大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取課件

大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法掌握質(zhì)粒DNA制備的方法和原理實驗?zāi)康膶嶒炘碣|(zhì)粒DNA的提取分為三個步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，十二萬基硫酸鈉（SDS）可使細(xì)胞壁裂解，經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑（SDS）處理后，細(xì)菌染色體DNA纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上，離心時易被沉淀出來，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中，將上清液用乙醇溶液沉淀洗滌后，可得到質(zhì)粒DNA.實驗材料、儀器與試劑試劑：PH8.0的G.E.T緩沖液：內(nèi)含50mmol/LEDTA、25mmol/LTris-Hcl用前加溶菌酶4mg/mLPH4.8的乙酸鉀溶液：內(nèi)含60mL5mmol/LKAc、11.5mL冰醋酸、28.5mL蒸餾水，該溶液中鉀離子濃度為3mmol/L，醋酸根離子濃度為5mmol/L

酚-氯仿混合液（體積比1：1）酚需在160℃重蒸，加入抗氧化劑8-羥基喹啉，使其體積分?jǐn)?shù)為0.1%，并用Tris緩沖溶液平衡兩次。向氯仿中加入異戊醇，使氯仿-異戊醇體積比為24:1

TE緩沖溶液（PH值8.0）內(nèi)含10mmol/LTris-Hcl、1mmol/LEDTA,令含RNA酶20ug/mL0.2mol/LNaoH溶液（內(nèi)含1%SDS）70%乙醇溶液/無水乙醇實驗材料、儀器與試劑實驗過程1、培養(yǎng)細(xì)菌擴增質(zhì)粒：

將帶有質(zhì)粒DNA的大腸桿菌接種在LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)2、收集菌體及裂解細(xì)菌:取液體培養(yǎng)菌液1.5mL置于EP管中，10000r/min離心1min,去上清。加入150uLG.E.T緩沖液，充分混勻，室溫放置10min（溶菌酶在堿性條件下不穩(wěn)定，必須在使用時重新配置，使用EDTA是為了除去細(xì)胞壁上的鈣離子，使溶菌酶更易與細(xì)胞壁接觸）加入新配置的0.2mol/LNaoH溶液（內(nèi)含1%SDS）加蓋，倒置2-3次，使之混勻。冰浴5min（SDS能使細(xì)胞膜裂解，并使蛋白質(zhì)變性）向上清液中加入等體積酚-氯仿混合液，震蕩混勻，以10000r/min離心2min,將上清轉(zhuǎn)至新的離心管中（用酚與氯仿的混合液除去蛋白，其效果比單獨使用酚或氯仿更好)向上清中加入2倍體積無水乙醇，混勻。室溫放置2min后，離心5min倒去上清乙醇溶液，把離心管倒置在吸水紙上吸去液體。加入0.5mL70%乙醇溶