(最新整理)CHO細胞表達抗體課件1

(最新整理)CHO細胞表達抗體(1)2021/7/261(最新整理)CHO細胞表達抗體(1)2021/7/261CHO細胞表達抗體2021/7/262CHO細胞表達抗體2021/7/262基因工程抗體表達體系CHO細胞骨髓瘤細胞2021/7/263基因工程抗體表達體系CHO細胞骨髓瘤細胞2021/7/26CHO（Chinesehamsterocary）CHO細胞生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的首選細胞系目前70%以上的治療性抗體蛋白都是由CHO細胞產(chǎn)生的對蛋白質(zhì)進行糖基化，其糖型與人類基本一致不易傳播人類病毒，比其他哺乳細胞基因組更容易進行改造和擴增遺傳背景清楚、轉(zhuǎn)染效率高、可長期穩(wěn)定傳代并穩(wěn)定表達有功能活性抗體利于抗體純化：非分泌型細胞，本身很少分泌內(nèi)源性蛋白；可用無血清培養(yǎng)2021/7/264CHO（Chinesehamsterocary）CHO細CHOClassification補充：1980年CHO-K1經(jīng)化學突變得到CHO-DXB11（一個等位基因缺失）1983年的電離輻射經(jīng)誘變株CHO-DG44（兩個等位基因缺失）由于CHO-DXB11

DHFR缺陷不徹底，很快被完全無DHFR活性的CHO-DG44取代注釋：ATCC

（AmericanTypeCultureCollection）美國菌種保藏中心ECACC（EuropeanCollectionofAuthenticatedCellCultures）歐洲細胞株/微生物保藏中心2021/7/265CHOClassification2021/7/265DHFR缺陷型宿主細胞野生型宿主細胞DG44DUXB11CHO-K1CHO-SPcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)LifeTechnology公司GS基因表達系統(tǒng)瑞士的Lonza公司DHFR基因表達系統(tǒng)LifeTechnology公司FreedomCHO-SKit宿主細胞：DG44質(zhì)粒：共轉(zhuǎn)染PcDNA3.3（Neo抗性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR標記基因，￥3500）篩選試劑：G418（遺傳霉素）/MTX（氨甲喋呤）宿主細胞：CHO-K1SV質(zhì)粒：PEE12.4（Amp抗性，GS標記基因，￥2000）篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）宿主細胞：CHO-s?Cells(cGMP-banked)質(zhì)粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR標記基因，￥10000）篩選試劑：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHOCell2021/7/266DHFR缺陷型宿主細胞野生型宿主細胞DG44DUXB11CH抗體真核高效表達策略作用環(huán)節(jié)相應(yīng)策略整合位點弱化選擇標致基因；染色體定位篩選基因劑量弱化的可擴增選擇標志基因轉(zhuǎn)錄強啟動子、增強子、強轉(zhuǎn)錄終止信號、適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)翻譯翻譯型增強子，適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)加工組裝輕重鏈表達平衡，宿主細胞修飾分泌適宜的抗體分泌前導(dǎo)肽，適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)其他選擇適宜的宿主細胞、宿主細胞修飾，盡量去除非生產(chǎn)性克隆抗體mRNA的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄效率與mRNA的穩(wěn)定性是其中最重要的因素因此，抗體的表達量很大程度上由質(zhì)粒載體的各表達調(diào)控元件及組織方式?jīng)Q定2021/7/267抗體真核高效表達策略作用環(huán)節(jié)相應(yīng)策略整合位點弱化選擇標致基因CHO表達載體組成表達載體結(jié)構(gòu)組成骨架序列選擇性標志基因表達盒特殊的調(diào)控序列2021/7/268CHO表達載體組成2021/7/268選擇標志基因當環(huán)境中存在高濃度（MTX、MSX）時，標記基因可自發(fā)在染色體上擴增拷貝數(shù)，連帶其上下游的序列一起擴增，共擴增序列可達上千個bp，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍。對目的基因的拷貝數(shù)沒有影響，如主要用于構(gòu)建瞬時表達載體。2021/7/269選擇標志基因當環(huán)境中存在高濃度（MTX、MSX）時，標記基表達盒抗體基因表達盒的組織形式已較為固定，但其中各元件的選擇仍有值得探討的地方啟動子和相應(yīng)的增強子是最關(guān)鍵的元件真核啟動子含有TATA盒（確定轉(zhuǎn)錄起始位點）和下游富含GC的序列（決定轉(zhuǎn)錄起始頻率）常用的CHO細胞表達啟動子的轉(zhuǎn)錄活性依次為CMV啟動子>SV40啟動子>LTR啟動子2021/7/2610表達盒抗體基因表達盒的組織形式已較為固定，但其中各元件的選擇

常用的較早的商業(yè)化載體系統(tǒng)適用于DHFR缺陷細胞，但是有報道CHO（DHFR-)細胞，很難馴化，生長也不好。DHFR系統(tǒng)表達水平雖較GS系統(tǒng)低，但細胞生長穩(wěn)定新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)具有更高的擴增效率，但細胞長期連續(xù)培養(yǎng)時，生長狀況不佳。2021/7/2611常用的較早的商業(yè)化載體系統(tǒng)DHFR系統(tǒng)表達水平雖較GS系統(tǒng)低PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)

將右圖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO（DHFR-）宿主菌須在含有GHT（甘氨酸、次黃嘌呤、胸腺嘧啶）的培養(yǎng)基中生長重組質(zhì)粒Poptivec-target整合到宿主菌染色體組上后的陽性菌可在不含GHT的培養(yǎng)基中生長。進一步用G418和MTX篩選，在MTX濃度選擇壓力下，dhfr基因與其共轉(zhuǎn)染的目的基因一起擴增，提高目的蛋白表達。2021/7/2612PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)

將右圖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)GS系統(tǒng)

Sigma、藥明康德等公司都在自己構(gòu)建載體使用（只要知道載體的幾個原件可以自己全部合成）宿主細胞：CHO-K1質(zhì)粒：PEE12.4篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）瑞士的Lonza公司

1992年，Bebbington等首次使用GS基因細胞系統(tǒng)表達重組抗體

PEE12.42021/7/2613GS系統(tǒng)

瑞士的Lonza公司PEE12.4202PEE12.4412.42021/7/2614PEE12.442021/7/2614

GS（谷氨酰胺合成酶）篩選原理

L-谷氨酸+氨+ATPL-谷氨酰胺+ADP+PiGS2021/7/2615

GS（谷氨酰胺合成酶）篩選原理

L-谷氨酸+氨+ATP

DHFR系統(tǒng)宿主：CHO-SCell（cGMP-banked）培液：CD-FortiCHOMedium限制性內(nèi)切酶：AvrII/BstZ17I，EcoRV/Pacl線性化酶：NruI轉(zhuǎn)化：Neon?electroporationTransfection篩選試劑：Puromycin/MTX篩選方法：兩輪加壓篩選單克隆篩選：有限稀釋法2021/7/2616

DHFR系統(tǒng)宿主：CHO-SCell（cGMP-ba四氫葉酸是一碳單位的載體，在核苷酸的合成中起到重要作用。當葉酸類似物MTX不可逆結(jié)合后，阻止四氫葉酸合成。細胞必須產(chǎn)生更多的DHFR才能維持細胞代謝。DHFR（二氫葉酸還原酶）篩選原理2021/7/2617四氫葉酸是一碳單位的載體，在核苷酸的合成中起到重要作用。DH2021/7/26182021/7/2618CHO細胞的培養(yǎng)一般采用F12培養(yǎng)基培養(yǎng)含10％血清的常規(guī)培養(yǎng)基里培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基2021/7/2619CHO細胞的培養(yǎng)2021/7/2619

基因合成與質(zhì)粒構(gòu)建（密碼子優(yōu)化）2-3weeks

轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP101-2weeks

轉(zhuǎn)染CHO-s2days

細胞pool篩選6-8weeks

單克隆Cell篩選4-5weeks

單克隆擴增、評估2-3weeks

擴大培養(yǎng)2021/7/26202021/7/26202021/7/26212021/7/2621小梯度多次加壓有利于最終得到穩(wěn)定的高表達細胞株。大幅度加壓可以在短期內(nèi)得到高表達克隆株細胞，但是細胞株表達不穩(wěn)定，在撤掉篩選壓力后，表達水平往往下降。2021/7/2622小梯度多次加壓有利于最終得到穩(wěn)定的高表達細胞株。2021/7THE

ENDTHANKYOU！2021/7/2623THEENDTHANKYOU！2021/7/26232021/7/26242021/7/2624(最新整理)CHO細胞表達抗體(1)2021/7/2625(最新整理)CHO細胞表達抗體(1)2021/7/261CHO細胞表達抗體2021/7/2626CHO細胞表達抗體2021/7/262基因工程抗體表達體系CHO細胞骨髓瘤細胞2021/7/2627基因工程抗體表達體系CHO細胞骨髓瘤細胞2021/7/26CHO（Chinesehamsterocary）CHO細胞生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的首選細胞系目前70%以上的治療性抗體蛋白都是由CHO細胞產(chǎn)生的對蛋白質(zhì)進行糖基化，其糖型與人類基本一致不易傳播人類病毒，比其他哺乳細胞基因組更容易進行改造和擴增遺傳背景清楚、轉(zhuǎn)染效率高、可長期穩(wěn)定傳代并穩(wěn)定表達有功能活性抗體利于抗體純化：非分泌型細胞，本身很少分泌內(nèi)源性蛋白；可用無血清培養(yǎng)2021/7/2628CHO（Chinesehamsterocary）CHO細CHOClassification補充：1980年CHO-K1經(jīng)化學突變得到CHO-DXB11（一個等位基因缺失）1983年的電離輻射經(jīng)誘變株CHO-DG44（兩個等位基因缺失）由于CHO-DXB11

DHFR缺陷不徹底，很快被完全無DHFR活性的CHO-DG44取代注釋：ATCC

（AmericanTypeCultureCollection）美國菌種保藏中心ECACC（EuropeanCollectionofAuthenticatedCellCultures）歐洲細胞株/微生物保藏中心2021/7/2629CHOClassification2021/7/265DHFR缺陷型宿主細胞野生型宿主細胞DG44DUXB11CHO-K1CHO-SPcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)LifeTechnology公司GS基因表達系統(tǒng)瑞士的Lonza公司DHFR基因表達系統(tǒng)LifeTechnology公司FreedomCHO-SKit宿主細胞：DG44質(zhì)粒：共轉(zhuǎn)染PcDNA3.3（Neo抗性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR標記基因，￥3500）篩選試劑：G418（遺傳霉素）/MTX（氨甲喋呤）宿主細胞：CHO-K1SV質(zhì)粒：PEE12.4（Amp抗性，GS標記基因，￥2000）篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）宿主細胞：CHO-s?Cells(cGMP-banked)質(zhì)粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR標記基因，￥10000）篩選試劑：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHOCell2021/7/2630DHFR缺陷型宿主細胞野生型宿主細胞DG44DUXB11CH抗體真核高效表達策略作用環(huán)節(jié)相應(yīng)策略整合位點弱化選擇標致基因；染色體定位篩選基因劑量弱化的可擴增選擇標志基因轉(zhuǎn)錄強啟動子、增強子、強轉(zhuǎn)錄終止信號、適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)翻譯翻譯型增強子，適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)加工組裝輕重鏈表達平衡，宿主細胞修飾分泌適宜的抗體分泌前導(dǎo)肽，適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)其他選擇適宜的宿主細胞、宿主細胞修飾，盡量去除非生產(chǎn)性克隆抗體mRNA的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄效率與mRNA的穩(wěn)定性是其中最重要的因素因此，抗體的表達量很大程度上由質(zhì)粒載體的各表達調(diào)控元件及組織方式?jīng)Q定2021/7/2631抗體真核高效表達策略作用環(huán)節(jié)相應(yīng)策略整合位點弱化選擇標致基因CHO表達載體組成表達載體結(jié)構(gòu)組成骨架序列選擇性標志基因表達盒特殊的調(diào)控序列2021/7/2632CHO表達載體組成2021/7/268選擇標志基因當環(huán)境中存在高濃度（MTX、MSX）時，標記基因可自發(fā)在染色體上擴增拷貝數(shù)，連帶其上下游的序列一起擴增，共擴增序列可達上千個bp，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍。對目的基因的拷貝數(shù)沒有影響，如主要用于構(gòu)建瞬時表達載體。2021/7/2633選擇標志基因當環(huán)境中存在高濃度（MTX、MSX）時，標記基表達盒抗體基因表達盒的組織形式已較為固定，但其中各元件的選擇仍有值得探討的地方啟動子和相應(yīng)的增強子是最關(guān)鍵的元件真核啟動子含有TATA盒（確定轉(zhuǎn)錄起始位點）和下游富含GC的序列（決定轉(zhuǎn)錄起始頻率）常用的CHO細胞表達啟動子的轉(zhuǎn)錄活性依次為CMV啟動子>SV40啟動子>LTR啟動子2021/7/2634表達盒抗體基因表達盒的組織形式已較為固定，但其中各元件的選擇

常用的較早的商業(yè)化載體系統(tǒng)適用于DHFR缺陷細胞，但是有報道CHO（DHFR-)細胞，很難馴化，生長也不好。DHFR系統(tǒng)表達水平雖較GS系統(tǒng)低，但細胞生長穩(wěn)定新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)具有更高的擴增效率，但細胞長期連續(xù)培養(yǎng)時，生長狀況不佳。2021/7/2635常用的較早的商業(yè)化載體系統(tǒng)DHFR系統(tǒng)表達水平雖較GS系統(tǒng)低PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)

將右圖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO（DHFR-）宿主菌須在含有GHT（甘氨酸、次黃嘌呤、胸腺嘧啶）的培養(yǎng)基中生長重組質(zhì)粒Poptivec-target整合到宿主菌染色體組上后的陽性菌可在不含GHT的培養(yǎng)基中生長。進一步用G418和MTX篩選，在MTX濃度選擇壓力下，dhfr基因與其共轉(zhuǎn)染的目的基因一起擴增，提高目的蛋白表達。2021/7/2636PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)

將右圖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)GS系統(tǒng)

Sigma、藥明康德等公司都在自己構(gòu)建載體使用（只要知道載體的幾個原件可以自己全部合成）宿主細胞：CHO-K1質(zhì)粒：PEE12.4篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）瑞士的Lonza公司

1992年，Bebbington等首次使用GS基因細胞系統(tǒng)表達重組抗體

PEE12.42021/7/2637GS系統(tǒng)

瑞士的Lonza公司PEE12.4202PEE12.4412.42021/7/2638PEE12.442021/7/2614

GS（谷氨酰胺合成酶）篩選原理

L-谷氨酸+氨+ATPL-谷氨酰胺+ADP+PiGS2021/7/2639

GS（谷氨酰胺合成酶）篩選原理

L-谷氨酸+氨+ATP

DHFR系統(tǒng)宿主：CHO-SCell（cGMP-banked）培液：CD-FortiCHOMedium限制性內(nèi)切酶：AvrII/BstZ17I，EcoRV/Pacl線性化酶：NruI轉(zhuǎn)化：Neon?electroporationTransfection篩選試劑：Puromycin/MTX篩選方法：兩輪加壓篩選單克隆篩選：有限稀釋法2021/7/2640

DHFR系統(tǒng)宿主：CHO-SCell（cGMP-ba四氫葉酸是一碳單位的載體，在核苷酸的合成中起到重要作用。當葉酸類似物MTX不可逆結(jié)合后，阻止四氫葉酸合成。細胞必須產(chǎn)生更多的DHFR才能維持細胞代謝。DHFR（二氫葉酸還原酶）篩選原理2021/7/2641四氫葉酸是一碳單位的載體，在核苷酸的合成中起到重要作用。DH2021/7/26422021/7/2618CHO細胞的培養(yǎng)一般采用F12培養(yǎng)基培養(yǎng)含10％血清的常規(guī)培養(yǎng)基里培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基2021/7/2643CHO細胞的培養(yǎng)2021/7/2619

基因合成與質(zhì)粒構(gòu)建（密碼子優(yōu)化）2-3weeks