免疫組織化學(xué)(免疫組化)技術(shù)

WORD格式專業(yè)資料整理免疫組織化學(xué)〔免疫組化〕技術(shù)利用抗原抗體的特異性結(jié)合反響來檢測和定位組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)的一門技術(shù)，它是免疫學(xué)和傳統(tǒng)的組織化學(xué)相結(jié)合而形成的，這種技術(shù)稱免疫組織化學(xué)〔immunohistochemistryIHC〕或免疫細(xì)胞化學(xué)〔immunocytochemistry〕。其特點(diǎn)是將形態(tài)學(xué)改變與功能，代謝變化結(jié)合起來，直接在組織切片，細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上定位一些蛋白質(zhì)或多肽物質(zhì)的存在，并可準(zhǔn)確到亞細(xì)胞構(gòu)造水平，結(jié)合電子計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)或激光掃描共聚焦顯微術(shù)等技術(shù)，可對被檢物質(zhì)進(jìn)展定量分析。第一節(jié)免疫組化的開展史及應(yīng)用1941年Coons及其同事首創(chuàng)免疫組織化學(xué)技術(shù)以來，拌隨免疫學(xué)和組織化學(xué)理論與技術(shù)的開展，免疫組織化學(xué)已發(fā)生了日新月異的變化。如下表免疫組化的開展過程年代研究者事件1941Coons實(shí)用免疫螢光技術(shù)1948Fagraeus進(jìn)一步開展免疫螢光技術(shù)1970Sternberger抗體酶標(biāo)技術(shù)1974Taylor證實(shí)組織中漿細(xì)胞免疫組化1975Kohler單克隆抗體技術(shù)〔被成為免疫學(xué)上的一場革命，Milstein也使人類第一次獲得了能按照人的意志在體外產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞〕。1981HsuABC法1990至今SP法、原位雜交免疫組化技術(shù)由于免疫組化具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等顯著特點(diǎn)，且能將形態(tài)與功能研究有機(jī)的結(jié)合在一起，所以，這門技術(shù)從一誕生起就顯示出了強(qiáng)大的生命力和廣闊的應(yīng)用前景，現(xiàn)今它已被廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的許多領(lǐng)域，推動(dòng)了學(xué)科的開展，取得了令人矚目的成就。免疫組織化學(xué)染色技術(shù)的應(yīng)用隨著大量商品化的單克隆和多可隆抗體出現(xiàn)，配套試劑盒的使用及方法的不斷完善，使免疫組化染色已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)根底研究和病理外檢中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)手段之一。免疫組化可用于各種蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)表達(dá)水平的檢測，細(xì)胞屬性的判定，淋巴細(xì)胞的免疫表型分析，細(xì)胞增殖和凋亡的研究，激素受體和耐藥基因蛋白表達(dá)檢測，以及細(xì)胞周期和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究等。在病理學(xué)研究中，免疫組化技術(shù)的作用和意義更重要。以腫瘤研究為例，在免疫組化技術(shù)出現(xiàn)以前，對腫瘤的診斷和分類還局限于細(xì)胞水平，而引入免疫組化技術(shù)后，那么使研究的深度提高到了生物化學(xué)水平、分子水平。近年來，拌隨基因探針研究而興起的核酸分子原位雜交技術(shù)也正在蓬勃開展，更使免疫組化如虎添翼，兩者相得益彰，將研究推進(jìn)到了基因水平。越來越多的癌基因與抗癌基因WORD格式專業(yè)資料整理1WORD格式專業(yè)資料整理的發(fā)現(xiàn)不僅有助于對腫瘤發(fā)生機(jī)制的探討，而且使腫瘤的預(yù)防，早期診斷，甚至治療都向前邁進(jìn)了一大步，為人類征服癌癥代來了希望的曙光。在國外，病理診斷免疫組化開場于70年代，80年代開展至頂峰，90年代已列入病理技術(shù)室常規(guī)工作。在國內(nèi)，免疫組化到90年代才開場在病理診斷中逐漸普及。第二節(jié)免疫組化的根本原理根本原理：眾所周知，抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組織化學(xué)正是利用這一特性，即先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細(xì)胞中的抗原物質(zhì)。反之亦然。由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反響部位顯示出來，以期到達(dá)對組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)展定性、定位甚至定量的研究。如前所述，免疫組化主要涉及免疫學(xué)和組織化學(xué)的有關(guān)理論和技術(shù)，其中關(guān)鍵在于制備高效的抗體，后者又主要取決于抗原的質(zhì)量。組織或細(xì)胞中但凡能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)展檢測。在抗體制備上，經(jīng)歷了從抗血清，純化IgG到單克隆抗體，甚至開展到應(yīng)用基因重組技術(shù)獲得分子量較小的特異性片段。就單克隆抗體而言，它是在1975年由Kohler和Milstein建立了雜交瘤技術(shù)后才開場問世的，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于研究中，它具有更好的特異性，大大地提高了免疫組化的技術(shù)水平。顯示技術(shù)的開展也相當(dāng)迅猛，早期只是簡單的將標(biāo)記物結(jié)合在抗體上，以后那么開展到將標(biāo)記物結(jié)合在抗抗體上或與抗體具有特異親和性的分子上，用于標(biāo)記的物質(zhì)有很多種，如熒光染料、放射性同位素、酶、膠體金等。借助于熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡，就可觀察到這些標(biāo)記物發(fā)出熒光、酶促反響產(chǎn)生的有色沉淀或高電子密度顆粒，從而觀察到抗原抗體復(fù)合物所再的部位。由此可見，免疫組化技術(shù)以其特異性和靈敏度高等特點(diǎn)，又因其操作比較簡便而得以廣泛應(yīng)用。第三節(jié) 有關(guān)的免疫學(xué)理論抗原〔antigen〕：抗原應(yīng)具備的條件： ①異物性②理化性質(zhì)③特異性抗原的種類： ①免疫原性與免疫反響性完全抗原WORD格式專業(yè)資料整理2WORD格式專業(yè)資料整理不完全抗原②抗原與機(jī)體的親緣關(guān)系異種抗原同種異型抗原自身抗原③抗原的化學(xué)構(gòu)造蛋白質(zhì)抗原多糖抗原核酸抗原低分子量物質(zhì)抗原合成多肽抗原④抗原的理化性狀顆粒性抗原可溶性抗原抗原的制備：材料的準(zhǔn)備和預(yù)處理組織的粉碎抗原的提取抗原純化抗原純度的檢測半抗原的免疫原制備法抗體〔antibody〕——是機(jī)體受抗原刺激后，由B淋巴細(xì)胞，特別是漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生反響的球蛋白，稱免疫球蛋白immunolobulin,Ig〕,共有五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,主要分布在血清或外分泌物中?？贵w的分子構(gòu)造抗體的理化性質(zhì)抗體與抗原的特異性結(jié)合抗體的種類抗體的抗原性：同種型抗體同種異型抗體獨(dú)特型抗體抗體的制備方法：多克隆抗體〔血清抗體〕——指機(jī)體承受抗原的主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫后，從血清中別離提純的抗體。單克隆抗體——是 1975年由Kohler和Milstein創(chuàng)造的一種新技術(shù)。WORD格式專業(yè)資料整理3WORD格式專業(yè)資料整理原理是將體外培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交細(xì)胞。這種融合的雜交細(xì)胞系既有骨髓瘤細(xì)胞無限生長的能力，又有漿細(xì)胞分泌單一抗體的能力。這種免疫細(xì)胞通過純化，成為單克隆系，就能產(chǎn)生大量專一的高純度的抗體，既單克隆抗體。這一技術(shù)被稱為免疫學(xué)上的一場革命，也使人類第一次獲得了能按照人的意志在體外產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞?！蚕橐妶D解〕WORD格式專業(yè)資料整理4WORD格式專業(yè)資料整理單克隆抗體與多克隆的特性比較見下表:單克隆抗體與多克隆的特性比較特性單克隆抗體多克隆抗體組成單一類的抗體多種類抗體的混合物特異性高，針對單一抗原決定簇低，針對多個(gè)抗原決定簇親合力不定，較低平均親和力較高穿插反響低高第四節(jié) 免疫組化的根本技術(shù)根據(jù)標(biāo)記物〔或示蹤物〕不同可分為以下技術(shù)：免疫熒光組化技術(shù)免疫酶組化技術(shù)親合免疫組化技術(shù)免疫膠體金組化技術(shù)免疫鐵蛋白技術(shù)還有雙重和多重標(biāo)記技術(shù)等。不同的免疫組化技術(shù)，各具有獨(dú)特的試劑和方法，但其根本技術(shù)方法是相似的，都包括抗體的制備，組織材料的處理，免疫染色，對照試驗(yàn)，顯微鏡觀察等步驟。(一)免疫熒光組化技術(shù)根本原理根據(jù)抗原抗體反響原理，先將的抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體作為探針與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗原結(jié)合，在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本〔熒光素受熒光顯微鏡激發(fā)光的照射而發(fā)出一定波長的熒光〕，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)展定量分析。分類直接法間接法補(bǔ)體法雙重免疫熒光標(biāo)記法直接法——用熒光標(biāo)記的特異性〔對細(xì)胞或組織內(nèi)抗原〕抗體〔第一抗體〕直接與標(biāo)本反響〔染色〕，以檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原。如圖WORD格式專業(yè)資料整理5WORD格式專業(yè)資料整理特點(diǎn)：操作簡單，特異性高，但敏感性低，且由于一種熒光標(biāo)記抗體只能檢測一種特異性抗原，所以應(yīng)用X圍較這窄。染色步驟:⒈石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。冰凍切片、涂片、印片或培養(yǎng)細(xì)胞等材料經(jīng)適當(dāng)固定。⒉必要時(shí)用酶適當(dāng)消化。⒊用PH7.4PBS洗15分鐘。⒋滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體，室溫或37℃孵育箱內(nèi)孵育30—60分鐘。⒌用PBS洗3次，5分鐘/次。⒍用50%甘油〔用PH9.0碳酸鹽緩沖液配制〕封片⒎熒光顯微鏡下觀察。間接法——此法是直接法的重要改良，先用特異性〔對細(xì)胞或組織內(nèi)抗原〕抗體〔或稱第一抗體〕與細(xì)胞標(biāo)本反響，隨后用緩沖液洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體〔也稱第二抗體〕與結(jié)合在抗原上的抗體〔是第二抗體的抗原〕結(jié)合，形成抗原—抗體—熒光抗體的復(fù)合物。如圖WORD格式專業(yè)資料整理6WORD格式專業(yè)資料整理由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原上每個(gè)分子結(jié)合3～5個(gè)分子的抗體，當(dāng)此抗體作為抗原時(shí)又可結(jié)合3～5個(gè)分子的熒光抗體，所以和直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)3或4倍。特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，應(yīng)用更廣，只需要制備熒光標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔即可應(yīng)用于多種抗體〔第一抗體〕的標(biāo)記顯示。染色步驟：⒈石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。冰凍切片、涂片、印片或培養(yǎng)細(xì)胞等材料經(jīng)適當(dāng)固定⒉必要時(shí)用酶適當(dāng)消化。⒊用PH7.4PBS洗15分鐘。⒋滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的未標(biāo)記一抗，在室溫或37℃孵育箱內(nèi)孵育30～60分鐘。⒌用PBS洗3次，5分鐘/次。⒍滴加熒光標(biāo)記二抗，在室溫或 37℃孵育箱內(nèi)孵育30～60分鐘。⒎用PBS洗3次，5分鐘/次。⒏用50%甘油〔用PH9.0碳酸鹽緩沖液配制〕封片⒐熒光顯微鏡下觀察。補(bǔ)體法——大多數(shù)抗原—抗體復(fù)合物都能結(jié)合補(bǔ)體。因此，在染色時(shí)先將新鮮補(bǔ)體與第一抗體混合，同時(shí)加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)37℃孵育后，如發(fā)生特異抗原抗體反響，補(bǔ)體就結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上，再用抗補(bǔ)體熒光抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反響，形成抗原——抗體——補(bǔ)體——熒光抗體的復(fù)合物。如圖特點(diǎn)：只需一種熒光抗體，可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的檢測。WORD格式專業(yè)資料整理7WORD格式專業(yè)資料整理染色步驟：⒈石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。冰凍切片、涂片、印片或培養(yǎng)細(xì)胞等材料經(jīng)適當(dāng)固定⒉必要時(shí)用酶適當(dāng)消化。⒊用PH7.4PBS洗15分鐘。⒋將抗血清60℃滅活20min，并作適當(dāng)稀釋。⒌將新鮮豚鼠血清〔其中含有補(bǔ)體〕稀釋10倍⒍取等量抗血清和豚鼠血清混合，滴加在切片上，將切片置37℃孵育箱內(nèi)孵育30～60分鐘⒎用PBS洗3次，5分鐘/次。⒏滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體，在室溫或37℃孵育箱內(nèi)孵育30分鐘。⒐用PBS洗3次，5分鐘/次。⒑用50%甘油〔用PH9.0碳酸鹽緩沖液配制〕封片⒒熒光顯微鏡下觀察?！畴p重免疫熒光標(biāo)記法——在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需要同時(shí)檢查兩種抗原時(shí)要進(jìn)展雙重?zé)晒馊旧?，一般均采用直接法。將兩種熒光抗體〔如抗A和B〕以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，發(fā)黃綠色熒光；B抗體用四甲基異硫氰酸羅達(dá)明熒光素標(biāo)記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種熒光抗原的定位。3．對照實(shí)驗(yàn)與熒光抗體染色結(jié)果判斷〔1〕對照實(shí)驗(yàn)為了保證免疫熒光組織化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，排除某些非特異性染色，必須在初次試驗(yàn)〔新抗體首次使用〕時(shí)進(jìn)展以下對照實(shí)驗(yàn)。WORD格式專業(yè)資料整理8WORD格式專業(yè)資料整理免疫熒光染色的對照實(shí)對照設(shè)置直接法間接法抗補(bǔ)體法標(biāo)本自發(fā)熒光對照★★★陽性對照★★★熒光抗體對照★★抑制試驗(yàn)★★★補(bǔ)體對照★自發(fā)熒光 ——組織不經(jīng)過熒光染色，在紫外光或短光波的照射下，所呈的熒光稱自發(fā)熒光。一般自發(fā)熒光較弱，多呈藍(lán)綠色或藍(lán)白色，容易與特異性熒光相區(qū)別。例：膠原纖維藍(lán)綠色彈力纖維藍(lán)綠色軟骨組織黃綠色心肌黃綠色紅細(xì)胞黃色標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本只加PBS或不加PBS，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察應(yīng)呈陰性熒光。〔無與特異性熒光相似的熒光〕陽性對照：將以知陽性標(biāo)本用免疫熒光組化技術(shù)染色〔直接法、間接法、補(bǔ)體法〕結(jié)果應(yīng)呈陽性熒光。熒光抗體對照：除不加一抗外，其他染色步驟一樣，染色結(jié)果呈陰性熒光?！布礃?biāo)本只加熒光抗體染色〕抑制試驗(yàn)：在加熒光標(biāo)記抗體前或同時(shí)，參加未標(biāo)記的一樣抗體，染色結(jié)果呈陰性或熒光減弱。補(bǔ)體對照：取新鮮豚鼠血器清1：10稀釋，先作用標(biāo)本，洗后再用補(bǔ)體熒光抗體染色，結(jié)果呈陰性。〔2〕特異性染色應(yīng)具備的條件①染色只限于特異性抗原。②不應(yīng)被熒光素結(jié)合的非免疫血清染色。③ 用未標(biāo)記的特異性免疫血清預(yù)先處理標(biāo)本，那么特異性染色被抑制；而用未免疫的血清預(yù)先處理，那么不能抑制特異性染色。④ 如果將熒光素標(biāo)記抗體首先用相應(yīng)的抗原充分吸收，那么特異性染色被抑制；而如果使用無關(guān)的抗原進(jìn)展吸收那么不能抑制特異性染色。4．熒光抗體的制備熒光抗體的制備方法比較復(fù)雜，現(xiàn)在已有各種熒光抗體出售，所以，在這我們不講。但大家要知道熒光色素的一些種類，以便對免疫熒WORD格式專業(yè)資料整理9WORD格式專業(yè)資料整理光染色結(jié)果的觀察和判斷。目前主要常用的熒光色素有：1〕異硫氰酸熒光素〔fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC〕呈現(xiàn)黃綠色熒光2〕四已基羅達(dá)明〔terraethylrodemineB200，RB200〕呈現(xiàn)明亮橙紅色熒光3〕四甲基異硫氰酸羅達(dá)明〔tetramethylrhodamineisothiocyanate ，TRITC〕呈現(xiàn)橙紅色4〕4-乙酰胺-4-異硫氰酸-2-硫酸氏〔SITS〕呈藍(lán)色熒光熒光抗體的保存0～4℃或-20℃地低保存6．熒光顯微鏡：它是由超高壓光源，濾板系統(tǒng)〔包括激發(fā)光和壓制濾板〕和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像。使用本卷須知：1〕嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)展操作，不要隨意改變程序。2〕應(yīng)在暗室中進(jìn)展檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓貢5～15分鐘，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適合暗室，再開場觀察標(biāo)本。3〕防止紫外線對眼睛的損害。在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)帶上防護(hù)眼睛。4〕檢查時(shí)間每次以1～2小時(shí)為宜，超過90分鐘，超高壓貢燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱，標(biāo)本受紫外線照射3～5分鐘后，熒光也明顯減弱或退色，所以最多不超過2～3小時(shí)。5〕熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)用電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開場就記錄使用時(shí)間，燈熄滅后欲再啟用時(shí)，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)防止數(shù)次點(diǎn)燃光源。6〕標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。最好是在稍加觀察后即顯微攝影。將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。7〕載玻片厚度應(yīng)為0。8～1。2毫米之間，蓋玻片厚度在0。17毫米左右，標(biāo)本不能太厚，因太厚會(huì)使激發(fā)光大局部消耗在標(biāo)本的下部，而物鏡觀察到的上部不能充分激發(fā)，此外細(xì)胞重疊會(huì)影響結(jié)果判斷。8〕熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：〔質(zhì)量控制和結(jié)果解釋〕“－〞——無或可見微弱自發(fā)熒光“＋〞——僅能見明確可見熒光“＋＋〞——可見明亮的熒光“＋＋＋〞——可見耀眼的熒光WORD格式專業(yè)資料整理10WORD格式專業(yè)資料整理(二)免疫酶組織化學(xué)技術(shù)〔免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 〕免疫酶組織〔細(xì)胞〕化學(xué)是繼免疫熒光后，于60年代開展起來的技術(shù)。1．根本原理：先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后參加酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細(xì)胞外表和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)展定位研究。常用標(biāo)記酶的種類：辣根過氧化物酶〔horseradishperoxidase，HRP〕堿性磷酸酶〔alkalinephosphatase，AKP、ALP、AP〕酸性磷酸酶〔acidphosphatase，ACP〕葡萄糖氧化酶〔glucoseoxidase，GOD〕目前，用的最多的酶是HRP，AKP用于標(biāo)記酶的要求：酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于光鏡或電鏡下觀察。所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學(xué)定位。獲得的酶分子，最好有商品出售。中性PH值時(shí)，酶應(yīng)穩(wěn)定，酶標(biāo)記抗體后，活性不應(yīng)改變，且酶的活性越高越好。酶標(biāo)過程中，酶與抗體連接，不影響二者的活性。被檢測組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶一樣的內(nèi)源性酶其中1.,2.兩點(diǎn)最重要。因?yàn)椴⒎侨菀罪@示的酶均有形成不可溶性的復(fù)合物。一般認(rèn)為，辣根過氧化物酶〔HRP〕較佳，是最常用的一種酶。酶標(biāo)抗體的制備及純化： 略酶的底物及沉淀顏色：見下表酶底物沉淀顏色HRPDAB〔3，3--二氨基聯(lián)苯胺〕+H2O2棕色AEC〔3氨基--9—乙基卡巴唑〕+H2O2紅色AKPNBT(四氮唑藍(lán))+5—嗅--4氯—3吲哚--藍(lán)色磷酸鹽WORD格式專業(yè)資料整理11WORD格式專業(yè)資料整理免疫酶技術(shù)與免疫熒光技術(shù)不同在于：①可用普通顯微鏡代替熒光顯微鏡，易于推廣②切片不易退色，可長期保存③陽性細(xì)胞定位準(zhǔn)確，較易與非特異性反響鑒別，因此判斷容易，主觀性少④組織構(gòu)造清晰，可與HE切片對照觀察⑤可作免疫電鏡超微構(gòu)造觀察2．分類：直接法間接法補(bǔ)體法免疫酶橋法免疫酶雙橋法過氧化物酶抗過氧化物酶法〔PAP〕PAP法等1〕直接法原理：用酶直接標(biāo)記在特異性一抗上，與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，讓酶催化底物反響產(chǎn)生有色產(chǎn)物，沉淀在抗原—抗體反響部位，即可在鏡下對標(biāo)本中的抗原進(jìn)展檢測。優(yōu)點(diǎn)：簡便，快速，特異。缺點(diǎn)：敏感性差，標(biāo)記一種抗體只能檢測一種抗原，所以應(yīng)用受限制。染色步驟：①切片按免疫組化常規(guī)處理0.3%H2O2甲醇。室溫10～30分鐘③必要時(shí)，如石蠟切片用 0.1%胰蛋白酶消化，37℃10～30分鐘，PBS洗④1∶20正常血清，室溫孵育15分鐘⑤滴加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)一抗，室溫或 37℃，孵育30～60分鐘WORD格式專業(yè)資料整理12WORD格式專業(yè)資料整理⑥PBS洗3次，每次5分鐘⑦加酶的底物溶液，5～10分鐘，顯微鏡下觀察，至特異性染色清晰，背景無染色時(shí)，終止顯色。⑧蘇木素襯染，脫水，透明，封片。２〕間接法原理：在間接法中先用未標(biāo)記的特異性一抗與標(biāo)本中相應(yīng)抗原結(jié)合，再用酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體〔二抗〕結(jié)合，然后再加酶的底物顯示抗原－—抗體——抗抗體復(fù)合物存在的部位，以對抗原進(jìn)展檢測。優(yōu)缺點(diǎn)：提高了敏感性，而且用一種酶標(biāo)記一種抗體就可檢測多種抗原，因此較直接法使用廣，但其較費(fèi)時(shí)，非特異性染色較多。染色方法：⒈切片按免疫組化常規(guī)處理0.3%H2O2甲醇。室溫，10～30分鐘⒊必要時(shí)，如石蠟切片用 0.1%胰蛋白酶消化，37℃10～30分鐘，PBS洗⒋1∶20正常血清，室溫孵育15分鐘⒌滴加適當(dāng)稀釋的特異性一抗于標(biāo)本上，室溫或37℃，孵育30～60分鐘⒍PBS洗3次，每次5分鐘⒎滴加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)二抗于標(biāo)本上，室溫或37℃，孵育30～60分鐘⒏PBS洗3次，每次5分鐘⒐加酶的底物溶液，5～10分鐘，顯微鏡下觀察，至特異性染色清晰，背景無染色時(shí)，終止顯色。⒑蘇木素襯染，脫水，透明，封片。WORD格式專業(yè)資料整理13WORD格式專業(yè)資料整理以上兩種方法都是通過化學(xué)方法將酶直接標(biāo)記在抗體上，所以通稱為酶標(biāo)抗體法。３〕酶橋法在酶標(biāo)記抗體過程中，酶與抗體的化學(xué)反響交聯(lián)過程可影響酶的活性和抗體的效價(jià)，同時(shí)產(chǎn)生非特異酶標(biāo)記抗體，可增加非特異性背景染色，為了防止上述缺點(diǎn)，相繼開展了酶橋法和PAP法。它們是以酶為抗原免疫動(dòng)物，產(chǎn)生抗酶抗體，通過酶與抗體的特異性結(jié)合進(jìn)展標(biāo)記，屬于非酶標(biāo)記的抗體酶法。原理：先用酶作為抗原免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高，特異性強(qiáng)的抗酶抗體，然后以二抗為橋梁，將在組織中與抗原結(jié)合的一抗與酶抗體連接起來，再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，經(jīng)酶的底物顯示出抗原的分布。如圖第一抗體〔假設(shè)來自種屬A〕孵育60分鐘，37℃。第一抗體的稀釋度可高些，使抗體的兩個(gè)Fab段均與組織抗原結(jié)合，較結(jié)實(shí)，振洗時(shí)不易喪失。切片與第二抗體〔橋抗，抗種屬AIgG抗體〕孵育1小時(shí)37℃。應(yīng)用過量的橋抗體能保證一個(gè)Fab段與第一抗體結(jié)合，另一個(gè)Fab段游離。切片與抗酶抗體〔來自種屬A〕孵育1小時(shí)37℃。因抗酶抗體和第一抗體均系種屬AIgG，具有一樣的抗原性，所以橋抗體游離Fab能與抗酶抗體結(jié)合，起到橋的作用，將抗酶抗體結(jié)在與組織抗原結(jié)合的第一抗體上。切片與酶〔HRP〕孵育30分鐘，酶與抗酶抗體結(jié)合。顯色WORD格式專業(yè)資料整理14WORD格式專業(yè)資料整理優(yōu)缺點(diǎn)：在此過程中，任何抗體均未被酶標(biāo)記，酶是通過免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合，防止了共價(jià)連接對抗體和酶活性的損害，提高方法敏感性，又能節(jié)省第一抗體的用量。但其最大的缺點(diǎn)是抗酶抗體必須高度純化。因?yàn)榭姑缚贵w中非特異性抗體不能與酶結(jié)合，但能與抗酶抗體競爭橋抗體的結(jié)合位點(diǎn)，從而減少了抗酶抗體的結(jié)合，而大幅度降低呈色能力。另外，抗酶抗體的酶結(jié)合是低親和力的，沖洗時(shí)易喪失而降低其敏感性。染色步驟：⒈切片按免疫組化常規(guī)處理0.3%H2O2甲醇。室溫，10～30分鐘⒊必要時(shí)，如石蠟切片用 0.1%胰蛋白酶消化，37℃10～30分鐘，PBS洗⒋1∶20正常血清，室溫孵育15分鐘⒌滴加適當(dāng)稀釋的特異性一抗于標(biāo)本上，室溫或37℃，孵育30～60分鐘⒍PBS洗3次，每次5分鐘⒎加適當(dāng)稀釋的二抗，37℃或室溫，孵育30分鐘⒏PBS洗3次，每次 5～10分鐘⒐加抗酶抗體，室溫或 37℃，30分鐘PBS洗3次，每次5～10分鐘⒒加酶溶液，37℃，孵育30分鐘⒓酶的底物顯色⒔襯染，脫水，透明，封片。4〕PAP法原理：與酶橋法相似，都是借助橋抗體將酶連結(jié)在組織抗原結(jié)合的第一抗體上，所不同的是先將抗酶抗體與酶結(jié)合制成酶——抗酶復(fù)合物〔PAP〕，PAP復(fù)合物中的抗酶抗體和第一抗體為同種屬動(dòng)物的IgG，所以橋抗體能夠作為“橋〞將PAP復(fù)合物連結(jié)在第一抗體上。如圖WORD格式專業(yè)資料整理15WORD格式專業(yè)資料整理PAP復(fù)合物：是離體制備的HRP抗HRP復(fù)合物，它的制備方法較多，在這不介紹。PAP復(fù)合物為五邊形環(huán)狀構(gòu)造，這種構(gòu)造極為穩(wěn)定，沖洗時(shí)酶分子不會(huì)脫落，從而大大提高了PAP法的靈敏度，約比免疫熒光法敏感100～1000倍。比酶橋法靈敏20倍。優(yōu)缺點(diǎn)：靈敏度高，PAP背景染色低，但制備較復(fù)雜。染色步驟：⒈切片按免疫組化常規(guī)處理0.3%H2O2甲醇。室溫，10～30分鐘⒊必要時(shí)，如石蠟切片用 0.1%胰蛋白酶消化，37℃10～30分鐘，PBS洗⒋1∶20正常血清，室溫孵育15分鐘⒌滴加適當(dāng)稀釋的特異性一抗于標(biāo)本上，室溫或37℃，孵育30～60分鐘⒍PBS洗3次，每次5分鐘⒎加適當(dāng)稀釋的二抗，37℃或室溫，孵育30分鐘⒏PBS洗3次，每次 5～10分鐘⒐加PAP復(fù)合物，室溫或 37℃，孵育30分鐘PBS洗3次，每次5～10分鐘⒒酶的底物顯色⒓襯染，脫水，透明，封片。5〕雙PAP法：原理：在PAP法的根底上重復(fù)滴加1次二抗和PAP復(fù)合物，結(jié)果使抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合比PAP法更多的酶分子，從而更進(jìn)一步增強(qiáng)了敏感性。PAP法連結(jié)機(jī)理尚不清楚，可能是第一次PAP中還留有未完全結(jié)合的位點(diǎn)。優(yōu)缺點(diǎn)：雙PAP法比PAP法更敏感，但步驟較多，費(fèi)時(shí)較長，故不常用。〔三〕免疫膠體金技術(shù)1971年，F(xiàn)aulk和Taylor首先報(bào)道應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)研究細(xì)胞外表抗原的分布，從此開創(chuàng)了免疫組織化學(xué)研究的新領(lǐng)域，即免疫金技術(shù)〔immunogoldtechnique〕。免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學(xué)活性沒有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子〔如葡萄球菌A蛋白〕等作為探針，就能對組織或細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)展定性、定位、甚至定量研究。由于膠體WORD格式專業(yè)資料整理16WORD格式專業(yè)資料整理金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)展光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法那么更便于光鏡觀察。1〕膠體金的概念：膠體金是指由直徑為1～100nmX圍內(nèi)的金顆粒所組成的分散系，即金以或大或小的微小粒子分散在另一種物質(zhì)中所形成的體系。通常所說的膠體金是指以微小的粒子分散在水中所形成的金溶膠。2〕膠體金的理化性質(zhì)顏色：與粒子的大小有關(guān)，如15nm的膠體金為紅色，而95nm的膠體金那么為藍(lán)色。一般用于免疫組化的膠體金顆粒直徑X圍5～60nm，均呈紅色，但顆粒越小，紅色越深。穩(wěn)定性：膠體金可以在相當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)保持其溶膠不變。膠體金的穩(wěn)定性受多種因素的影響，其中最主要的是電解質(zhì)，其次還與濃度、溫度等有關(guān)。電解質(zhì)：少量的電解質(zhì)對膠體金的穩(wěn)定性有促進(jìn)作用，但過量的電解質(zhì)常導(dǎo)致穩(wěn)定性破壞而使膠體金凝聚。膠體金濃度：濃度越高，金顆粒之間的距離越近，容易導(dǎo)致金顆粒的凝聚。溫度：一般情況下，溫度對膠體金的穩(wěn)定性影響不大，但長時(shí)間加熱會(huì)使膠體金的穩(wěn)定性稍有下降。大分子物質(zhì)：大分子物質(zhì)對膠體金的穩(wěn)定性影響比較復(fù)雜，在一定條件下，參加大分子物質(zhì)可以使膠體金的穩(wěn)定性大大加強(qiáng)，對抗某些影響膠體金穩(wěn)定因素的作用，如高濃度的電解質(zhì)等。帶電性：膠體金屬憎水性膠體，金顆粒周圍包圍了大量吸附離子所形成的靜電層，帶負(fù)電，可在電場中泳動(dòng)。3〕膠體金的制備：可用多種方法制備膠體金，其中應(yīng)用最多的是化學(xué)復(fù)原法。根本原理：是在氯化金水溶液中參加一定量的復(fù)原劑，使金離子復(fù)原為金原子。常用的復(fù)原劑有檸檬酸鈉，鞣酸和白磷。其中，檸檬酸鈉復(fù)原制備的金顆粒直徑較大，為15～150nm，白磷復(fù)原制備的金顆粒直徑較小，為3～12nm。4〕膠體金探針的制備略5〕免疫膠體金染色方法：免疫金法免疫金銀法免疫金法〔immunogoldstaining，IGS〕免疫金法可分為直接法和間接法兩種。一般多采用間接法。WORD格式專業(yè)資料整理17WORD格式專業(yè)資料整理1、直接法——將膠體金標(biāo)記的一抗直接對標(biāo)本進(jìn)展染色，然后在光鏡或電鏡下進(jìn)展觀察。這種方法非常簡單，但由于一種探針只能研究一種抗原，所以比較受局限。用膠體金標(biāo)記的單克隆探針，進(jìn)展雙重或多重染色效果比較好。2、間接法——是指先將未標(biāo)記的特異性一抗與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，然后用金標(biāo)的二抗與一抗結(jié)合，在光鏡或電鏡下對抗原的分布進(jìn)展定位研究。染色步驟：〔以人肝組織HbsAg的定位為例〕⒈石蠟切片、脫蠟至水1%胰蛋白酶消化10分鐘⒊用雙蒸餾水洗5分鐘×2⒋用TBS PH8。2洗5分鐘×21%卵蛋白〔EA〕封閉10分鐘稀釋鼠抗HBsAg單克隆抗體，37℃1～2h,4℃冰箱過夜⒎TBS PH8。2洗10分鐘×21%EA封閉10分鐘⒐TBSPH8。2稀釋兔抗鼠金標(biāo)記抗體37℃45分鐘⒑TBSPH8。2洗10分鐘×2⒒雙蒸餾水洗5分鐘×210%戊二醛，10分鐘⒔雙蒸餾水洗5分鐘⒕蘇木素襯染核，甘油封片結(jié)果：在鏡下可見局部肝細(xì)胞漿內(nèi)有金顆粒聚集呈紅色，沿細(xì)胞膜分布，說明有HBsAg定位在細(xì)胞漿內(nèi)。WORD格式專業(yè)資料整理18WORD格式專業(yè)資料整理免疫金銀法〔immunogoldsliverstaining，IGSS〕根本原理：1983年Holgate等人將IGH與銀顯影方法相結(jié)合立。通過免疫反響沉淀在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用對苯二酚復(fù)原劑將銀離〔Ag﹢〕子復(fù)原成銀原子〔Ag0〕。被復(fù)原的銀原子于是圍繞金顆粒形成一個(gè)“銀殼〞，“銀殼〞一旦形本錢身也具有催化作用，從而使更多銀離子復(fù)原并促使銀殼越長越大，最終抗原位置得到清楚放大。染色步驟：⒈石蠟切片、脫蠟至水lugol液，5min5%硫代硫酸鈉水溶液脫碘5min⒋雙蒸餾水沖洗干凈⒌TBSPH7.4洗5min×2⒍1%胰蛋白酶消化10min⒎用TBSPH7.4洗5min×2⒏1%卵蛋白〔EA〕封閉10min⒐稀釋鼠抗HBsAg單克隆抗體，37℃孵育1～2h或4℃冰箱過夜⒑TBSPH7.4洗5min×2⒒1%卵蛋白〔EA〕封閉10min⒓TBSPH7.4稀釋兔抗鼠金標(biāo)記抗體37℃45minTBSPH7.4洗5min×2⒕雙蒸餾水洗5min×2⒖物理顯影⒗雙蒸餾水洗5min×2⒘蘇木素襯染核⒙脫水、透明、封片WORD格式專業(yè)資料整理19WORD格式專業(yè)資料整理結(jié)果： 光鏡下見肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有膜狀或包涵體形分布的陽性黑色狀顆粒，背景干凈。顯影液配方：乳酸銀顯影液的配制10%阿拉伯膠水溶液60ml檸檬酸緩沖液PH3.510ml對苯二酚1g，加雙蒸水20ml溶解乳酸銀水溶液〔100mg加水10ml〕以上四液臨用前依次混合、暗處顯影硝酸銀顯影液的配制10%阿拉伯膠水溶液60ml檸檬酸緩沖液PH3.510ml對苯二酚1.7g，加雙蒸水30ml溶解硝酸銀40mg，溶于蒸餾水2ml以上四液臨用前依次混合、暗處顯影6〕免疫膠體金技術(shù)的特點(diǎn)①膠體金制備簡單制備膠體金所需設(shè)備和試劑均易得到，制備方法也簡單、快速②標(biāo)記簡單抗體等生物大分子很容易通過界面物理吸附作用，與膠體顆粒相結(jié)合形成穩(wěn)定的金標(biāo)復(fù)合物。由于標(biāo)記過程中不需要經(jīng)過任何化學(xué)反響過程，因此標(biāo)記后生物大分子的生物學(xué)活性仍根本保持不變。③敏感性高電鏡下，金顆粒的電子密度高，界限清楚，即使是單個(gè)的金顆粒也容易區(qū)分。因此免疫金電鏡的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過免疫酶組織化學(xué)反響產(chǎn)物DAB，大大提高了免疫組織化學(xué)技術(shù)在電鏡水平的分辨率。光鏡下，金顆粒經(jīng)銀顯影后得到放大，用于檢測組織細(xì)胞抗原時(shí)，其敏感性也高于其他方法。④特異性強(qiáng)免疫金探針的非特異性吸附作用很小，較少受組織標(biāo)本背景因素的影響，在抗原抗體檢測中顯示出高度的特異性。⑤定位準(zhǔn)確由于金顆粒電子密度高，特征明顯，呈散在顆粒，不存在酶反響擴(kuò)散等缺陷，因此免疫金技術(shù)定位準(zhǔn)確。⑥適應(yīng)性廣WORD格式專業(yè)資料整理20WORD格式專業(yè)資料整理膠體金既能用于普通光鏡觀察，也能用于透射電鏡，掃描電鏡，熒光顯微鏡觀察。標(biāo)本能長期保存。⑦易于雙重和多重標(biāo)記通過控制條件可制備不同直徑的膠體金顆粒，將不同直徑的膠體金顆粒分別標(biāo)記不同的抗體和抗原，可以在一X切片上同時(shí)區(qū)分兩種或兩種以上抗原或抗體的分布，因而特別適用于電鏡水平的雙重或多重標(biāo)〔四〕親和免疫組化技術(shù)——親和組織化學(xué)〔affinityhistochemistry〕就是利用一些物質(zhì)之間的高度親特性，將酶等標(biāo)記物連接到抗原抗體復(fù)合物上，以對體內(nèi)的抗原〔抗體〕進(jìn)展檢測。事實(shí)上抗原抗體反響本質(zhì)上也屬于親和組化這一X疇，只是近代免疫組化方法的更新更突出了親和這一組化技術(shù)的特點(diǎn)?！惨?yàn)榭乖贵w的結(jié)合實(shí)際上是由于兩者之間具有高度的親和性〕具有高度親和的物質(zhì)除了抗原——抗體，還有植物凝集素——糖類，生物素——抗生物素，葡萄球菌A蛋白——IgG，陽離子——陰離子，激素——受體等。下面以生物素——抗生物素為例生物素〔維生素H，biotin〕是一種分子量244Da小分子維生素?？股锼亍猜寻姿?，avidin〕是一種糖蛋白，分子量為68KDa，由四個(gè)亞單位組成。生物素與抗生物素有很強(qiáng)的親和力，兩者一旦結(jié)合就很難解離。同時(shí)，生物素具有與酶和抗體結(jié)合的能力，這樣抗生物素分子與多個(gè)生物素結(jié)合，生物素又可大量結(jié)合酶標(biāo)記物，起到多級放大作用，因而敏感性強(qiáng)。WORD格式專業(yè)資料整理21WORD格式專業(yè)資料整理舉例：ABC法〔生物素—抗生物素—過氧化物酶復(fù)合技術(shù)，avidin-biotin-complextechnique〕根本原理：利用上述生物素與抗生物素的特性，先將生物素與辣根過氧化物酶〔HRP〕結(jié)合，形成生物素化的辣根過氧化物酶，然后與抗生物素按一定比例混合，形成ABC復(fù)合物，用生物素化的二抗與一抗結(jié)合再與ABC復(fù)合物結(jié)合，最后用底物顯色。如圖優(yōu)點(diǎn)：①敏感性高ABC法與PAP法比較要高20～40倍，這是因?yàn)樯锼嘏c抗生物素間有極強(qiáng)的結(jié)合力，抗生物素同生物素結(jié)合有四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一局部同生物素化的過氧化物酶結(jié)合，另一局部同生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合。在ABC反響中，抗生物素作為橋連接與生物素標(biāo)記的酶和生物素標(biāo)記的抗體之間，而生物素標(biāo)記的過氧化物酶分子又可作為橋連接于生物素分子之間，于是形成一個(gè)含有三個(gè)以上過氧化物酶分子〔大于PAP復(fù)和物〕的網(wǎng)絡(luò)狀復(fù)合物，敏感性極大提高。②特異性強(qiáng)，背景染色淡③方法簡便，節(jié)約時(shí)間④由于生物素與抗生物素具有與多種示蹤物結(jié)合的能力，可用于雙重或多重免疫染色。染色步驟：⒈石蠟切片脫蠟至水⒉PBS沖洗，5分鐘×3次0.3%過氧化氫〔H2O2〕甲醇溶液，20～30分鐘⒋PBS沖洗，5分鐘×3次⒌1%胰蛋白酶消化⒍PBS沖洗，5分鐘×3次WORD格式專業(yè)資料整理22WORD格式專業(yè)資料整理⒎正常血清孵育，30分鐘⒏滴加第一抗體〔特異性抗體〕，孵育60分鐘⒐PBS沖洗，5分鐘×3次⒑滴加第二抗體，孵育60分鐘⒒PBS沖洗，5分鐘×3次⒓滴加第三抗體〔ABC復(fù)合物〕，孵育60分鐘PBS沖洗，5分鐘×3次⒕DAB顯色⒖自來水沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片SP法：目前廣泛使用的親和免疫組化法是SP法〔鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶連結(jié)法〕。根本原理：用鏈霉菌抗生物素蛋白代替ABC復(fù)合物中卵白素〔抗生物素〕即形成SP法。鏈霉菌抗生物素蛋白是從鏈霉菌培養(yǎng)物中提取的蛋白，它和親和素〔抗生物素〕一樣，也存有四個(gè)生物素結(jié)合點(diǎn)，親和力很高〔比卵白素蛋白親和力更高〕，因此比ABC法更敏感。染色步驟：同ABC法WORD格式專業(yè)資料整理23WORD格式專業(yè)資料整理國外其他公司也將SP法注冊為LSAB法，SABC法。二步法：之所以稱做二步法是因?yàn)樗怯每贵w和酶形成的聚合物來代替?zhèn)鹘y(tǒng)“三步法〞〔ABC法、LSAB法或SP法〕中的二抗和酶聚合物。由于省略了一種試劑和相應(yīng)的操作步驟，加上這種技術(shù)可以使背景染色非常干凈，傳統(tǒng)方法中的血清封閉也可去除，使得這種方法變得更加快速和易于使用。此技術(shù)的關(guān)鍵是在一條穩(wěn)定的氨基酸骨架上將多個(gè)辣根過氧化物酶分子和抗體的Fab段〔抗原結(jié)合片段〕結(jié)合在一起形成多聚物。這種聚合物中的Fab段對一抗具有很強(qiáng)的親和性，而多個(gè)HRP分子提供很高的靈敏度。此法之所以背景更加干凈，不僅僅是因?yàn)樗^少地使用了基于蛋白質(zhì)的試劑，更重要的是它不含生物素和鏈霉卵白素， 并且使用的只是抗體的抗原結(jié)合片段，這就意味著可以完全防止內(nèi)源性生物素和抗體的Fc段可能造成的背景染色。第五節(jié) 免疫組化染色過程中的根本技術(shù)免疫組化染色的根本原理就是抗原抗體的特異性結(jié)合。雖然染色方法有多種類型，但染色過程中都須要采取一些根本的技術(shù)方法，以增強(qiáng)抗原抗體特異性反響，降低或消除非特異性反響，使染色結(jié)果到達(dá)最正確效果。1、抗原修復(fù)：蛋白酶消化技術(shù)0．1%胰蛋白酶0．4%胃蛋白酶微波處理高壓高溫處理電飯煲、鋁鍋處理2、非特異性染色的控制正常血清作用WORD格式專業(yè)資料整理24WORD格式專業(yè)資料整理0.3%～3%的雙氧水溶液3、對照實(shí)驗(yàn)免疫組化染色的步驟較多，因此影響染色結(jié)果的環(huán)節(jié)也很多。為了對染色結(jié)果作出正確的判斷，染色中，尤其是在定位一種新的抗原或建立一種新的免疫組化方法時(shí)，有必要設(shè)立陽性對照和陰性對照。用抗原為陽性的標(biāo)本與待檢測標(biāo)本同時(shí)進(jìn)展免疫組化染色，并呈陽性反響者為陽性對照。反之，如用確定不含抗原的標(biāo)本作為對照，染色結(jié)果為陰性者稱陰性對照。除此以外，空白、替代、吸收和抑制實(shí)驗(yàn)等也是屬陰性對照。當(dāng)染色結(jié)果所顯示的是陽性對照片呈陽性，陰性對照呈陰性時(shí)，說明被檢測切片的標(biāo)記結(jié)果可靠。免疫組化對照實(shí)驗(yàn)及結(jié)果判斷標(biāo)本號檢測標(biāo)本陽性對照陰性對照替代抗體對照結(jié)論1++--受檢標(biāo)本含抗原2-+--受檢標(biāo)本不含抗3----操作錯(cuò)誤4++++非特異性反響5++-+非特異性反響6+---陽性對照差陽性對照——用抗原為陽性的標(biāo)本與待檢測標(biāo)本同時(shí)進(jìn)展免疫組化染色，并呈陽性反響稱陽性對照。陰性對照——確認(rèn)不含抗原的標(biāo)本作對照，染色結(jié)果為陰性者稱陰性對照?？瞻讓φ?、替代對照、吸收對照和抑制實(shí)驗(yàn)也屬陰性對照?？瞻讓φ眨河妹馊サ谝豢贵w或用緩沖液替代第一抗體，染色結(jié)果為〔—〕。替代對照：用一樣稀釋制備的第一抗體的動(dòng)物免疫前血清來替代第一抗體，染色結(jié)果為〔—〕。吸收對照：用過量的相應(yīng)的純化抗原與第一抗體反響，抗體結(jié)合點(diǎn)全部與抗原結(jié)合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織中的抗原反響，染色結(jié)果為〔—〕。抑制實(shí)驗(yàn)：待檢標(biāo)本先與未標(biāo)記的特異性抗體反響后再與標(biāo)記的特異抗體進(jìn)展染色，結(jié)果明顯減弱或轉(zhuǎn)陰性。一般替代對照、吸收對照、抑制實(shí)驗(yàn)主要用于證實(shí)某抗體的特異性。在病理科的日常診斷工作及科研課題時(shí)，只要設(shè)陰性對照和陽性對照，一般不必設(shè)吸收對照和抑制對照。4、抗體的分裝、稀釋、滴加及保存5、孵育方法及時(shí)間6、切片的洗滌7、顯色8、襯染9、切片的脫水、透明、封片10、染色結(jié)果的判斷WORD格式專業(yè)資料整理25WORD格式專業(yè)資料整理細(xì)胞膜著色：例細(xì)胞核著色：例細(xì)胞漿著色：例細(xì)胞間質(zhì)著色：例第六節(jié) 免疫組織化學(xué)的根本技術(shù)免疫組化的染色方法雖有很多類型，但有關(guān)染色的根本技術(shù)卻是一樣的。它既有一般病理切片染色的根本要求，也涉及于抗原抗體特異性反響有關(guān)的特殊要求。因此，免疫組織化學(xué)染色是一種涉及多學(xué)科的綜合性技術(shù)?！惨弧橙〔膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物、人體組織細(xì)胞和體外培養(yǎng)細(xì)胞都可作為免疫組化研究的材料。對于所取材料不僅要保持組織細(xì)胞形態(tài)的完整，而且還要使抗原的抗原性不被破壞，一利于抗原抗體的結(jié)合。因此，在取材時(shí)要求做到準(zhǔn)確、迅速、完整和具有代表性，以免因取材不當(dāng)造成抗原喪失或破壞，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。⒈實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類很多，以狗、兔、大鼠和小鼠等為常用。取材前先常規(guī)麻醉或?qū)?dòng)物快速處死，迅速取材。注意取材用的剪刀和刀片等要，所取材料不應(yīng)太大，以厚度不超過3mm為宜。在取小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物材料時(shí)，如先經(jīng)左心室主動(dòng)脈灌注固定，使灌注液迅速到達(dá)全身，那么固定更加充分。灌注固定時(shí)先用小量生理鹽水快速將血液沖洗干凈，緊接著用4%多聚甲醛灌注，灌注速度先快后慢。⒉人體材料1〕在病理診斷和研究中，通過活檢和手術(shù)切除的標(biāo)本，以及通過各種方法所收集的細(xì)胞〔如脫落細(xì)胞、血細(xì)胞〕等都可用于免疫組織化學(xué)研究。對于尸體解剖標(biāo)本那么要視具體情況而定。如果是死WORD格式專業(yè)資料整理26WORD格式專業(yè)資料整理亡時(shí)間過長的標(biāo)本，由于組織發(fā)生自溶，抗原已變性或彌散、消失，染色結(jié)果不一定能反映其實(shí)際情況。因此，尸體解剖標(biāo)本應(yīng)盡早取材固定，以免對研究結(jié)果造成影響。2〕活檢標(biāo)本的取材活檢標(biāo)本的取材于體表、空腔臟器的內(nèi)壁或一些實(shí)質(zhì)性器官，如：皮膚、口腔、鼻咽、喉、胃、腎和肝等。取材常用活檢鉗鉗取，所取材料較小，并常因擠壓而變形。因此，在取材時(shí)應(yīng)注意：①要求活檢鉗的刀口鋒利，以減少對組織的擠壓；②所取的部位要具有代表性，尤其是病變部位較大時(shí)。3〕手術(shù)切除標(biāo)本的取材應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的大小采用相應(yīng)的取材方法。對于小標(biāo)本的處理，可先在固定液內(nèi)固定一會(huì)兒，再修切成適宜大小繼續(xù)固定。對于大標(biāo)本的處理，鑒于抗原在組織中分布的差異，因此，所取材料要包括以下幾個(gè)部位：①主要病灶；②病灶與正常組織交界處；③病灶周圍的正常組織。4〕細(xì)胞標(biāo)本的取材印片法即將載玻片輕貼于暴露的病變區(qū)，使脫落細(xì)胞粘附在玻片上，經(jīng)固定后即可用于染色。此法優(yōu)點(diǎn)是簡便省時(shí)，細(xì)胞抗原也保存較好，缺點(diǎn)是細(xì)胞分布不均，甚至細(xì)胞重疊在一起，影響染色結(jié)果。主要適用于活檢和手術(shù)切除標(biāo)本。② 穿刺涂片法用穿刺針抽取病變區(qū)液體成分，直接或經(jīng)離心后制成細(xì)胞懸液涂于載玻片上，固定、染色。此法主要應(yīng)用于實(shí)質(zhì)性器官細(xì)胞的采集，如淋巴結(jié)、肝、腎、肺等。③ 體液細(xì)胞的制備制備細(xì)胞成分較多的體液標(biāo)本時(shí)，如血液、淋巴液、精液等，取少量液體直接涂片即可。對于細(xì)胞成分較少體液，如腹水、胸水、腦脊液等，方法之一是先用離心沉淀法使細(xì)胞濃縮，制成細(xì)胞懸液，然后涂片；方法之二是用細(xì)胞離心涂片器直接涂片。3．體外培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本的制備培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本的制備應(yīng)根據(jù)所培養(yǎng)的生物學(xué)特性采用不同的方法。對于貼壁生長的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞等，可在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板的底壁放置載玻片，讓細(xì)胞在其上生長，到時(shí)將載玻片取出進(jìn)展固定染色即可。對于懸浮生長的細(xì)胞那么可采取離心沉淀涂片的方法。為充分保存組織中的抗原，對所取標(biāo)本應(yīng)立即固定包埋。如果暫時(shí)不固定那么應(yīng)在低溫下保存?zhèn)溆谩？杀４嬖诟杀?、液氮或低溫冰箱中。〔二〕固定固定的目的在于保持組織的形態(tài)和構(gòu)造的完整，并盡量保存組織中的抗原，使其不被破壞或擴(kuò)散，以減少非特異性染色或假陽性、假陰性結(jié)果。如果固定不及時(shí)或固定不當(dāng)，都可使組織構(gòu)造不清晰或特異性抗原不顯示， 使結(jié)果無法判斷。由于不同抗原其穩(wěn)定性不同， 不同固定劑的性能也各異，因此，研究者有必要了解所要研究抗原的化學(xué)性質(zhì)， 并根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┖凸潭ǚ椒?。選擇固定方法的原那么是在保持組織形態(tài)完好和被檢測抗原的前提下，應(yīng)采用濃度最低的固定劑和最短的固定時(shí)間。固定時(shí)間一般為1～2h?！?〕常用固定劑WORD格式專業(yè)資料整理27WORD格式專業(yè)資料整理1、醛類固定劑屬雙功能交聯(lián)固定劑，其作用是使組織之間互相交聯(lián)，將抗原保存在原位。此類固定劑的特點(diǎn)是對組織的穿透性強(qiáng)，收縮性小。常用的有甲醛、多聚甲醛和戊二醛，可單種或多種固定劑聯(lián)合使用。甲醛緩沖液：4%多聚甲醛磷酸緩沖液：戊二醛——多聚甲醛磷酸緩沖液：Bouin液：PLP液〔過碘酸——賴氨酸——多聚甲醛固定液〕2、丙酮及醇類固定劑丙酮和醇類的固定原理主要是使組織中的蛋白質(zhì)和糖沉淀。此類固定劑的穿透力強(qiáng)，對抗原保存較好，但對小分子蛋白質(zhì)及多肽等物質(zhì)的保存效果較差。常與其他固定劑，如冰醋酸、乙醚和氯仿等混合使用。液：Clzrke改良液：Carnoy液：丙酮：3、其他固定劑Zenker液：碳二亞酰胺——戊二醛液：四氧化鵝〔鵝酸〕液：〔2〕固定本卷須知1、固定液的選擇用于免疫組化的固定劑種類很多，終究如何選擇，應(yīng)根據(jù)理論與反復(fù)的實(shí)踐來決定。選擇最正確固定劑的標(biāo)準(zhǔn)是：①組織的形態(tài)構(gòu)造保存良好；②最大限度保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是應(yīng)用最廣的固定劑。各種抗原較適合固定劑的選擇見下表2、組織塊的大小組織塊的大小以１．５ｃｍ×１．５ｃｍ×０．５ｃｍ為宜。3、固定時(shí)間要根據(jù)組織塊的大小、固定劑的種類及濃度來決定，固定時(shí)間與組織塊的大小成正比，與固定劑的濃度成反比。4、溫度一般在室溫下進(jìn)展，電鏡標(biāo)本或固定時(shí)間較長時(shí)可放置在４℃冰箱。5、固定后處理組織經(jīng)固