16s-rRNA基因技術(shù)在油藏微生物研究的應(yīng)用1研究背景

厭氧微生物的探討方法與技術(shù)單擊此處添加標(biāo)題文字市政工程：16srRNA基因技術(shù)在油藏微生物探討的應(yīng)用分子生態(tài)學(xué)探討方法234書目：傳統(tǒng)探討方法厭氧微生物介紹11.厭氧微生物的定義：厭氧微生物尚無公認(rèn)的精確定義，但通常認(rèn)為這是一類只能在低氧分壓的條件下生長，而不能在空氣（18%氧氣）和（或）10％二氧化碳濃度下的固體培育基表面生長的微生物。第一章、厭氧微生物介紹嚴(yán)格厭氧微生物：氧氣對其有毒性厭氧微生物兼性厭氧微生物：有氧無氧條件下都可生存。第一章、厭氧微生物介紹2.幾種厭氧微生物的圖片：1.厭氧微生物探討方法背景：厭氧微生物是整個(gè)微生物世界的一個(gè)重要組成部分。但由于厭氧微生物難于培育其相關(guān)的技術(shù)始終未得到很好的開發(fā)利用，但隨著近二十多年隨著厭氧操作技術(shù)的不斷完善，厭氧微生物探討方法的不斷改進(jìn)，尤其近十多年來很多新技術(shù)和方法的應(yīng)用，致使厭氧微生物學(xué)取得很大的進(jìn)展，獲得了豐碩的成果。其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2、常見的幾種傳統(tǒng)探討技術(shù)與方法：

其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法一般厭氧技術(shù)嚴(yán)格厭氧技術(shù)厭氧微生物傳統(tǒng)研究技術(shù)與方法其他厭氧技術(shù)其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2.1一般厭氧技術(shù)：厭氧袋厭氧罐一般厭氧技術(shù)其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2.1.1厭氧袋技術(shù)：依據(jù)氫“燃燒”除氧的原理所設(shè)計(jì)的一種簡易厭氧袋，不但適用于培育各種臨床標(biāo)本中的厭氧菌，也適合培育其他專性厭氧菌。其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2.1.1.1厭氧袋技術(shù)原理：利用氫硼化鈉(NaBH4)或氫硼化鉀(KBH4)與水反應(yīng)產(chǎn)生氫，氫與密封袋中的氧氣在把催化下結(jié)合成水，從而建立起無氧小環(huán)境。1厭氧袋中二氧化碳由下列反應(yīng)供應(yīng):檸檬酸+3NaH003一檸檬酸鈉+3H2O+3CO22利用美藍(lán)的變色反應(yīng)作為厭氧度的指示劑。厭氧環(huán)境則指示劑呈無色，有O2則變?yōu)樗{(lán)色。也有用刃天青指示劑。3其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2.1.2厭氧罐技術(shù)：厭氧罐的商品名為Jar，一種小型的培育厭氧菌的密封容器。國外的名牌有“Gaspak”、“Tobal”、“BTL”、“Donwhitley”等厭氧罐。使厭氧罐達(dá)到無氧狀態(tài)有多種方法，例如，用抽氣換氣法以氮或二氧化碳驅(qū)除罐內(nèi)氧氣;在各種不同的除氧方法中，獲得最快速發(fā)展和廣泛運(yùn)用的是利用含把(或鉑)的常溫催化劑使氫與氧發(fā)生“燃燒”以達(dá)到除氧的方法。其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2.1.2.1厭氧罐技術(shù)構(gòu)造：罐體目前最廣泛運(yùn)用的厭氧罐體都是接受透亮的聚碳酸醋硬質(zhì)塑料制成。常見的規(guī)格是內(nèi)徑為15Cm，高25cm的圓筒形罐體，其內(nèi)可放直徑gcm培育皿10只;在蓋的下方中心，旋連著一個(gè)金屬絲網(wǎng)盒，用于存放活化的鈀粒H2和CO2的供應(yīng)厭氧罐供氫和CO2有內(nèi)源法和外源法兩種。內(nèi)源法相像于厭氧袋。外源法抽氣換氣程序?yàn)?抽氣-換氣一再抽氣一充N2一CO2一H2催化劑和厭氧指示劑一般用常溫下即可起催化的“冷式”催化劑，如“鈀粒”等，它是由含鈀的石棉等填充料加工而成的。每次運(yùn)用前，把催化劑都應(yīng)在140一160℃烘箱內(nèi)烘2h活化。指示劑為美藍(lán)。其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2.1.2.2厭氧罐技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1、沒有厭氧分別操作系統(tǒng)。2、對厭氧菌進(jìn)行恒溫厭氧培育時(shí)，要將厭氧罐放置到另一個(gè)恒溫培育箱(不如BugBox等厭氧工作站便利，能二者兼顧)。3、對厭氧菌培育的好壞不易視察。4、因?yàn)閷⒚芊庀到y(tǒng)啟開取出視察，勢必造成厭氧環(huán)境被破壞。1、目前已廣泛運(yùn)用在醫(yī)院啤酒廠等場所。2、敏捷、簡潔。3、與厭氧袋對比，某些厭氧罐法也接受外源H2和CO2，相對而言便利、省時(shí)，易操作。其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2.2嚴(yán)格厭氧技術(shù)：有區(qū)分于一般厭氧技術(shù)，為了培育嚴(yán)格厭氧微生物而開發(fā)的嚴(yán)格厭氧技術(shù)對厭氧環(huán)境要求更為嚴(yán)格。其所能供應(yīng)的厭氧環(huán)境更為嚴(yán)格。目前主要技術(shù)厭氧手套箱法(如英國Ruskinn厭氧工作站）其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2.2.1厭氧手套箱技術(shù)：以Ruskinn的厭氧工作站為例：這種厭氧手套箱工作站匯合分別純化操作、恒溫培育、便利視察等傳統(tǒng)厭氧袋或罐所不具備的功能于一體且產(chǎn)品的類型包括專性厭氧、微好氧和低氧(次氧)的系列培育條件，充分滿足當(dāng)代微生物學(xué)家及專業(yè)人士對厭氧培育應(yīng)具備的功能多樣化和產(chǎn)品系列化的綜合要求。其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2.2.2厭氧手套箱技術(shù)原理：

基本原理相同于傳統(tǒng)的厭氧罐、厭氧袋，但Ruskinn的厭氧工作站作了較科學(xué)的改進(jìn)，從而使其確保了比傳統(tǒng)厭氧罐或厭氧袋更嚴(yán)格的厭氧環(huán)境。1、供氣系統(tǒng)接受外源供氣(一個(gè)單瓶供氣)，氣體為無氧混合氣體;也可選雙氣供氣，即多加一個(gè)氮?dú)馄浚@種消耗更為經(jīng)濟(jì)。2、催化劑系統(tǒng)Ruskinn厭氧工作站各型號均接受特殊處理的把催化劑，省去了每次運(yùn)用后的活化步驟，該催化劑可運(yùn)用一年以上。其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法3、恒濕系統(tǒng)Ruskim:厭氧工作站對傳統(tǒng)厭氧罐的吸濕系統(tǒng)作了很大改進(jìn)。如：concept400厭氧工作站在操作室頂部裝了一個(gè)恒濕器，當(dāng)濕度高于設(shè)定值時(shí)，該恒濕器自動(dòng)除濕;當(dāng)環(huán)境濕度低于設(shè)定值時(shí)，該裝置將收集到冷凝水蒸發(fā)，以提高環(huán)境的濕度。其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2.2.3厭氧手套箱技術(shù)特點(diǎn)：工作容量大，工作室可放置多達(dá)550個(gè)90mm的培養(yǎng)皿，2可調(diào)節(jié)的高密度熒光燈和鹵素觀察燈，由腳動(dòng)開關(guān)控制。4快速轉(zhuǎn)移閘裝置可保證在45秒內(nèi)轉(zhuǎn)移40多個(gè)90mm培養(yǎng)皿33符合人類環(huán)境改造學(xué)設(shè)計(jì)原理31其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2.2.4厭氧手套箱技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：①厭氧培育技術(shù)的多功能性:與傳統(tǒng)的厭氧罐對比，厭氧工作站能在其工作箱中進(jìn)行高質(zhì)量的厭氧菌的分別、純化、培育，且易視察(不用解除厭氧環(huán)境)。②快速和高質(zhì)量地分別效果:通過袖式裸手操作系統(tǒng)和快速氣閘轉(zhuǎn)移系統(tǒng)可快速操作和分別厭氧菌。而傳統(tǒng)厭氧罐或厭氧袋沒有分別操作空間。其次章、厭氧微生物的傳統(tǒng)探討方法2.3其他厭氧技術(shù)：1、生物耗氧法2、亨蓋特厭氧滾管技術(shù)3、皰肉培育基第三章、分子生態(tài)學(xué)探討方法1.分子生態(tài)學(xué)引入背景：（1）傳統(tǒng)的厭氧微生物分別培育方法不能滿足厭氧微生物原位識別及形態(tài)學(xué)探討的須要,并且在多樣性和動(dòng)力學(xué)探討方面還存在著嚴(yán)峻的局限性：①培育過程困難耗時(shí);②只能反映顯微鏡條件下極少部分(<10%)的菌落數(shù)。（2）近10年發(fā)展起來的以分子生物學(xué)方法為基礎(chǔ)的分子生態(tài)學(xué),大大拓寬了厭氧微生物生態(tài)學(xué)的探討視野,使之可以更客觀、更干脆地探厭煩氧微生物種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及其與環(huán)境間的相互關(guān)系。第三章、分子生態(tài)學(xué)探討方法2.分子生態(tài)學(xué)技術(shù)：1、核酸探針檢測技術(shù)2、利用引物的PCR技術(shù)3、DNA序列分析4、基因芯片技術(shù)第三章、分子生態(tài)學(xué)探討方法2.1核酸探針檢測技術(shù)：2.1.1原理：以核酸分子雜交技術(shù)為核心,利用探針分析DNA序列及片段長度多態(tài)性.2.1.2探針：能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸片段。3、PCR產(chǎn)物或人工合成的寡核苷酸探針2、從RNA制備cDNA探針1、長探針和短探針探針類型：第三章、分子生態(tài)學(xué)探討方法2.1.3應(yīng)用方向：（1）應(yīng)用于對環(huán)境中的厭氧微生物的檢測,定性、定量分析它們的存在、分布、豐度和適應(yīng)性等探討目標(biāo)。（2）作為一種能高度靈敏檢測污染環(huán)境下厭氧微生物種群變更的方法。第三章、分子生態(tài)學(xué)探討方法2.2利用引物的PCR技術(shù)：2.2.1簡介：1985年,Mullis獨(dú)創(chuàng)了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù),即以一對特定的寡核苷酸片段為引物,在耐熱的TaqDNA聚合酶作用下,體外合成特異的DNA片段,在數(shù)小時(shí)內(nèi)可將目的基因擴(kuò)增上百萬倍.2.2.2意義：使得在困難環(huán)境中,對那些混合物內(nèi)低含量的群體成員或微生物群中某個(gè)特異基因的檢測與探討成為可能.PCR技術(shù)分類：1)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)2）競爭PCR(C-PCR)3）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)第三章、分子生態(tài)學(xué)探討方法2.3DNA序列分析技術(shù)：最充分揭示DNA多樣性的方法是DNA序列分析.尤其是熒光標(biāo)記的核酸自動(dòng)測序儀的普遍運(yùn)用,同時(shí)隨著分子信息學(xué)的發(fā)展,已有很多功能基因及特地的rDNA序列數(shù)據(jù)庫軟件供序列比較,使核基因的序列分析可揭示更高水平多態(tài)性.生態(tài)學(xué)上用的最多的是“通用”引物擴(kuò)增DNA某些基因(如rDNA)的DNA片段,隨后用通用引物干脆測序.第三章、分子生態(tài)學(xué)探討方法2.4基因芯片技術(shù)：2.4.1簡介：基因芯片(Microarray)技術(shù)于1991年首次在Science雜志上被提出,是生物芯片(Biochip)的一種。該技術(shù)是隨著人類基因組支配的逐步實(shí)施和分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展而產(chǎn)生的。在短短的10多年時(shí)間里基因芯片的探討和應(yīng)用取得了巨大的進(jìn)步?；蛐酒夹g(shù)分類：1、含有編碼關(guān)于不同生物化學(xué)循環(huán)過程關(guān)鍵酶的功能基因芯片。2、含有源于核糖體核酸(rRNA)基因探針的系統(tǒng)發(fā)育的寡核苷酸芯片3、用純培育微生物的整個(gè)DNA基因組構(gòu)建的群落基因組芯片第三章、分子生態(tài)學(xué)探討方法2.4.2技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：

與傳統(tǒng)的多孔膜核酸雜交技術(shù)相比,玻片等為載體的基因芯片供應(yīng)了更多的優(yōu)點(diǎn),如高密度、高靈敏度、快速實(shí)時(shí)檢測、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化和低背景水同等第四章、16srRNA基因技術(shù)在油藏微生物探討的應(yīng)用1.探討背景：（1）厭氧微生物采油技術(shù)(MEOR)技術(shù)相對其它的3次采油技術(shù)具有成本低、適用范圍廣、環(huán)境相對友好等優(yōu)點(diǎn)而備受重視（2）作為地下生物圈的組成部分,油藏微生物（主要是厭氧微生物）不僅在元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中起著重要作用,其獨(dú)特的生理生化特征及微生物產(chǎn)生的酶和其他代謝產(chǎn)物在生物技術(shù)上具有巨大應(yīng)用潛力第四章、16srRNA基因技術(shù)在油藏微生物探討的應(yīng)用2.油藏微生物類群：微生物類群鐵還原菌發(fā)酵菌硝酸鹽還原菌產(chǎn)甲烷古菌等硫酸鹽還原菌第四章、16srRNA基因技術(shù)在油藏微生物探討的應(yīng)用3.技術(shù)原理：（3)16SrRNA基因的全序列分為可變區(qū)和恒定區(qū)兩部分,可變區(qū)序列因不同細(xì)菌而異,恒定區(qū)序列基本保守。可以利用恒定區(qū)序列擴(kuò)增，利用可變區(qū)序列的差異來對不同屬、種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。（2)16SrDNA分子結(jié)構(gòu)上高度保守,只在某些位置有少量的核苷酸序列變更,而且這些位置的變更有屬或種特異性。其所含信息較多,長度又較適中，更適合于微生物分子生態(tài)的探討。（1)rRNA存在于全部的生物中,rRNA是細(xì)菌和真核細(xì)胞核糖體的基本組成部分。第四章、16srRNA基因技術(shù)在油藏微生物探討的應(yīng)用4.探討方法：微生物分子生態(tài)學(xué)方法多是建立在對SSURNA基因,特殊是16SrDNA分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)探討的基礎(chǔ)上,其常用探討方法如圖所示第四章、16srRNA基因技術(shù)在油藏微生物探討的應(yīng)用5.探討實(shí)例：（1）Agne′sGrabowski等通過地質(zhì)化學(xué)方法、常規(guī)可培育方法和分子生態(tài)學(xué)方法探討了低溫低鹽未注水油藏微生物多樣性,并發(fā)覺可培育的厭氧菌(同型產(chǎn)乙酸菌、硝酸鹽還原菌、硫酸鹽還原菌、產(chǎn)甲烷古菌)在其群落中占優(yōu)勢,同型產(chǎn)乙酸菌數(shù)量超過硫酸鹽還原菌和乙酸養(yǎng)分型產(chǎn)甲烷古菌.（2）程海鷹等接受PCR-DGGE分析了油田采出水富集培育物的群落結(jié)構(gòu)（3）佘躍惠等對油田的進(jìn)出水油藏微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分子分析.小結(jié)：上述分子生物學(xué)探討手段的出現(xiàn)雖然極大地提升了厭氧微生物生態(tài)學(xué)的探討水平,但是傳統(tǒng)厭氧微生物培育方法照舊是環(huán)境微生物生態(tài)探討不行或缺的重要手段,其作用不行忽視。參考文獻(xiàn)：[1]田揚(yáng)捷,楊虹,吳秀娟,等.綜合應(yīng)用ITS及16SrDNA進(jìn)行環(huán)境微生物生態(tài)探討[J].微生物學(xué)通報(bào),2004,31(4):85-88.[2]段景杰,趙亞杰,呂振山.DNA檢測技術(shù)及其在微生物采油中的應(yīng)用[J].油田化學(xué),2003,20(2):192-196.[3]鐘鳴,周啟星.2002.微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)及其在環(huán)境污