(yáng)患者、2例小二陽(yáng)患者檢測(cè)試劑病例數(shù)HBVDNA分布范圍國(guó)產(chǎn)HBV20例<1000copies/mlCAP/CTMHBV11例8例*

1例TargetNotDetected103~104copies/ml104~105copies/ml*包括1例服用ETV患者高靈敏度HBVDNA檢測(cè)及時(shí)判斷病毒突破、及時(shí)調(diào)整治療決策高靈敏核酸檢測(cè)與普通核酸檢測(cè)比較數(shù)據(jù)來(lái)源：北京大學(xué)人民醫(yī)院普通PCR法“假陰性”率高達(dá)45%(9/20)以核苷類(lèi)藥物為基礎(chǔ)的治療：

用藥24周時(shí)（拉米夫定/替比夫定）或48周時(shí)（阿德福韋）出現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答（HBVDNA檢測(cè)不到），則可預(yù)測(cè)耐藥的發(fā)生率低，亦即持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的機(jī)會(huì)得到提高，并且HBeAg陽(yáng)性患者抗HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換的機(jī)會(huì)更高。乙肝治療期應(yīng)答的預(yù)測(cè)因素：HBVDNA高靈敏度檢測(cè)方法在治療中的應(yīng)用以NAs為基礎(chǔ)的治療HBeAg陽(yáng)性患者NAs有限療程治療:1.應(yīng)每6個(gè)月檢測(cè)HBeAg和抗HBe，在治療期間每3-6個(gè)月通過(guò)敏感的PCR方法檢測(cè)HBVDNA;2.抗HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換之后，應(yīng)每間隔12個(gè)月檢測(cè)HBsAgNAs長(zhǎng)期治療：1.理想上，應(yīng)達(dá)到HBVDNA下降至實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)不到的水平（即低于10–15IU/ml）以避免耐藥，因而HBVDNA監(jiān)測(cè)是檢測(cè)治療失敗的關(guān)鍵;2.在第3個(gè)月時(shí)應(yīng)檢測(cè)HBVDNA水平以查明病毒學(xué)應(yīng)答情況，然后每3-6個(gè)月檢測(cè)。摘自2012年《EASL臨床實(shí)踐指南：慢性乙肝病毒感染管理》

2.監(jiān)測(cè)治療高靈敏度檢測(cè)方法在治療中的應(yīng)用3.P區(qū)耐藥監(jiān)測(cè)和判斷條件高靈敏度檢測(cè)方法在治療中的應(yīng)用抗病毒治療后HBV從病毒變異到臨床耐藥原發(fā)無(wú)應(yīng)答病毒學(xué)（部分）應(yīng)答臨床耐藥小結(jié)1.高靈敏度乙肝DNA檢測(cè)：羅氏Cobas/磁珠法：靈敏度高、線性范圍廣，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，滿足國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。2.P區(qū)耐藥：用藥無(wú)進(jìn)展或治療效果反彈，考慮檢測(cè)P區(qū)耐藥。高靈敏度丙肝RNA檢測(cè)病毒學(xué)反應(yīng)定義SVR(持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答)治療停止后24周血清HCV-RNA檢測(cè)陰性(<50IU/mL)RVR(快速病毒學(xué)應(yīng)答)治療4周時(shí)，HCVRNA轉(zhuǎn)陰(<50IU/mL)EVR(早期病毒學(xué)應(yīng)答)cEVR(完全EVR)治療12周時(shí)，HCVRNA轉(zhuǎn)陰（低于檢測(cè)低限(<50IU/mL）pEVR(部分EVR)治療12周時(shí)，HCVRNA陽(yáng)性，但是相對(duì)于治療前基線下降≥2log10非EVR(非早期病毒學(xué)應(yīng)答)治療12周時(shí)，HCVRNA下降<2log10

值病毒學(xué)應(yīng)答的檢測(cè)及定義摘自2012年《EASL臨床實(shí)踐指南：丙肝病毒感染管理》

高靈敏度丙肝RNA檢測(cè)治療開(kāi)始第4周、12周和24周進(jìn)行血清病毒載量測(cè)定有助于調(diào)整治療方案；（這些時(shí)間點(diǎn)發(fā)生HCVRNA病毒消失直接與SVR呈正比）必須要進(jìn)行治療結(jié)束后病毒學(xué)應(yīng)答和治療結(jié)束24周的SVR評(píng)估；非合并肝硬化而達(dá)到SVR患者，治療后48周和96周要檢測(cè)ALT和HCVRNA，以確保ALT正常同時(shí)血清病毒呈陰性；可能出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)：患者達(dá)到了治療結(jié)束時(shí)的病毒學(xué)應(yīng)答(治療結(jié)束時(shí)血清HCVRNA病毒未檢出)，但是隨后病毒學(xué)指標(biāo)惡化，未達(dá)SVR。

標(biāo)準(zhǔn)治療方案的復(fù)發(fā)率介于15%-25%，數(shù)值的變化取決于治療期間HCVRNA轉(zhuǎn)陰時(shí)間。摘自2012年《EASL臨床實(shí)踐指南：丙肝病毒感染管理》

診斷與監(jiān)測(cè)治療高靈敏度丙肝RNA檢測(cè)

“應(yīng)選擇靈敏的檢測(cè)法進(jìn)行HCVRNA定性和定量檢查(檢測(cè)限的低限值≤50IU/ml)，理想的病毒學(xué)檢測(cè)方法是RT-PCR法，檢測(cè)結(jié)果的單位應(yīng)為IU/ml?！盓ASL（歐洲肝臟研究學(xué)會(huì)）指南1“治療HCV感染的期望臨床終點(diǎn)是清除病毒，即采用最敏感的方法也無(wú)法檢測(cè)到血清HCV病毒RNA，因此實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部檢測(cè)應(yīng)采用real-timePCR的方法對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)”APASL（亞太肝臟研究協(xié)會(huì)年會(huì)）標(biāo)準(zhǔn)2高靈敏度丙肝RNA檢測(cè)數(shù)據(jù)來(lái)源：北京大學(xué)人民醫(yī)院※高靈敏HCVRNA檢測(cè)更準(zhǔn)確，國(guó)產(chǎn)普通檢測(cè)較容易造成錯(cuò)誤治療決策。RVR：快速病毒學(xué)應(yīng)答cEVR：完全早期病毒學(xué)應(yīng)答高靈敏度丙肝RNA檢測(cè)※高靈敏度HCV-RNA檢測(cè)：靈敏度高，不會(huì)造成停藥過(guò)早，導(dǎo)致復(fù)發(fā)率高高靈敏度丙肝RNA檢測(cè)基因分型乙肝基因分型（建議做）2012年《EASL臨床實(shí)踐指南：慢性乙肝病毒感染管理》指出：與HBV基因型為D和C比較，基因型為A和B的抗HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換率與HBsAg消失率更高;2010年中國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南》更新版指出：HBV基因型和疾病進(jìn)展和干擾素α治療效果有關(guān)。與C基因型感染者相比，B基因型感染者較早出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，較少進(jìn)展為慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。乙肝基因分型

EASL（歐洲肝臟研究學(xué)會(huì)）指南1“HCVRNA基因分型結(jié)果有助于判定治療的難易程度及制定抗病毒治療的個(gè)體化方案。治療前應(yīng)進(jìn)行HCVRNA基因分型和血中HCVRNA定量，以決定抗病毒治療的療程和利巴韋林的劑量”中國(guó)（丙型肝炎防治指南）標(biāo)準(zhǔn)2“HCV患者持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（SVR）的最佳預(yù)測(cè)因子為IL-28B基因多態(tài)性、基因型及肝纖維化分期?！北位蚍中停ū仨氉觯?.決定治療路線；2.決定用藥劑量。丙肝基因分型基因1型（包括4型）患者

病毒應(yīng)答指導(dǎo)的抗病毒治療摘自2012年《EASL臨床實(shí)踐指南：丙肝病毒