昆蟲抗性監(jiān)測與治理課件

昆蟲抗性監(jiān)測與治理唐振華中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所昆蟲抗性監(jiān)測與治理唐振華1內容昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況抗藥性機理及其分子基礎抗性早期診斷技術抗性治理策略我們在該領域的研究進展展望內容昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況2抗藥性

昆蟲具有耐受殺死正常種群大部分個體的藥量的能力在其群體中發(fā)展起來的現(xiàn)象。也就是說，在多次使用藥劑后，害蟲對某種藥劑的抗藥力較原來正常情況下有明顯增加的現(xiàn)象，其特點是這種由使用藥劑而增大的抗藥力，是可以遺傳的。有些昆蟲對某些殺蟲劑表現(xiàn)一種天然的敏感度低，即具有高度耐受性，我們把這種先天性的抗藥能力稱為自然抗性(natureresistance)1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況抗藥性昆蟲具有耐受殺死正常種群大部分個體的藥量的能力3交互抗性

昆蟲對一種藥劑發(fā)生抗性后往往對其它沒有使用過的藥劑也發(fā)生抗性，這叫做“交互抗性”(crossresistance)。一般來講，作用機理機同的殺蟲劑易產(chǎn)生交互抗性。因為產(chǎn)生交互抗性的原因主要是由某些殺蟲劑的作用機理或代謝機理類同所致。也就是說，由于其抗性機理相同可對不同殺蟲劑產(chǎn)生交互抗性。1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況交互抗性昆蟲對一種藥劑發(fā)生抗性后往往對其它沒有使4負交互抗性

負交互抗性(negativecrossresistance)是指昆蟲對一種殺蟲劑發(fā)生抗性后對另一種殺蟲劑的敏感度反而上升的現(xiàn)象。1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況負交互抗性負交互抗性(negativecros5多種抗性

多種抗性(multipleresistance)指昆蟲對同時使用的幾種殺蟲劑產(chǎn)生抗性的現(xiàn)象，但這種抗性對幾種殺蟲劑的保護機制是不同的，切勿與交互抗性相混淆。區(qū)別這兩種抗性是很重要的，因為一個特殊的交互抗性型常能提供與抗性機制有關的信息。1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況多種抗性多種抗性(multipleresist6抗性發(fā)展的現(xiàn)況

據(jù)不完全統(tǒng)計至2003年，已報道對殺蟲劑和殺螨劑產(chǎn)生抗性的昆蟲和螨有548種，抗性蟲種分布于15個不同的目：蜱螨目、蛛形目、鞘翅目、革翅目、雙翅目、蝣目、半翅目、同翅目、膜翅目、鱗翅目、脈翅目、直翅目、虱目、蚤目和纓翅目，其中最多的是雙翅目、蜱螨類、鱗翅目、鞘翅目和同翅目昆蟲，這5個目的抗性蟲種約占全部抗性蟲種的90%以上。其中對殺蟲劑和殺螨劑產(chǎn)生抗性最多的蟲種是蠅、蚊，其次為螨、蜱、蝶，蛾、甲蟲和半翅目昆蟲(包括蚜蟲、蟬、葉蟬、飛虱、介蟲和粉虱)。自20世紀60年代發(fā)現(xiàn)害蟲和害螨的抗藥性以來，具有抗性藥性的害蟲和害螨種類數(shù)量在不斷地增加，特別是在70年代以后，20世紀昆蟲和螨類產(chǎn)生抗性的情況見下圖1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況抗性發(fā)展的現(xiàn)況據(jù)不完全統(tǒng)計至2003年，已報道對7

抗性事例數(shù)(蟲種化合物)

昆蟲和螨的種類數(shù)

殺蟲劑和殺螨劑化合物數(shù)

在昆蟲和螨中報告產(chǎn)生抗性的增長情況

1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況

抗性事例數(shù)(蟲種化合物)

昆蟲和螨的種類數(shù)

殺蟲劑和殺螨8orderNumberofresistantspeciesPercentoftotalnumberofresistantspecies（548）Diptera

18434Acari8315Lepidoptera8215Coleptera7313Homoptera5811total48088

Mostresistantarthropodorderstoinsecticidesoracaricides1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況orderNumberofresistantspeci9Mostresistantarthropodspeciestoinsecticidesoracaricides

SpeciesNumberofpesticides

Tetranychusurticae72Plutellaxylostella69Myzuspersicae68Boophilusmicroplus41Leptinotarsadecemlineata40Panonychusulmi40Blattellagermanica39Heliothisvirescens37Muscadomestica36Triboliumcastaneum341.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況Mostresistantarthropodspeci10

殺蟲劑的作用及抗性機理

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示殺蟲劑抗性的主要機理

2.抗藥性機理及其分子基礎殺蟲劑的作用及抗性機理2.抗11昆蟲應用的各種反應，具有代謝各種有機化合物的能力。它們的代謝物通常具有更大的親水性(一般低毒或無毒)，這樣易于排出體外。許多抗性昆蟲抵抗殺蟲劑的能力明顯增加，加速代謝殺蟲劑，使這些殺蟲劑變?yōu)闊o毒或低毒化合物，從而使殺蟲劑無法到達作用部位，由此而產(chǎn)生的抗性稱為代謝抗性(metabolicresistance)這是昆蟲的一種重要抗性機理。這類代謝能力增高是由于解毒酶的上調節(jié)(up-regulation)所致。這種上調節(jié)的增加可由細胞色素P450s和/或GSTs的轉錄過表達，或由水解酶基因的擴增所致。

代謝抗性2.抗藥性機理及其分子基礎昆蟲應用的各種反應，具有代謝各種有機化合物的能力。它12代謝抗性相關的三大酶系酯酶（Est）P450單加氧酶(P450s)，又稱多功能氧化酶(MFOs)谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)2.抗藥性機理及其分子基礎代謝抗性相關的三大酶系酯酶（Est）2.抗藥性機理及其分子13代謝抗性的分子機理尖音庫蚊(Culexpipiens)對有機磷殺蟲劑的抗性主要涉及3個等位基因，其中2個基因座為Est-2(或酯酶B)和Est-3(或酯酶A)，它們是編碼解毒羧酸酯的水解酶的酯酶基因，賦予酯酶過量產(chǎn)生的抗性等位基因。至今在酯酶B基因座發(fā)現(xiàn)有6個不同的同種異酶(allozymes)：B1、B2、B4、B5、B6和B7；在酯酶A基因座有4個不同的同種異酶：A1、A2、A4和A5。這2個酯酶基因座是緊密連鎖的，之間由2~6kb的基因間隔的DNA片段把它們分隔開。同種異酶是指相同基因位點上不同等位基因所編碼的不同形式的酶。第三個基因座是Ace1，編碼乙酰膽堿酯酶，是一個敏感度降低（不敏感）的等位基因。2.抗藥性機理及其分子基礎代謝抗性的分子機理尖音庫蚊(Cule14

與殺蟲劑的結合能力的增加,從而減少到達靶標部位殺蟲劑的量加速殺蟲劑的代謝?？剐岳ハx中的酯酶量的改變2.抗藥性機理及其分子基礎與殺蟲劑的結合能力的增加,抗性昆蟲中的酯酶量的改變2.15酯酶的過量的分子機理酯酶的過量產(chǎn)生是由2種獨立的機理引起的。第一種機理是基因擴增，既可是酯酶B基因座擴增，又可是酯酶A基因座擴增，在某些情況下還可是酯酶A和B基因座一起擴增。后者是2個酯酶基因座共擴增(co-amplification)。

第二種機理為基因調節(jié)(generegulation)，用以解釋酯酶A1的過量產(chǎn)生。但是，除了基因擴增外，還有基因調節(jié)可貢獻于其他變異體的過量產(chǎn)生。

2.抗藥性機理及其分子基礎酯酶的過量的分子機理酯酶的過量產(chǎn)生是由2種獨立的機理引起的。16抗性昆蟲中的酯酶質的改變

與有機磷抗性相關的酯酶除了量的變化外，還存在質的變化。這種質的變化的基礎可能涉及酯酶的結構改變，從而增加其降解殺蟲劑的能力例如:家蠅和銅綠蠅中色氨酸(Try)突變?yōu)榱涟彼?Leu)2.抗藥性機理及其分子基礎抗性昆蟲中的酯酶質的改變與有機磷抗性相關的酯酶除了17在抗性昆蟲中P450的過表達抗性蟲種(品系)過表達的P450參考文獻抗性家蠅(Rutgers)CYP6A1Carino等，1992；1994?？剐约蚁?LeranPyrR)CYP6D1Scott等，1996。

抗性果蠅CYP6A2Waters等,1992;Brun等,1996?？剐怨塁YP6A9Maitra等，1996。

抗性棉鈴蟲CYPB2Xiao-Ping和Hobbs,1995。吳峻等，1999?？剐詿熝恳苟闏YP4G8Pittendrigh等,1997。

CYP9A1Rose等，1997。2.抗藥性機理及其分子基礎在抗性昆蟲中P450的過表達抗性蟲種(品系)18抗性昆蟲中GST酶量的改變基因擴增基因轉錄速率加快尚未發(fā)現(xiàn)GST酶的質的改變2.抗藥性機理及其分子基礎抗性昆蟲中GST酶量的改變基因擴增2.抗藥性機理及其分子基19靶標抗性

靶標敏感度降低是昆蟲產(chǎn)生靶標抗性的第二種主要機理。一般來講，殺蟲劑進入昆蟲體內經(jīng)活化，或未被代謝的殺蟲劑與靶標分子、靶標蛋白結合互相作用，改變其功能，結果產(chǎn)生中毒癥狀，最后死亡。由于抗性昆蟲的靶標分子發(fā)生了變化，從而降低其與毒劑的結合作用，或降低與殺蟲劑的作用，這種因敏感性降低而產(chǎn)生的抗性。稱為靶標部位抗性(或靶標抗性)(target-siteresistance)。

2.抗藥性機理及其分子基礎靶標抗性靶標敏感度降低是昆蟲產(chǎn)生靶標抗性的第二種20殺蟲劑作用的主要靶標有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標

乙酰膽堿酯酶(AChE)滴滴涕和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用靶標

鈉離子通道環(huán)戊二烯類殺蟲劑的作用靶標

-氨基丁酸(GABA)受體氯離子通道

2.抗藥性機理及其分子基礎殺蟲劑作用的主要靶標有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標21靶標抗性的分子機理乙酰膽堿酯酶敏感度降低(InsensitiveAChE)GABA受體突變(GABAreceptormutation)電壓門控鈉離子通道突變(mutationsinthevoltage-gatedsodiumchannel)2.抗藥性機理及其分子基礎靶標抗性的分子機理乙酰膽堿酯酶敏感度降低(Insensiti22

品系115199303368位置

SaltilloSerValAlaTyr突變

BygdeaPheValAlaPhePierrefeuPheThrAlaPheMH19PheIleGlyTyrSensitivePheIleGlyPhe

果蠅AChE基因（Ace中的抗性突變）2.抗藥性機理及其分子基礎乙酰膽堿酯酶敏感度降低

23

家蠅抗性品系中發(fā)現(xiàn)的氨基酸點突變

抗性品系突變位點49R G365ACH2 G262AF327Y77M V180L G262A F327Y690ab G262V F327YCT V180L G262A F327YYBOL

V180L G262V F327YSH-PR V180LG262V F327YD422V

2.抗藥性機理及其分子基礎家蠅抗性品系中發(fā)現(xiàn)的氨基酸點突變2.抗藥性機理及其分子基24抗性比抗性比果蠅單個和組合突變(以單字母氨基酸符號表示)對AChE抗性的影響

2.抗藥性機理及其分子基礎抗性比抗性比果蠅單個和組合突變(以單字母氨基酸符號表示)對A25

AChE敏感度降低的埃及伊蚊Ace基因的定向突變

2.抗藥性機理及其分子基礎

2.抗藥性機理及其分子基礎26GABA受體突變(GABAreceptormutation)

RDLGABA受體亞基的四個跨膜區(qū)（黑色矩形）和保守的半胱氨酸橋（C=C），將每二個跨膜區(qū)（M2）放大可見抗性突變位點S丙氨酸(Aly)絲氨酸(Ser)2.抗藥性機理及其分子基礎GABA受體突變(GABAreceptormutatio27電壓門控鈉離子通道突變

鈉通道結構的模式圖[(a)根據(jù)表25.6中所列文獻；圖(b)、(c)仿Vais等(2001)修改]a表示多種昆蟲與kdr抗性相關的突點位置[圖中編碼是根據(jù)家蠅para序列(見GenBankX96668)；b表示離子孔周圍跨膜螺旋片段的方向；c表示根據(jù)誘變和光親和性標記試驗所表明的部分麻醉劑(localanesthetics,LA)、雙鞭甲藻毒素(brevetoxin,pbTx)和擬除蟲菊酯(pyrethroids,Py)與S5和S6片段結合部位位置的放大示意圖。

2.抗藥性機理及其分子基礎電壓門控鈉離子通道突變28醫(yī)昆kdr型抗性涉及的突變及其在Na+通道中的部位結構域kdr突變部位蟲種文獻結構域ⅠS4-S5內環(huán)

I253VDmLee和Soderlund(2001)N端(ⅠS6-ⅡS1

接頭)的ⅠS6處D58GBgLiu等(2000)近ⅠS6處

E4334KBg

Liu等(2000)近ⅡS1處

C764RBg

Liu等(2000)結構域Ⅱ

S6L1014FMdWilliamson等(1996)S6L1014FHiGuerrero等(1997)S6L1014FAgMartinez-Torres等(1998)S6L1014FCpMartinez-Torres等(1999b)

S6L1014SCpMartiney-Torres等(1999b)

AgRanson等(2000)

S6L1029HHvPark等(2000)S4-S5內環(huán)

M918T*MdWilliamson等(1996)

HiGuerrero等(1997)PcLee等(2000)

S6L993FBgDong等(1997);Liu等(2000)2.抗藥性機理及其分子基礎醫(yī)昆kdr型抗性涉及的突變及其在Na+通道中的部位2.抗藥29結構域Ⅲ

S6M1524IDmLee和Soderlund(2001)S6M1536IDmDoyle等(1998)S6F1550IBmPittendrigh等(1997);He等(1999)S5-S6A1494VDmPittendrigh等(1997)S5-S6V1410ADmPittendrigh等(1997)ⅢⅣ5′端

結構域ⅣS65′端P1880IBgLiu等(2000)Dm：黑腹果蠅(D.melanogaster)Md：

家蠅(M.domestica)

Cp：尖音庫蚊(C.pipiens)Ag：岡比亞按蚊(A.gambiae)Bg：德國小蠊(B.germanica)Hi：搔擾角蠅(H.irritans)Pc：頭虱(P.capitis)Bm：微小牛蜱(B.microplus)*super-kdr突變

結構域kdr突變部位蟲種文獻2.抗藥性機理及其分子基礎結構域Ⅲ結構域k30抗性早期診斷技術

在通常情況下，在田間防治失效時，抗性已是比較高了，只能換用無交互抗性的殺蟲劑。抗性治理只有在抗性基因頻率較低時才有效，所以必須對抗性種群進行抗性監(jiān)測。

3.抗性早期診斷技術抗性早期診斷技術在通常情況下，在田間防治失效時，31區(qū)分劑量（discriminatingdosage）

技術首先獲得該蟲種的SS個體，即敏感純合子品系，對某種殺蟲劑的敏感度基線(base-linedata)，然后用該品系的LC99.9(或LD99.9)的劑量處理，存活的個體即為RS和RR個體。該方法的缺點是：①要通過遺傳雜交的方法來純化品系，較繁瑣、費時；②難以真正完全區(qū)分RS和RR個體；若RS呈隱性，則無法將SS和RS分開；③無法了解其抗性機理。3.抗性早期診斷技術區(qū)分劑量（discriminatingdosage）

技術32

F1代與SS(曲線a)或與RR(曲線b)回交后的分離情況“a”具有典型的1:1分離，“b”沒有明顯的診斷劑量3.抗性早期診斷技術F1代與SS(曲線a)或與RR(曲線b)回交后的分離情況333

基于酯酶的測定方法(1)

應用高效液相層析(high-performanceliquidchromatography,HPLC)測定單個蚊蟲的酯酶活性。酯酶水解模型底物-醋酸萘酯為醋酸和-萘酚，后者與染料固藍鹽B反應生成一種藍紫色物質(λ=550~600nm)，用分光光度測定，以其光密度為酯酶活性。Pasteur和Georghiou（1989）根據(jù)這個原理，發(fā)展了測定單個昆蟲的酯酶濾紙快速測定法。即取單個昆蟲勻漿液（磷酸緩沖液）少許，點滴于濾紙上（在此濾紙為攜酶的載體），然后浸入含有--醋酸萘酯（底物）的磷酸緩沖液1min后取出，再浸入含有顯色劑的染色液，晾干后對色斑的大小和強度進行測定和比較。

3.抗性早期診斷技術

基于酯酶的測定方法(1)

應用高效液相層析(h34

微量滴度酶標板法（microtiterplateassay）測定了單個煙芽夜蛾幼蟲的酯酶活性。測定底物為以對硝基苯乙酸(p-nitrophenylacetate,PNPA)。酶液制備：取單個幼蟲中腸，加500L勻漿緩沖液，用Polytron勻漿10s。然后進一步勻漿(1000g,2min)，上清液為酶源。酶源以1:150比例用0.1mg/L磷酸鈉緩沖液(pH7.6)稀釋，保溫液含100L稀釋的酶液和0.5mmol/LPNPA,最終容積為200L。應用Thermomax微量滴度板酶標儀在30℃，405nm處進行檢測。每15s測定一次反應，總共測定15min保溫期。用96孔酶標板為載體，依次在每孔穴中加入一定量的底物（-醋酸萘酯）和單個昆蟲的酶液，在室溫保溫30min后，加入顯色劑，置于便攜式酶標儀下對96孔板讀數(shù)（microtiterplateassay）。

上述的2種方法的優(yōu)點是能快速、準確地測定與酯酶活性增高相關的抗性個體。缺點是無法區(qū)分由酯酶性質改變而引起的抗性。

基于酯酶的測定方法(2)

3.抗性早期診斷技術微量滴度酶標板法（microtit35基于P450單加氧酶的(微量)滴

度酶標板測定方法

應用對硝基茴香醚（p-nitroanisole，PNA）或甲氧基試鹵靈（methoxyresorufin，MRR）作為P450加氧酶的底物。酶液制備用單個昆蟲中腸在500L勻漿液中勻漿10s，然后離心（1000g,2min），上清液作為酶源。保溫液為75L勻漿液，10LNADPH再生系統(tǒng)[0.25mmol/LNADP+、2.5mmol/L葡萄糖-6-磷酸、1個單位葡糖-6-磷酸脫氧酶（glucose6-phosphatedehydrogenase，G6PD）]和1~5mmol/LPNA，最終體積為200L。然后用Thermomax微量滴度酶標板讀數(shù)儀在30℃，405nm測定

3.抗性早期診斷技術基于P450單加氧酶的(微量)滴

度酶標板測定方法36

基于GST的快速測定法

GST活性生化測定比較復雜，而且要用分光光度計等儀器才能測定。最近Vontas等（2000）發(fā)展了一種簡便的定量測定的GST活性的方法，也可用于單個昆蟲的測定。在測定中應用GSH和CDNB在一個固定時間內獲得線性的酶反應后，在化學計量上應用碘(滴度)法（iodometrictitration）測定游離的GSH，最后從不同的顏色范圍獲得測定結果。即用碘的滴度來測定GSH。用淀粉作為內指示劑，因為在淀粉溶液中碘化汞抑制GST活性，終止酶反應。Brogdon和Barber(1990)應用微量滴度板測定了單個蚊蟲的GST活性。

3.抗性早期診斷技術

基于GST的快速測定法

GST活性生37基于乙酰膽堿酯酶的測定方法

以模型底物乙酰硫代膽堿碘化物和5,5′-二硫-雙（2-硝基苯酸）進行Ellman反應(Ellman等，1961),在存在少量AChE時產(chǎn)生黃色（OD412）。這種技術可用于檢測不敏感的AChE。如果單個昆蟲的樣品一分為二，一個樣品在反應混合液中含有一個診斷濃度的殺蟲劑；而另一個樣品的反應液中僅含有底物（無殺蟲劑），根據(jù)有無產(chǎn)生黃色，則可區(qū)分不同敏感性的變異體。

這種技術在幾種昆蟲中已作了測定，并運用動力學軟件作了進一步改進，采用微量孔板讀數(shù)系統(tǒng)（microplatereadersystem）進行自動檢測，可檢測單個昆蟲的抗性基因型。斑點印跡（dot-blot）檢測技術也已用于檢測田間抗性個體的AChE。

3.抗性早期診斷技術基于乙酰膽堿酯酶的測定方法以模型底物乙酰硫代38

基于Kdr的電生理測定方法

應用電生理技術檢測Kdr。通常運用昆蟲的神經(jīng)肌肉制備體來測定自發(fā)性微小興奮性后突觸電位（miniatureexcitatorypostsynapticpotentials，mEPSPs）和對不同濃度的擬除蟲菊酯或滴滴涕殺蟲劑反應引發(fā)的興奮性后突觸電位（EPSPs）。細胞內記錄顯示擬除蟲菊酯誘發(fā)mEPSP活性增加，而EPSP值下降，而在抗性昆蟲中要高濃度才能誘發(fā)。然后與敏感昆蟲相比較，就能檢測有無Kdr存在。3.抗性早期診斷技術

基于Kdr的電生理測定方法

應用電39基于PCR的抗性檢測的診斷技術特異性等位基因的PCR擴增（PCRamplificationofspecificalleles，PASA）單鏈構象多態(tài)性分析（singlestrandedconformationalpolymorphism,SSCP）PCR限制性內切酶核苷酸(PCRrestrictionendonucleasenucleotide,PCR/REN)分析法（詳見唐振華和畢強編著的《殺蟲劑作用的分子行為》，2003）3.抗性早期診斷技術基于PCR的抗性檢測的診斷技術特異性等位基因的PCR擴增（P40抗性種群的演化4.出抗性治理策略抗性種群的演化4.出抗性治理策略41

影響抗性演化的主要因子

遺傳學

生物學/生態(tài)學操作

4.出抗性治理策略影響抗性演化的主要因子遺傳學4.出抗性治理策略42遺傳學1.抗性等位基因頻率

2.抗性等位基因數(shù)目

3.抗性等位基因的顯性

4.外顯性(penetrance)、表達性(expressivity)、抗性等位基因的相互作用

5.過去使用其它殺蟲劑的選擇作用

6.抗性基因組與適合度因子整合作用的程度，即抗性基因型和表現(xiàn)型在有或無殺蟲劑時的適合度(fitness)4.出抗性治理策略遺傳學1.抗性等位基因頻率

2.抗性等位基因數(shù)目

3.抗性43生物學/生態(tài)學

生物/生態(tài)學1.繁殖力，包括世代的長短和每代的蟲數(shù)

2.單配性/多配性；孤雌生殖

3.氣候和其它生態(tài)條件行為1.隔離；移動性；遷飛

2.單食性/多食性

3.幸存；庇護4.出抗性治理策略生物學/生態(tài)學

生物/生態(tài)學1.繁殖力，包括世代的長短和每代44操作因子

化合物1.殺蟲劑的化學性質

2.用藥歷史

3.殺蟲劑的殘效期

4.劑型施藥情況1.施藥的限閾

2.選擇限閾

3.施藥時的蟲期（卵、幼蟲或成蟲）

4.限制防治空間

5.施藥方式

6.用藥次數(shù)4.出抗性治理策略操作因子

化合物1.殺蟲劑的化學性質

2.用藥歷史

3.殺蟲45抗性治理的策略根據(jù)不同的具體情況分為3類：①適度治理（managementbymoderation）②飽和治理（managementbysaturation）③復合作用治理（managementbymultipleattack）。

術語“適度”和“飽和”主要是指防治時所用藥劑的劑量而言?！皬秃献饔谩边@個術語用來表示長期或短期的多種作用的化學選擇壓?？傊玫膭┝繎M可能保留種群中的敏感基因。這3類措施并不是完全孤立的，在同一個防治計劃中，這些措施可互相滲透。這完全取決于所處的實際情況。4.出抗性治理策略抗性治理的策略根據(jù)不同的具體情況分為3類：4.出抗性治理策略46抗性治理的化學防治策略適度治理飽和治理復合作用治理低劑量，留一部分敏感基因型個體；減少殺蟲劑使用次數(shù)；應用殘效期短的藥劑；避免使用緩釋劑；定向選擇成蟲；局部而不是全面施藥；某一代或留下一部分種群不處理；保持“庇護所”；提高防治限閾使用高劑量，使R基因表達功能隱性；用增效劑抑制解毒機制藥劑混用；藥劑輪用；藥劑鑲嵌式交替防治換用改變靶標的新藥劑；殺蟲劑的劑型工藝4.出抗性治理策略抗性治理的化學防治策略適度治理飽和治理復合作用治理低47我組在該領域的研究進展

建立抗性演化的模擬系統(tǒng)5.研究進展我組在該領域的研究進展建立抗性演化的模擬系統(tǒng)5.48抗性演化的模擬系統(tǒng)

5.研究進展抗性演化的模擬系統(tǒng)5.研究進展49抗性由同一基因座上的兩個等位基因R和S控制的抗性害蟲種群在一種殺蟲劑作用下，種群個體的基因型可分成RR、RS和SS三種形式。根據(jù)群體遺傳學原理，在平衡種群中，三種基因型個體各自所占的比例分別為p2、2pq和q2。因此，Nt+1=Nt+1RR+Nt+1RS+Nt+1SS={(1-qc)[dbα+(1-bn)W1]pt2Nt(1-de)(1-de)+df2Mi}exp[rRR(1-Mtp/K)]+{2(1-qc)[hbn+(1-bn)W2]ptqtNt(1-dc)+2hf(1-f)Mi}exp[rRS(1-Mt/K)]+{(1-qc)[bα+(1-bα)W3]qt2Nt(1-de)(1-dc)+(1-f)2Mi}exp[rss(1-Mt/K)]Mi=[W1Pt2+2W2ptqt+W3qt2(1-bn)+[(dpt2+2hptqt+qt2)bn]Nt(1-de)(1-de)qtNa=[(W1pt2+2W2ptqt+W3qt2)(1-bn)+(dpt2+2hptqt+W3qt2)bn](1-dc)(1-de)qcMt=[(W1pt2+2W2ptqt+W3qt2)(1-bn)+dpt2+2hptqt+qt2)bα]Nt(1-dc)(1-dc)-Na+Mi[df2+2hf(1-f)+(1-f)2]Pt+1=(2Nt+1RR+Nt+1RS)/2Nt+15.研究進展抗性由同一基因座上的兩個等位基因R和S控制的抗性害蟲種群在一50害蟲種群在以下模擬情況下不同的世代用藥策略處理后的R基因頻率變化N0:起始種群大??；P0：起始基因頻率；K：環(huán)境容量。A：逐代處理（單劑）；B：兩種殺蟲劑輪用；C：與增效劑混用；D：兩種殺蟲劑混用；E：兩種殺蟲劑鑲嵌式防治。世代R基因頻率計算機模擬5.研究進展害蟲種群在以下模擬情況下不同的世代世代R計算機模擬5.研究51抗性昆蟲的適合度

適合度（fitness）是指昆蟲的生存和繁殖能力，可以通過測定壽命、發(fā)育期間的死亡率和單性和兩性的生殖率來獲得。相對適合度是通過測定抗性品系的能力與混合種群中敏感品系的能力相比較而得。

5.研究進展抗性昆蟲的適合度適合度（fitness）是指昆蟲52停止篩選F34F56LC50(mg/L))淡色庫蚊在用馬拉硫磷汰選和停止汰選后對馬拉硫磷的抗性演化

5.研究進展停止篩選F34F56LC50(mg/L)53

不同基因型的適合度

基因型相對適合度

SS1.0RS0.65RR0.65.研究進展不同基因型的適合度5.54淡色庫蚊抗性品系涉及的抗性機理及其特點

抗性品系抗性機理遺傳特點

馬拉硫磷（RM）羧酸酯酶活性提高（26倍）單因子敵百蟲(RD)表皮穿透作用降低，酯酶量增高，螯合作用(sequestration)雙因子氰戊菊酯酯酶活性增高；P450s；Kdr多因子

（RF）5.研究進展淡色庫蚊抗性品系涉及的抗性機理及其特點

馬拉硫磷（RM）55抗性治理策略的驗證

運用增效劑殺蟲劑的輪用殺蟲劑的混用

鑲嵌式防治

5.研究進展抗性治理策略的驗證5.研究進展56

抗性模型昆蟲在模擬試驗中的運用

模擬試驗模式簡圖5.研究進展抗性模型昆蟲在模擬試驗中的運用模57運用增效劑用馬拉硫磷及其與增效劑IBP混用逐代處理后對馬拉硫磷抗性的變化5.研究進展運用增效劑用馬拉硫磷及其與增效劑IBP混用逐代處理5.研究58用馬拉硫磷及其與增效劑IBP混用逐代處理后羧

酸酯酶活性的變化（A為幼蟲，B為雌成蚊）

5.研究進展用馬拉硫磷及其與增效劑IBP混用逐代處理后羧5.研究進展59殺蟲劑的輪用與混用馬拉硫磷和敵百蟲輪用和混用對抗性的影響

A對馬拉硫磷的抗性演化B對敵百蟲抗性的演化

5.研究進展殺蟲劑的輪用與混用馬拉硫磷和敵百蟲輪用和混用對抗性的影響5.60鑲嵌式防治5.研究進展以馬拉硫磷和氰戊菊酯作鑲嵌式防治模擬處理的示意圖

鑲嵌式防治5.研究進展以馬拉硫磷和氰戊菊酯作鑲嵌式61以馬拉硫磷和氰戊菊酯鑲嵌式模擬處理后的抗性演化A：對馬拉硫磷的抗性演化。B：對氰戊菊酯的抗性演化。Rm為以馬拉硫磷逐代汰選的品系；Rmf為以馬拉硫磷和氰戊菊酯鑲嵌式汰選的亞品系;Rf為以氰戊菊酯逐代汰選的品系。

5.研究進展以馬拉硫磷和氰戊菊酯鑲嵌式模擬處理后的抗性演化5.研究進展626.展望抗性監(jiān)測(早期診斷)抗性基因的調控和基因治療的研究研究抗性媒介害蟲與疾病的關系根據(jù)抗性變構的靶標進行生物合理設計,研制反抗性化合物6.展望抗性監(jiān)測(早期診斷)63Thankyouforyourattention!!Thankyouforyourattention!!64昆蟲抗性監(jiān)測與治理唐振華中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所昆蟲抗性監(jiān)測與治理唐振華65內容昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況抗藥性機理及其分子基礎抗性早期診斷技術抗性治理策略我們在該領域的研究進展展望內容昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況66抗藥性

昆蟲具有耐受殺死正常種群大部分個體的藥量的能力在其群體中發(fā)展起來的現(xiàn)象。也就是說，在多次使用藥劑后，害蟲對某種藥劑的抗藥力較原來正常情況下有明顯增加的現(xiàn)象，其特點是這種由使用藥劑而增大的抗藥力，是可以遺傳的。有些昆蟲對某些殺蟲劑表現(xiàn)一種天然的敏感度低，即具有高度耐受性，我們把這種先天性的抗藥能力稱為自然抗性(natureresistance)1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況抗藥性昆蟲具有耐受殺死正常種群大部分個體的藥量的能力67交互抗性

昆蟲對一種藥劑發(fā)生抗性后往往對其它沒有使用過的藥劑也發(fā)生抗性，這叫做“交互抗性”(crossresistance)。一般來講，作用機理機同的殺蟲劑易產(chǎn)生交互抗性。因為產(chǎn)生交互抗性的原因主要是由某些殺蟲劑的作用機理或代謝機理類同所致。也就是說，由于其抗性機理相同可對不同殺蟲劑產(chǎn)生交互抗性。1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況交互抗性昆蟲對一種藥劑發(fā)生抗性后往往對其它沒有使68負交互抗性

負交互抗性(negativecrossresistance)是指昆蟲對一種殺蟲劑發(fā)生抗性后對另一種殺蟲劑的敏感度反而上升的現(xiàn)象。1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況負交互抗性負交互抗性(negativecros69多種抗性

多種抗性(multipleresistance)指昆蟲對同時使用的幾種殺蟲劑產(chǎn)生抗性的現(xiàn)象，但這種抗性對幾種殺蟲劑的保護機制是不同的，切勿與交互抗性相混淆。區(qū)別這兩種抗性是很重要的，因為一個特殊的交互抗性型常能提供與抗性機制有關的信息。1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況多種抗性多種抗性(multipleresist70抗性發(fā)展的現(xiàn)況

據(jù)不完全統(tǒng)計至2003年，已報道對殺蟲劑和殺螨劑產(chǎn)生抗性的昆蟲和螨有548種，抗性蟲種分布于15個不同的目：蜱螨目、蛛形目、鞘翅目、革翅目、雙翅目、蝣目、半翅目、同翅目、膜翅目、鱗翅目、脈翅目、直翅目、虱目、蚤目和纓翅目，其中最多的是雙翅目、蜱螨類、鱗翅目、鞘翅目和同翅目昆蟲，這5個目的抗性蟲種約占全部抗性蟲種的90%以上。其中對殺蟲劑和殺螨劑產(chǎn)生抗性最多的蟲種是蠅、蚊，其次為螨、蜱、蝶，蛾、甲蟲和半翅目昆蟲(包括蚜蟲、蟬、葉蟬、飛虱、介蟲和粉虱)。自20世紀60年代發(fā)現(xiàn)害蟲和害螨的抗藥性以來，具有抗性藥性的害蟲和害螨種類數(shù)量在不斷地增加，特別是在70年代以后，20世紀昆蟲和螨類產(chǎn)生抗性的情況見下圖1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況抗性發(fā)展的現(xiàn)況據(jù)不完全統(tǒng)計至2003年，已報道對71

抗性事例數(shù)(蟲種化合物)

昆蟲和螨的種類數(shù)

殺蟲劑和殺螨劑化合物數(shù)

在昆蟲和螨中報告產(chǎn)生抗性的增長情況

1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況

抗性事例數(shù)(蟲種化合物)

昆蟲和螨的種類數(shù)

殺蟲劑和殺螨72orderNumberofresistantspeciesPercentoftotalnumberofresistantspecies（548）Diptera

18434Acari8315Lepidoptera8215Coleptera7313Homoptera5811total48088

Mostresistantarthropodorderstoinsecticidesoracaricides1.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況orderNumberofresistantspeci73Mostresistantarthropodspeciestoinsecticidesoracaricides

SpeciesNumberofpesticides

Tetranychusurticae72Plutellaxylostella69Myzuspersicae68Boophilusmicroplus41Leptinotarsadecemlineata40Panonychusulmi40Blattellagermanica39Heliothisvirescens37Muscadomestica36Triboliumcastaneum341.昆蟲抗藥性及其現(xiàn)況Mostresistantarthropodspeci74

殺蟲劑的作用及抗性機理

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示殺蟲劑抗性的主要機理

2.抗藥性機理及其分子基礎殺蟲劑的作用及抗性機理2.抗75昆蟲應用的各種反應，具有代謝各種有機化合物的能力。它們的代謝物通常具有更大的親水性(一般低毒或無毒)，這樣易于排出體外。許多抗性昆蟲抵抗殺蟲劑的能力明顯增加，加速代謝殺蟲劑，使這些殺蟲劑變?yōu)闊o毒或低毒化合物，從而使殺蟲劑無法到達作用部位，由此而產(chǎn)生的抗性稱為代謝抗性(metabolicresistance)這是昆蟲的一種重要抗性機理。這類代謝能力增高是由于解毒酶的上調節(jié)(up-regulation)所致。這種上調節(jié)的增加可由細胞色素P450s和/或GSTs的轉錄過表達，或由水解酶基因的擴增所致。

代謝抗性2.抗藥性機理及其分子基礎昆蟲應用的各種反應，具有代謝各種有機化合物的能力。它76代謝抗性相關的三大酶系酯酶（Est）P450單加氧酶(P450s)，又稱多功能氧化酶(MFOs)谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)2.抗藥性機理及其分子基礎代謝抗性相關的三大酶系酯酶（Est）2.抗藥性機理及其分子77代謝抗性的分子機理尖音庫蚊(Culexpipiens)對有機磷殺蟲劑的抗性主要涉及3個等位基因，其中2個基因座為Est-2(或酯酶B)和Est-3(或酯酶A)，它們是編碼解毒羧酸酯的水解酶的酯酶基因，賦予酯酶過量產(chǎn)生的抗性等位基因。至今在酯酶B基因座發(fā)現(xiàn)有6個不同的同種異酶(allozymes)：B1、B2、B4、B5、B6和B7；在酯酶A基因座有4個不同的同種異酶：A1、A2、A4和A5。這2個酯酶基因座是緊密連鎖的，之間由2~6kb的基因間隔的DNA片段把它們分隔開。同種異酶是指相同基因位點上不同等位基因所編碼的不同形式的酶。第三個基因座是Ace1，編碼乙酰膽堿酯酶，是一個敏感度降低（不敏感）的等位基因。2.抗藥性機理及其分子基礎代謝抗性的分子機理尖音庫蚊(Cule78

與殺蟲劑的結合能力的增加,從而減少到達靶標部位殺蟲劑的量加速殺蟲劑的代謝?？剐岳ハx中的酯酶量的改變2.抗藥性機理及其分子基礎與殺蟲劑的結合能力的增加,抗性昆蟲中的酯酶量的改變2.79酯酶的過量的分子機理酯酶的過量產(chǎn)生是由2種獨立的機理引起的。第一種機理是基因擴增，既可是酯酶B基因座擴增，又可是酯酶A基因座擴增，在某些情況下還可是酯酶A和B基因座一起擴增。后者是2個酯酶基因座共擴增(co-amplification)。

第二種機理為基因調節(jié)(generegulation)，用以解釋酯酶A1的過量產(chǎn)生。但是，除了基因擴增外，還有基因調節(jié)可貢獻于其他變異體的過量產(chǎn)生。

2.抗藥性機理及其分子基礎酯酶的過量的分子機理酯酶的過量產(chǎn)生是由2種獨立的機理引起的。80抗性昆蟲中的酯酶質的改變

與有機磷抗性相關的酯酶除了量的變化外，還存在質的變化。這種質的變化的基礎可能涉及酯酶的結構改變，從而增加其降解殺蟲劑的能力例如:家蠅和銅綠蠅中色氨酸(Try)突變?yōu)榱涟彼?Leu)2.抗藥性機理及其分子基礎抗性昆蟲中的酯酶質的改變與有機磷抗性相關的酯酶除了81在抗性昆蟲中P450的過表達抗性蟲種(品系)過表達的P450參考文獻抗性家蠅(Rutgers)CYP6A1Carino等，1992；1994?？剐约蚁?LeranPyrR)CYP6D1Scott等，1996。

抗性果蠅CYP6A2Waters等,1992;Brun等,1996?？剐怨塁YP6A9Maitra等，1996。

抗性棉鈴蟲CYPB2Xiao-Ping和Hobbs,1995。吳峻等，1999。抗性煙芽夜蛾CYP4G8Pittendrigh等,1997。

CYP9A1Rose等，1997。2.抗藥性機理及其分子基礎在抗性昆蟲中P450的過表達抗性蟲種(品系)82抗性昆蟲中GST酶量的改變基因擴增基因轉錄速率加快尚未發(fā)現(xiàn)GST酶的質的改變2.抗藥性機理及其分子基礎抗性昆蟲中GST酶量的改變基因擴增2.抗藥性機理及其分子基83靶標抗性

靶標敏感度降低是昆蟲產(chǎn)生靶標抗性的第二種主要機理。一般來講，殺蟲劑進入昆蟲體內經(jīng)活化，或未被代謝的殺蟲劑與靶標分子、靶標蛋白結合互相作用，改變其功能，結果產(chǎn)生中毒癥狀，最后死亡。由于抗性昆蟲的靶標分子發(fā)生了變化，從而降低其與毒劑的結合作用，或降低與殺蟲劑的作用，這種因敏感性降低而產(chǎn)生的抗性。稱為靶標部位抗性(或靶標抗性)(target-siteresistance)。

2.抗藥性機理及其分子基礎靶標抗性靶標敏感度降低是昆蟲產(chǎn)生靶標抗性的第二種84殺蟲劑作用的主要靶標有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標

乙酰膽堿酯酶(AChE)滴滴涕和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用靶標

鈉離子通道環(huán)戊二烯類殺蟲劑的作用靶標

-氨基丁酸(GABA)受體氯離子通道

2.抗藥性機理及其分子基礎殺蟲劑作用的主要靶標有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標85靶標抗性的分子機理乙酰膽堿酯酶敏感度降低(InsensitiveAChE)GABA受體突變(GABAreceptormutation)電壓門控鈉離子通道突變(mutationsinthevoltage-gatedsodiumchannel)2.抗藥性機理及其分子基礎靶標抗性的分子機理乙酰膽堿酯酶敏感度降低(Insensiti86

品系115199303368位置

SaltilloSerValAlaTyr突變

BygdeaPheValAlaPhePierrefeuPheThrAlaPheMH19PheIleGlyTyrSensitivePheIleGlyPhe

果蠅AChE基因（Ace中的抗性突變）2.抗藥性機理及其分子基礎乙酰膽堿酯酶敏感度降低

87

家蠅抗性品系中發(fā)現(xiàn)的氨基酸點突變

抗性品系突變位點49R G365ACH2 G262AF327Y77M V180L G262A F327Y690ab G262V F327YCT V180L G262A F327YYBOL

V180L G262V F327YSH-PR V180LG262V F327YD422V

2.抗藥性機理及其分子基礎家蠅抗性品系中發(fā)現(xiàn)的氨基酸點突變2.抗藥性機理及其分子基88抗性比抗性比果蠅單個和組合突變(以單字母氨基酸符號表示)對AChE抗性的影響

2.抗藥性機理及其分子基礎抗性比抗性比果蠅單個和組合突變(以單字母氨基酸符號表示)對A89

AChE敏感度降低的埃及伊蚊Ace基因的定向突變

2.抗藥性機理及其分子基礎

2.抗藥性機理及其分子基礎90GABA受體突變(GABAreceptormutation)

RDLGABA受體亞基的四個跨膜區(qū)（黑色矩形）和保守的半胱氨酸橋（C=C），將每二個跨膜區(qū)（M2）放大可見抗性突變位點S丙氨酸(Aly)絲氨酸(Ser)2.抗藥性機理及其分子基礎GABA受體突變(GABAreceptormutatio91電壓門控鈉離子通道突變

鈉通道結構的模式圖[(a)根據(jù)表25.6中所列文獻；圖(b)、(c)仿Vais等(2001)修改]a表示多種昆蟲與kdr抗性相關的突點位置[圖中編碼是根據(jù)家蠅para序列(見GenBankX96668)；b表示離子孔周圍跨膜螺旋片段的方向；c表示根據(jù)誘變和光親和性標記試驗所表明的部分麻醉劑(localanesthetics,LA)、雙鞭甲藻毒素(brevetoxin,pbTx)和擬除蟲菊酯(pyrethroids,Py)與S5和S6片段結合部位位置的放大示意圖。

2.抗藥性機理及其分子基礎電壓門控鈉離子通道突變92醫(yī)昆kdr型抗性涉及的突變及其在Na+通道中的部位結構域kdr突變部位蟲種文獻結構域ⅠS4-S5內環(huán)

I253VDmLee和Soderlund(2001)N端(ⅠS6-ⅡS1

接頭)的ⅠS6處D58GBgLiu等(2000)近ⅠS6處

E4334KBg

Liu等(2000)近ⅡS1處

C764RBg

Liu等(2000)結構域Ⅱ

S6L1014FMdWilliamson等(1996)S6L1014FHiGuerrero等(1997)S6L1014FAgMartinez-Torres等(1998)S6L1014FCpMartinez-Torres等(1999b)

S6L1014SCpMartiney-Torres等(1999b)

AgRanson等(2000)

S6L1029HHvPark等(2000)S4-S5內環(huán)

M918T*MdWilliamson等(1996)

HiGuerrero等(1997)PcLee等(2000)

S6L993FBgDong等(1997);Liu等(2000)2.抗藥性機理及其分子基礎醫(yī)昆kdr型抗性涉及的突變及其在Na+通道中的部位2.抗藥93結構域Ⅲ

S6M1524IDmLee和Soderlund(2001)S6M1536IDmDoyle等(1998)S6F1550IBmPittendrigh等(1997);He等(1999)S5-S6A1494VDmPittendrigh等(1997)S5-S6V1410ADmPittendrigh等(1997)ⅢⅣ5′端

結構域ⅣS65′端P1880IBgLiu等(2000)Dm：黑腹果蠅(D.melanogaster)Md：

家蠅(M.domestica)

Cp：尖音庫蚊(C.pipiens)Ag：岡比亞按蚊(A.gambiae)Bg：德國小蠊(B.germanica)Hi：搔擾角蠅(H.irritans)Pc：頭虱(P.capitis)Bm：微小牛蜱(B.microplus)*super-kdr突變

結構域kdr突變部位蟲種文獻2.抗藥性機理及其分子基礎結構域Ⅲ結構域k94抗性早期診斷技術

在通常情況下，在田間防治失效時，抗性已是比較高了，只能換用無交互抗性的殺蟲劑?？剐灾卫碇挥性诳剐曰蝾l率較低時才有效，所以必須對抗性種群進行抗性監(jiān)測。

3.抗性早期診斷技術抗性早期診斷技術在通常情況下，在田間防治失效時，95區(qū)分劑量（discriminatingdosage）

技術首先獲得該蟲種的SS個體，即敏感純合子品系，對某種殺蟲劑的敏感度基線(base-linedata)，然后用該品系的LC99.9(或LD99.9)的劑量處理，存活的個體即為RS和RR個體。該方法的缺點是：①要通過遺傳雜交的方法來純化品系，較繁瑣、費時；②難以真正完全區(qū)分RS和RR個體；若RS呈隱性，則無法將SS和RS分開；③無法了解其抗性機理。3.抗性早期診斷技術區(qū)分劑量（discriminatingdosage）

技術96

F1代與SS(曲線a)或與RR(曲線b)回交后的分離情況“a”具有典型的1:1分離，“b”沒有明顯的診斷劑量3.抗性早期診斷技術F1代與SS(曲線a)或與RR(曲線b)回交后的分離情況397

基于酯酶的測定方法(1)

應用高效液相層析(high-performanceliquidchromatography,HPLC)測定單個蚊蟲的酯酶活性。酯酶水解模型底物-醋酸萘酯為醋酸和-萘酚，后者與染料固藍鹽B反應生成一種藍紫色物質(λ=550~600nm)，用分光光度測定，以其光密度為酯酶活性。Pasteur和Georghiou（1989）根據(jù)這個原理，發(fā)展了測定單個昆蟲的酯酶濾紙快速測定法。即取單個昆蟲勻漿液（磷酸緩沖液）少許，點滴于濾紙上（在此濾紙為攜酶的載體），然后浸入含有--醋酸萘酯（底物）的磷酸緩沖液1min后取出，再浸入含有顯色劑的染色液，晾干后對色斑的大小和強度進行測定和比較。

3.抗性早期診斷技術

基于酯酶的測定方法(1)

應用高效液相層析(h98

微量滴度酶標板法（microtiterplateassay）測定了單個煙芽夜蛾幼蟲的酯酶活性。測定底物為以對硝基苯乙酸(p-nitrophenylacetate,PNPA)。酶液制備：取單個幼蟲