DNARNA蛋白質(zhì)等各種生物物質(zhì)的保存

各種生物活性物質(zhì)的保存Experience2009-08-1616:34:36閱讀336評論0字號：大中小訂閱DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗體和探針的保存方法：（網(wǎng)上搜索，僅供參考A_A）1.DNA短期保存，兩年之內(nèi)吧，無菌水和TE緩沖液是ok的。如果是長期保存，比如10年20年的話，我推薦你剛提取好的DNA直接保存到乙醇里，放—20°,1放年沒問題。需要用的時候，再離心后，棄去乙醇，加水或TE溶解即可。長期保存用TE,DNA本來就是酸性，所以需要弱堿性環(huán)境保存，如果用中性或者酸性環(huán)境保存容易降解。保存兩年應(yīng)該會降解的！還是不要超過兩年，再一年內(nèi)都有降解的可能，所以還是要盡快的利用了。做成干粉不太可能，哪里有那么多的量！還是在-80度以下保存吧，也要避免反復(fù)凍融。如果DNA很純的話，應(yīng)該影響不是很大啊，有文獻報道高純DNA的最佳保存條件是4度，你也可以應(yīng)證一下你的DNA有沒有降解啊，跑個電泳看看啊，如果出現(xiàn)smear,就不要用了?。√峒兊腄NA放在4度一段時間（數(shù)周-數(shù)月）都沒問題。但是長期保存建議-20度，并且濃度不要稀釋的太低，否則容易降解。2.RNARNA若要長期保存，需沉淀下來后置于無水乙醇凍在-70度，用的時候再離心下來除去無水乙醇，用DEPC水溶解。保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA,對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA,在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA,在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至0.3M,12,000Xg離心5分鐘。RNA即使是放在-80度下也會降解，所以最好的保存方法是將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA后保存。提取的RNA保存在DEPC處理的水中，加入RNAse抑止劑，在-80度保存2個月，應(yīng)該是可以保證不降解的。最好是反轉(zhuǎn)錄后保存。一旦生物樣品被收集采摘，離體組織的RNA會立刻變得非常不穩(wěn)定，極易被降解。由于特異及非特異的RNA降解，或者由于樣品采集過程中的應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生新的RNA都會引起RNA狀態(tài)的改變。對于生物芯片、基因表達矩陣分析(ArrayAnalysis)、定量RT-PCR等實驗來說，采樣后立即穩(wěn)定樣品里的RNA以保存當時RNA的表達狀態(tài)，是精確/定量研究基因表達分析的重要前提。記得以前學(xué)植物遺傳的同學(xué)常常要帶著液氮罐，騎著單車到田里采樣一一那個液氮罐的蓋子有點問題，一顛就冒白煙，嚇得一路上行人、車輛紛紛躲避，很是招搖，據(jù)說有一次覺得液氮不夠了，趕著坐出租回來，那可是連哄帶騙才上了的士，到學(xué)校時司機已經(jīng)緊張得面無人色了一一這真令貪玩的我們非常羨慕，只恨這等趣事怎么就落不到我們頭上。對當事人來說，每周一次帶著液氮罐到處跑實在不算一種有趣的經(jīng)歷。沒有辦法，為了保持樣品的RNA完整真實，要么當場提RNA,要么液氮保存，一直如此。不過自從有了RNAlater,這種有趣的場面就會越來越少了。RNAlater是特殊的樣品儲存液，只要在采樣后立即將新鮮樣品浸入這種液體試劑，RNlater可以迅速滲透到組織或其他生物樣本中，穩(wěn)定并保護RNA完整而不被降解，確保下游分析得到的數(shù)據(jù)真實反應(yīng)樣品的表達信息。樣品儲存液中保存的新鮮樣品可以在不超過37度的高溫天氣下保存一天，或者在25度室溫下保存一周；或者4度冰箱存放一個月；或者負20度長期保存而使RNA保持完整免受降解。這種技術(shù)為在不同溫度和不同地點下的采樣、運輸和保存樣品提供了極大的方便，同樣適合手術(shù)/解剖過程中部分樣品的保存。RNAlater的用法非常簡單，只要在采樣后立即將樣品完全浸入適量(10ul/1mg組織或者5倍體積)的RNAlater中即可。取樣的動作要盡量快速利索，組織樣品的大小以厚度不超過0.5公分為宜。對于一些小的組織如小鼠的脾、腎等器官則可以整個取出浸入溶液中，較大的則應(yīng)切開為厚度小于0.5公分的小塊，以確保RNAlater能迅速擴散滲透入組織塊中的所有細胞中。采樣的容器應(yīng)該足夠大以容納10倍于組織重量的溶液，避免組織塊擠在一起，同時建議將溶液加滿容器以避免在運輸過程中組織塊露出液面。保存在RNAlater中的樣品RNA可以：37C下穩(wěn)定保存1天18-25C保存7天2-8C穩(wěn)定4周-20C永久保存3.蛋白質(zhì)辛辛苦苦純化得到的那么一點蛋白，可千萬不能因為不懂得怎么保存而白白浪費了！選擇什么樣的貯存方法取決于該蛋白的穩(wěn)定性和你打算保存多長時間以及下一步你打算如何利用。一般來說，蛋白溶液應(yīng)避免極端的pH（強酸or強堿），同時也不能接近其等電點的pH。另外，還應(yīng)該避免其他物質(zhì)的摻入。如果保存時間在24h以內(nèi)，大多數(shù)蛋白可以放置到4C。如果保存時間在24h以上，應(yīng)該考慮避免蛋白溶液長菌，可以事先過濾一下（througha0.22mmfilter）或者加入抑菌的物質(zhì)（如疊氮化鈉）。如果保存時間超過一周，則應(yīng)該將蛋白溶液冷凍起來。通過液氮或干冰冷凍的方法使蛋白溶液迅速冷凍，可以有效避免蛋白的變性。為避免多次凍溶致使蛋白活性降低或變性，應(yīng)該將蛋白溶液分裝保存,一次用多少就取多少。除此之外，還可以加入一些甘油(5-50%(w/v))或者血清(10mg/ml)幫助目的蛋白保持穩(wěn)定。如果打算保存數(shù)月之久，則需要將其放置于-20C,此時要加入一定量甘油，避免“凍傷”。另外，還可以用硫酸鏤將蛋白沉淀置于4c保存(損失較多，不建議采用)；也可以將蛋白以干粉狀態(tài)保存(保存時間最久)。新提取的蛋白可以分裝存在-80度冰箱，保存（保險系數(shù)）1年，如果加入buffer煮過的蛋白在-20保存。最好提取的蛋白，一部分保存，一部分立刻加Buffer煮，做實驗。蛋白的穩(wěn)定性及保存方法一一PIERCE公司技術(shù)資料Proteinscompriseanextremelyheterogeneousclassofbiologicalmacromolecules.Theyareoftenunstablewhennotintheirnativeenvironments,whichcanvaryconsiderablyamongcellcompartmentsandextracellularfluids.Ifcertainbufferconditionsarenotmaintained,extractedproteinsmaynotfunctionproperlyorremainsoluble.Proteinscanloseactivityasaresultofproteolysis,aggregationandsuboptimalbufferconditions.Purified

canvaryfromaproteinsoftenneedtobestoredforanextendedperiodoftimewhileretainingtheiroriginalstructuralintegrityand/oractivity.Theextentofstorage'shelflifecanvaryfromafewdaystomorethanayearandisdependentonthenatuoftheproteinandthestorageconditionsused.Optimalconditionsforstoragearedistinctivetoeachprotein;nevertheless,itispossibletosuggestsomegeneralguidelinesforproteinstorageandstability.Commonconditionsforproteinstoragearesummarizedandcomparedbelow.Generally,therearetradeoffsassociatedwitheachmethod.Forexample,proteinsstoredinsolutionat4Ccanbedispensedconvenientlyasneededbutrequiremorediligencetopreventmicrobialorproteolyticdegradation;suchproteinsmaynotbestableformorethanafewdaysorweeks.Bycontrast,lyophilizationallowsforlong-termstorageofproteinwithverylittlethreatofdegradation,buttheproteinmustbereconstitutedbeforeuseandmaybedamagedbythelyophilizationprocess.

YflldpLCompHiisaiofP*v*dll(iornpvCandiiiKItMr>rmtC小Hei（1|*鼬舊出1L.k:-0—Fraaw-30^toMinL}mpbilua>d上?jhifiiMvik1>1iHfUf*tcnDnib1YtJrsRfqirim?4*riJr修。用itmiM￥c>L^uiUyXo3mjH*“wkb+Obm：Epwl/Will.□rot；iihlyui^ihfct5叫hBUlJlIpkI1I1JC!!□Mr1.Uoi舊[即nProtvnscliduliiiar；PioHmfIklnbllorProlf>eW4rlciu^foufrutrAriouPMKFS^lUidpiOWclrf-iHeivfintidiiieSennejwaten^1nAIAAndpi叫ek1US.nd[jrupqjliHTIupL|gtCHfaCS1匿i\dAprndinnSerine包f《卜/ill!匐面加IITluolpiai*141p.gudEDTAwdEOTA乂磯川loiiTQlWMyOJIttM問：純化后的蛋白質(zhì)4度保存約15天，怎么分子量發(fā)生了變化？答：蛋白質(zhì)樣品如果是溶液狀態(tài)的，在4度下頂多保存一個禮拜。15天太長了。估計分降解成很多小蛋白。電泳時出現(xiàn)很多條帶。在-20度也就是保存一個月。最好的保存辦法還是將蛋白樣品凍干成粉末。保存，這樣保存的時間會很長。如果條件不具備，-70度也可以。蛋白樣品最忌諱反復(fù)凍融。答：蛋白保存應(yīng)根據(jù)對活性的要求及蛋白的種類而定：抗體：除非一些公司特別要求-20C凍存，一般4c可穩(wěn)定一年（無菌，如加疊氮鈉），因為抗體是一種具有非常穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的蛋白；要求具有活性的蛋白，最好根據(jù)需要小量保存4c（一周）、-20C（一個月）、-80C（六個月）、液氮（基本無限期），反復(fù)凍融會導(dǎo)致諸多不良后果，如聚集、修飾、降解、污染等（取決于蛋白濃度、緩沖液成分及蛋白本身的特點）；凍干是一種很好的長期保存法（如條件具備），在大多數(shù)情況下可以很好地保存蛋白的活性，但不適于某些蛋白（因有些蛋白對凍干重溶時必然產(chǎn)生的鹽離子濃度的急劇變化反應(yīng)不佳，其活性會永久喪失（應(yīng)具體對待，尚無規(guī)律可循）。另：蛋白聚集與二硫鍵形成是兩個概念，航基乙醇只負責維持-SH的游離狀態(tài)，形成二硫鍵是一化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生純凈物，聚集一般只通過一些離子鍵、范德華力、疏水力形成，可以用物理方法分開。答：較長時間的保存最好用DTT。在加入緩沖液中24小時內(nèi)，航基乙醇被氧化，其后可加速蛋白的失活，而DTT不危及蛋白質(zhì)的航基。因此，最好是在制備蛋白質(zhì)樣品的時候用大約12mmol/L航基乙醇，而長期儲存則使用1-5mmol/L的DTT。（見《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》）另外，我有印象看產(chǎn)品目錄的時候，看到有一種用于western的試劑盒，提供的試劑可以在還原二硫鍵之后在航基上烷基化，這樣就防止了二硫鍵的再次生成。.抗體抗體儲存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲存的抗體中蛋白濃度很低（10-100Mg/L），就應(yīng)另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在4C-8C條件下，以免凍融對抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng)?？贵w原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20C條件下，并避免反復(fù)凍融。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，應(yīng)絕對避免用高溫快速解凍。被細菌污染的抗體常會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應(yīng)將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉?？贵w經(jīng)真空冷凍干燥后置-20C以下可保存3-5年。保存稀釋后的單抗應(yīng)加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數(shù)稀釋抗體可進行冷凍保存，少數(shù)抗體可能會丟失抗原活性。大多數(shù)單抗，只要蛋白濃度適當，可在4c下保存數(shù)月。其他注意事項：分裝可以最大程度的降低反復(fù)凍融對抗體活性的損害，同時也降低了由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。分裝的量以一次實驗用完為好，最少不能少于10ul每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4oC,避免再凍起來！抗體工作液應(yīng)該當天配制當天用完，在4oC盡量不要超過1天。絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。盡量將抗體保存在冰箱里層，而不是門上。無論是保存還是運輸，絕對避免反復(fù)凍融！反復(fù)凍融會導(dǎo)致抗體變性，導(dǎo)致多聚體形成，從而降低抗體的結(jié)合能力!蛋白在高濃度時更不容易降解(1mg/ml或者更高)，這就是為什么在抗體中加入BSA之類作為穩(wěn)定劑的原因了；另一方面，加入的蛋白也可以減少抗體由于管壁吸附所造成的損失。但是如果抗體要用來標記的話，則不能加入蛋白穩(wěn)定劑，因為這些穩(wěn)定劑會和抗體一起競爭結(jié)合標記物。為了防止微生物污染，疊氮化鈉經(jīng)常被加入到抗體中(終濃度0.02%(w/v))。疊氮化鈉會干擾任何含有氨基基團的偶聯(lián)，因此在進行偶聯(lián)之前，應(yīng)將疊氮化鈉去除。偶聯(lián)后的抗體可以加入疊氮化鈉保存，但是濃度只能是0.01%。對于需要偶聯(lián)的抗體，thimerosal(merthiolate)可以替代疊氮化鈉作為保護劑！注：疊氮化鈉的去除方式：可以通過凝膠電泳或過濾的方式去除！IgG的分子量是150kDa(IgM是?600kDa);疊氮化鈉的分子量只有65Da。使用cutoff14kDa的濾膜即可將疊氮化鈉從抗體中去除。純化IgG:不要保存稀釋的抗體，高濃度有利于保存。IgG會粘附于玻璃或塑料，低于0.1mg/ml的蛋白會很快被吸收并變性失去活性。F面是我的讀書筆記，內(nèi)容全部摘錄自《UsingAntibodies?這本書。該書中專門有HandlingAntibodies這樣一個章節(jié)，對于像我這樣的入門級還是很有啟發(fā)的。首先要樹立的一個觀念是“抗體可一點兒都不脆弱，很強悍的”“Antibodieshaveacompactthree-domainstructurethathasevolvedtoretainactivityinmostbiologicalsettings.Onepracticaladvantageofsuchcompactandstableproteindomainisthattheyareresistanttoabroadrangeofmildlydenaturingconditions,makinglong-termstorageofantibodiesrelativelyeasy.Storagebuffersseldomneedtobesupplementedwithglycerolorotherstabilizingcompoundsthatarecommonlyaddedtohelpmaintaintheactivityofproteinspurifiedinthelab.”經(jīng)常使用的抗體可以4c保存；長期保存可以置于-20C?！癢orkingsolutionsofantibodiesareconvenientlystoredat4c.Atthistemperaturetheyarestableformonthstoyearswithoutlossofactivity.Forlong-termstorage,antibodiescanbekeptconvenientlyat-20℃intheserum,tissueculturesupernatant,orasciticfluidinwhichtheyarecollected.Lowertemperatureswillnothurttheantibodyactivities,butthereisnosignificantadvantageinlower-temperaturestorage.”也有例外，不是所有抗體在4c都穩(wěn)定，有些得在常溫保存Theonlygroupofantibodiesthatshouldnotbestoredat4aretheso-calledcryoproteins,whicharesensitivetolow-temperaturestorage,wheretheyprecipitate.SomemouseantibodiesoftheIgG3subclassmayfitthesecharacteristics.Ifantibodiesprecipitateat4Covertime,theyshouldbekeptatroomtemperaturewithadditionofsodiumazide.”盡管抗體很穩(wěn)定，還是要避免反復(fù)凍融，因為它可能造成抗體活力的喪失。原因是……“Antibodysolutionsshouldnotbefrozenandthawedrepeatedly,becausethiscanleadtodenaturationofantibodiesthatmayleadtounwantedprotein-proteinaggregation.Aggregationofantibodiescancausethelossofactivityduetostericinterferenceoftheantigencombiningsiteorbygeneratinginsolublematerialthatislostduringcentrifugationorfiltration.”抗體到底可以保存多長時間？什么？十年？“Antibodiesareremarkablystable.Iftightlysealedtoavoidevaporation,theycanbestoredat4Cformonthswithnolossofactivity.Antibodiesstoredat-20Chavebeenshowntokeeptheiractivityfordecades.這么強悍！那，抗體到底怕什么?Theonlyproblemcommonlyencounteredinstoringantibodiesiscontaminationofthesesolutionswithbacteriaorfungi.Thiscanbepreventedbyadditionofantimicrobialagents;forexample,byaddingsodiumazideto0.02%or,asanalternative,Merthiolateto0.01%.”何時需要添加疊氮化納？什么時候又不能添加？“Althoughusefulandeffectiveformostsettings,sodiumazideisnotappropriateinsomeassays,becauseitblocksthecytochromeelectrontransportsystemandthereforeistoxictomostorganisms.Inaddition,theprimaryamineontheazidewouldattackthestabilityoftheantibody'sinteractionwithconjugateormatrixincouplingmethods.Ifsodiumazideisalreadypresentinasolution,itcanberemovedbydialysisorgelfiltration.”自己純化的抗體，保存的時候要注意