熒光定量PCR實驗技術(shù)干貨課件

熒光定量PCR技術(shù)及數(shù)據(jù)處理分析項目部熒光定量PCR技術(shù)及數(shù)據(jù)處理分析項目部內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR解析方法熒光定量實驗流程熒光定量PCR儀生工熒光定量產(chǎn)品選擇指南2內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理22熒光定量PCR原理－－定義實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，對起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實時檢測3熒光定量PCR原理－－定義實時定量PCR技術(shù)：33熒光定量PCR原理－－標(biāo)記方法4SYBRGreenI4TaqManProbe分子信標(biāo)熒光定量PCR原理－－標(biāo)記方法4SYBRGreenI4T4SYBRGreenI染料法－－SYBRGreenI5SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI5SYBRGreenI染料法－－SYBRGreenI5SYBRGreenI染料法－－作用機(jī)理66SYBRGreenI染料法－－作用機(jī)理666SYBRGreenI染料法－－融解曲線7將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜對數(shù)圖譜7SYBRGreenI染料法－－融解曲線7將溫度與熒光強(qiáng)7SYBRGreenI染料法－－融解曲線8融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光：定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光：定量不準(zhǔn)確8SYBRGreenI染料法－－融解曲線8融解曲線分析，8Taqman探針法－－原理95′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)，MGB為不發(fā)光的熒光基團(tuán)探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針，R與Q分開，發(fā)熒光。

9Taqman探針法－－原理95′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Repo9Taqman探針法－－工作機(jī)理10熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探針DNA聚合酶引物RRRR10Taqman探針法－－工作機(jī)理10熱變性引物和探針與模板退10Taqman探針法－－PCR體系的建立引物、探針的設(shè)計：探針Tm為68-70℃,<30bp,5’不能有G,G可能會淬滅熒光素引物盡量靠近探針,擴(kuò)增片段<400bp,引物Tm為59-60℃反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94℃，10-20S

60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：100-900nM探針濃度：50-300nM其他與常規(guī)PCR相同1111Taqman探針法－－PCR體系的建立引物、探針的設(shè)計：111實時熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)12標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑12實時熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)12標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)12實時熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)13FRET13實時熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)13FRET1313幾種熒光定量PCR方法的應(yīng)用比較1414幾種熒光定量PCR方法的應(yīng)用比較141414熒光定量PCR原理－－常用名詞概念擴(kuò)增曲線熒光閾值Ct值1515熒光定量PCR原理－－常用名詞概念擴(kuò)增曲線151515熒光定量PCR原理－－擴(kuò)增曲線16Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase平臺期熒光基團(tuán)熒光檢測元件16熒光定量PCR原理－－擴(kuò)增曲線16Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（16熒光定量PCR原理－－熒光閾值17Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase平臺期前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動設(shè)置:大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段真正的信號:熒光信號超過閾值Threshold17熒光定量PCR原理－－熒光閾值17Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（17熒光定量PCR原理－－Ct值18Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Ctvalue18熒光定量PCR原理－－Ct值18Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒18熒光定量PCR原理－－Ct值的重現(xiàn)性19橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性19熒光定量PCR原理－－Ct值的重現(xiàn)性19橫軸：PCR反映循環(huán)19熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理20理想的PCR反應(yīng)Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0

：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)20熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理20理想的PCR反20熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理21非理想的PCR反應(yīng)Xn＝X0

（1＋En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0

：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率21熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理21非理想的PCR21熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理22在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時XCt＝X0*（1＋En）Ct＝M

（1）整理方程式（2）：方程式（1）兩邊同取對數(shù)得：XCt：熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值時擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個常數(shù)，定為MLog2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct

（2）Log2X0

=Log

2M

-CtLog2（1＋En）22熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理22在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到22熒光定量PCR原理－－Ct值與起始模板量的關(guān)系23CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。23熒光定量PCR原理－－Ct值與起始模板量的關(guān)系23Cycle23熒光定量PCR原理－－熒光定量反應(yīng)性的確認(rèn)24線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率：-3－-3.5PCR擴(kuò)增效率（E）：0.9-1.2檢測靈敏度確認(rèn)35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增Notemplatecontrol確認(rèn)35Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生24熒光定量PCR原理－－熒光定量反應(yīng)性的確認(rèn)24線性關(guān)系、擴(kuò)增24熒光定量PCR技術(shù)的主要應(yīng)用定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，GMO定量檢測等相對定量研究：mRNA表達(dá)量分析，siRNA效果確認(rèn)，差異顯示結(jié)果驗證等2525熒光定量PCR技術(shù)的主要應(yīng)用定性分析研究：雜合或純合子鑒定，25熒光定量PCR的解析方法絕對定量解析方法相對定量解析方法2626熒光定量PCR的解析方法262626絕對定量的定義27Sample25Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量27絕對定量的定義27Sample25Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)27絕對定量分析幾要素28一個目的基因

——即需要確定其量值的核酸序列。一組標(biāo)準(zhǔn)樣本

——用來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢允呛心康幕虻馁|(zhì)粒、PCR產(chǎn)物、基因組DNA等。重復(fù)反應(yīng)孔–——建議每個樣本使用三個或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計顯著性。標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreenI法或Taqman探針法均可。實驗結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線；融解曲線(探針法不需要)。28絕對定量分析幾要素28一個目的基因——即需要確定其量值的核28絕對定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備29PCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒目的基因基因組DNA質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用29絕對定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備29PCR目的基因克隆目的基因目的基29質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法30倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v30質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法30倍比梯度稀釋方法：3030絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量31方法：檢測畢赤酵母的A基因標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為5個濃度；3個重復(fù)；設(shè)陰性空白對照實驗步驟：提取ADNA；

設(shè)計特異引物；設(shè)計TaqMan探針并標(biāo)記探針；熒光定量擴(kuò)增；結(jié)果分析：獲取畢赤酵母的A的精確copy數(shù)。31絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量31方法：檢測畢赤31絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量3232絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量323232絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量33擴(kuò)增效率（E）計算

E=10-1/斜率

-1=10-1/-3.481

-1

=1.983-1=0.938標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.481x+40.123R2=0.9996

相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。33絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量33擴(kuò)增效率（E）33絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量34未知樣品拷貝數(shù)的計算將Ct值帶入線性方程：18.45=-3.481X+40.123QuantityUnknown=106.226

=1682674copiesX=18.45-40.123-3.481=6.22634絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量34未知樣品拷貝數(shù)34相對定量的必要性35SampleBSampleA目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同實際目的基因表達(dá)量分析35相對定量的必要性35SampleBSampleA目的基因35相對定量分析方法36比較兩個或兩個以上樣本中某個基因表達(dá)量的變化！關(guān)注點：基因的相對表達(dá)量，而不是基因的絕對量！36相對定量分析方法363636相對定量分析幾要素37一個參照樣本一個或一個以上的未知樣本一個目的基因管家基因——用來校對不同樣本之間目的基因的實際表達(dá)量重復(fù)反應(yīng)孔——建議每個樣本使用三個或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計顯著性標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可實驗結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線（有些分析方法不需要）；融解曲線（探針法不需要）一組標(biāo)準(zhǔn)樣本（有些分析方法不需要）37相對定量分析幾要素37一個參照樣本3737相對定量分析－－管家基因篩選38管家基因維持細(xì)胞基本代謝活動所必須的基因，如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法根據(jù)文獻(xiàn)提供通過具體實驗篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實驗組實驗值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O38相對定量分析－－管家基因篩選38管家基因0123456Sa38相對定量分析－－兩種常用的分析方法39雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-△△Ct法39相對定量分析－－兩種常用的分析方法393939相對定量分析－－雙標(biāo)曲線法40通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對表達(dá)量。公式：相對值=校正值=目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值對照樣品的校正值40相對定量分析－－雙標(biāo)曲線法40通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣40相對定量分析－－雙標(biāo)曲線法41優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一實驗數(shù)據(jù)41相對定量分析－－雙標(biāo)曲線法41優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡41相對定量分析－－2－△△Ct法42假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增效率相同：或最后用任一待測樣本q的XN

除以對照樣本（calibrator，cb）的XN

得到：

對于一個少于150bp的擴(kuò)增片斷而言，如果Mg2+濃度、引物都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，擴(kuò)增效率接近于1。因此目標(biāo)序列的量通過內(nèi)均一化處理之后相對于參照因子而言就是：XT是目標(biāo)基因達(dá)到設(shè)定的閾值時的分子數(shù)RT是內(nèi)參基因達(dá)到設(shè)定的閾值時的分子數(shù)42相對定量分析－－2－△△Ct法42假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增42相對定量分析－－2－△△Ct法43公式：F=2－優(yōu)點：無需作標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點：假定擴(kuò)增效率為100%；假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致；實驗條件優(yōu)化較為復(fù)雜。應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一

待測組目的基因平均Ct值待測組內(nèi)參基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組內(nèi)參基因平均Ct值－－－43相對定量分析－－2－△△Ct法43公式：F=2－優(yōu)點：無需43相對定量分析－－2－△△Ct法44實驗數(shù)據(jù)：2-△△Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100%

△Ct（處理前）＝15－13＝2△Ct（處理后）＝18－20=－2

△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－2－2＝－4比率（處理后/處理前）＝2－△△Ct＝2－（－4）＝16所以Jun基因在處理后表達(dá)水平是處理前的16倍修正方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有相同的擴(kuò)增效率，但擴(kuò)增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴(kuò)增效率為1.95，那么計算公式可修正為1.95－△△Ct44相對定量分析－－2－△△Ct法44實驗數(shù)據(jù)：2-△△Ct44熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項45樣品制備定量體系配備引物設(shè)計反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇分析方法45熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項45樣品制45熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項46樣品制備環(huán)境要求定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具純度高、完整性好的RNA分光光度計檢測電泳檢測46熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項46樣品制46熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項47樣品制備試劑選擇定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化AMVM-MLV高效，全長的cDNA下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積引物的選擇47熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項47樣品制47熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項48樣品制備誤差控制定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定引物設(shè)計環(huán)境要求使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（≥3次）設(shè)置空白和陰性對照均一的反應(yīng)液和模板混合物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間GC％：50－60％Tm：50－65℃單個堿基重復(fù)＜4個無二級結(jié)構(gòu)擴(kuò)增長度：100－200bp核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)48熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項48樣品制48熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項49樣品制備定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)品待測樣本陽性對照陰性對照退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時間：產(chǎn)物長度決定反應(yīng)體積＞5ul，推薦20－50ul引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化Mg2＋調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)擴(kuò)增效率：90％－110％重復(fù)性：std＜0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：R＞0.99或R2＞0.9849熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項49樣品制49熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項50樣品制備定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)自配購買即用型RCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseries分裝控制內(nèi)參控制機(jī)器校正控制可靠，準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)技能要求誤差控制儀器介紹試劑選擇50熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項50樣品制50熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項51樣品制備定量體系配備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)儀器介紹分析方法平滑曲線，重復(fù)性好，靈敏度高相對定量：2－△△Ct法絕對定量：標(biāo)準(zhǔn)曲線法51熒光定量(SYBRGreen)實驗流程及注意事項51樣品制51熒光定量PCR實驗技術(shù)干貨課件52熒光定量PCR技術(shù)及數(shù)據(jù)處理分析項目部熒光定量PCR技術(shù)及數(shù)據(jù)處理分析項目部內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR解析方法熒光定量實驗流程熒光定量PCR儀生工熒光定量產(chǎn)品選擇指南54內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理254熒光定量PCR原理－－定義實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，對起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實時檢測55熒光定量PCR原理－－定義實時定量PCR技術(shù)：355熒光定量PCR原理－－標(biāo)記方法56SYBRGreenI56TaqManProbe分子信標(biāo)熒光定量PCR原理－－標(biāo)記方法4SYBRGreenI4T56SYBRGreenI染料法－－SYBRGreenI57SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI57SYBRGreenI染料法－－SYBRGreenI57SYBRGreenI染料法－－作用機(jī)理5858SYBRGreenI染料法－－作用機(jī)理6658SYBRGreenI染料法－－融解曲線59將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜對數(shù)圖譜59SYBRGreenI染料法－－融解曲線7將溫度與熒光強(qiáng)59SYBRGreenI染料法－－融解曲線60融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光：定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光：定量不準(zhǔn)確60SYBRGreenI染料法－－融解曲線8融解曲線分析，60Taqman探針法－－原理615′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)，MGB為不發(fā)光的熒光基團(tuán)探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針，R與Q分開，發(fā)熒光。

61Taqman探針法－－原理95′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Repo61Taqman探針法－－工作機(jī)理62熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探針DNA聚合酶引物RRRR62Taqman探針法－－工作機(jī)理10熱變性引物和探針與模板退62Taqman探針法－－PCR體系的建立引物、探針的設(shè)計：探針Tm為68-70℃,<30bp,5’不能有G,G可能會淬滅熒光素引物盡量靠近探針,擴(kuò)增片段<400bp,引物Tm為59-60℃反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94℃，10-20S

60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：100-900nM探針濃度：50-300nM其他與常規(guī)PCR相同6363Taqman探針法－－PCR體系的建立引物、探針的設(shè)計：163實時熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)64標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑64實時熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)12標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)64實時熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)65FRET65實時熒光定量PCR分類－－分子信標(biāo)13FRET1365幾種熒光定量PCR方法的應(yīng)用比較6666幾種熒光定量PCR方法的應(yīng)用比較141466熒光定量PCR原理－－常用名詞概念擴(kuò)增曲線熒光閾值Ct值6767熒光定量PCR原理－－常用名詞概念擴(kuò)增曲線151567熒光定量PCR原理－－擴(kuò)增曲線68Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase平臺期熒光基團(tuán)熒光檢測元件68熒光定量PCR原理－－擴(kuò)增曲線16Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（68熒光定量PCR原理－－熒光閾值69Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLg－linerphase平臺期前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動設(shè)置:大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段真正的信號:熒光信號超過閾值Threshold69熒光定量PCR原理－－熒光閾值17Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（69熒光定量PCR原理－－Ct值70Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Ctvalue70熒光定量PCR原理－－Ct值18Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒70熒光定量PCR原理－－Ct值的重現(xiàn)性71橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值極具重現(xiàn)性71熒光定量PCR原理－－Ct值的重現(xiàn)性19橫軸：PCR反映循環(huán)71熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理72理想的PCR反應(yīng)Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0

：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)72熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理20理想的PCR反72熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理73非理想的PCR反應(yīng)Xn＝X0

（1＋En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0

：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率73熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理21非理想的PCR73熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理74在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時XCt＝X0*（1＋En）Ct＝M

（1）整理方程式（2）：方程式（1）兩邊同取對數(shù)得：XCt：熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值時擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個常數(shù)，定為MLog2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct

（2）Log2X0

=Log

2M

-CtLog2（1＋En）74熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理22在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到74熒光定量PCR原理－－Ct值與起始模板量的關(guān)系75CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。75熒光定量PCR原理－－Ct值與起始模板量的關(guān)系23Cycle75熒光定量PCR原理－－熒光定量反應(yīng)性的確認(rèn)76線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率：-3－-3.5PCR擴(kuò)增效率（E）：0.9-1.2檢測靈敏度確認(rèn)35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增Notemplatecontrol確認(rèn)35Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生76熒光定量PCR原理－－熒光定量反應(yīng)性的確認(rèn)24線性關(guān)系、擴(kuò)增76熒光定量PCR技術(shù)的主要應(yīng)用定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，GMO定量檢測等相對定量研究：mRNA表達(dá)量分析，siRNA效果確認(rèn)，差異顯示結(jié)果驗證等7777熒光定量PCR技術(shù)的主要應(yīng)用定性分析研究：雜合或純合子鑒定，77熒光定量PCR的解析方法絕對定量解析方法相對定量解析方法7878熒光定量PCR的解析方法262678絕對定量的定義79Sample25Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量79絕對定量的定義27Sample25Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)79絕對定量分析幾要素80一個目的基因

——即需要確定其量值的核酸序列。一組標(biāo)準(zhǔn)樣本

——用來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢允呛心康幕虻馁|(zhì)粒、PCR產(chǎn)物、基因組DNA等。重復(fù)反應(yīng)孔–——建議每個樣本使用三個或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計顯著性。標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreenI法或Taqman探針法均可。實驗結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線；融解曲線(探針法不需要)。80絕對定量分析幾要素28一個目的基因——即需要確定其量值的核80絕對定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備81PCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒目的基因基因組DNA質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用81絕對定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備29PCR目的基因克隆目的基因目的基81質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法82倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v82質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法30倍比梯度稀釋方法：3082絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量83方法：檢測畢赤酵母的A基因標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為5個濃度；3個重復(fù)；設(shè)陰性空白對照實驗步驟：提取ADNA；

設(shè)計特異引物；設(shè)計TaqMan探針并標(biāo)記探針；熒光定量擴(kuò)增；結(jié)果分析：獲取畢赤酵母的A的精確copy數(shù)。83絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量31方法：檢測畢赤83絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量8484絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量323284絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量85擴(kuò)增效率（E）計算

E=10-1/斜率

-1=10-1/-3.481

-1

=1.983-1=0.938標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.481x+40.123R2=0.9996

相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。85絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量33擴(kuò)增效率（E）85絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量86未知樣品拷貝數(shù)的計算將Ct值帶入線性方程：18.45=-3.481X+40.123QuantityUnknown=106.226

=1682674copiesX=18.45-40.123-3.481=6.22686絕對定量實驗例－－畢赤酵母A基因的絕對定量34未知樣品拷貝數(shù)86相對定量的必要性87SampleBSampleA目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同實際目的基因表達(dá)量分析87相對定量的必要性35SampleBSampleA目的基因87相對定量分析方法88比較兩個或兩個以上樣本中某個基因表達(dá)量的變化！關(guān)注點：基因的相對表達(dá)量，而不是基因的絕對量！88相對定量分析方法363688相對定量分析幾要素89一個參照樣本一個或一個以上的未知樣本一個目的基因管家基因——用來校對不同樣本之間目的基因的實際表達(dá)量重復(fù)反應(yīng)孔——建議每個樣本使用三個或更多重復(fù)反應(yīng)，以確保統(tǒng)計顯著性標(biāo)記方法的選擇——SYBRGreen法或探針法均可實驗結(jié)果顯示——擴(kuò)增曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線（有些分析方法不需要）；融解曲線（探針法不需要）一組標(biāo)準(zhǔn)樣本（有些分析方法不需要）89相對定量分析幾要素37一個參照樣本3789相對定量分析－－管家基因篩選90管家基因維持細(xì)胞基本代謝活動所必須的基因，如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法根據(jù)文獻(xiàn)提供通過具體實驗篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實驗組實驗值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O90相對定量分析－－管家基因篩選38管家基因0123456Sa90相對定量分析－－兩種常用的分析方法91雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-△△Ct法91相對定量分析－－兩種常用的分析方法393991相對定量分析－－雙標(biāo)曲線法92通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對表達(dá)量。公式：相對值=校正值=目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值對照樣品的校正值92相對定量分析－－雙標(biāo)曲線法40通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣92相對定量分析－－雙標(biāo)曲線法93優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一實驗數(shù)據(jù)93相對定量分析－－雙標(biāo)曲線法41優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡93相對定量分析－－2－△△Ct法94假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增效率相同：或最后用任一待測樣本q的XN

除以對照樣本（calibrator，cb）的XN

得到：

對于一個少于150bp的擴(kuò)增片斷而言，如果Mg2+濃度、引物都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，擴(kuò)增效率接近于1。因此目標(biāo)序列的量通過內(nèi)均一化處理之后相對于參照因子而言就是：XT是目標(biāo)基因達(dá)到設(shè)定的閾值時的分子數(shù)RT是內(nèi)參基因達(dá)到設(shè)定的閾值時的分子數(shù)94相對定量分析－－2－△△Ct法42假設(shè)目標(biāo)序列與內(nèi)參序列擴(kuò)增94相對定量分析－－2－△△Ct法95公式：F=2－優(yōu)點：無需作標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點：假定擴(kuò)增效率為100%；假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致；實驗條件優(yōu)化較為復(fù)雜。應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一

待測組目的基因平均Ct值待測組內(nèi)參基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組內(nèi)參基因平均Ct值－－－95相對定量分析－－2－△△Ct法43公式：F=2－優(yōu)點：無需95相對定量分析－－2－△△Ct法96實驗數(shù)據(jù)：2-△△Ct