專題1傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用

專題1傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用知識點發(fā)酵：利用微生物或其他生物的細(xì)胞在有氧或無氧條件下繁殖或積累其代謝產(chǎn)物的過程。類型：（1）根據(jù)是否需要氧氣分為：需氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵。（2）根據(jù)產(chǎn)生的產(chǎn)物可分為：酒精發(fā)酵、乳酸發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等一、果酒和果醋制作（一）果酒制作原理1．菌種酵母菌 ，屬于 真 核生物，新陳代謝類型異養(yǎng)兼性厭氧型 。有氧時，酵母菌進(jìn)行有氧呼吸，反應(yīng)式為：C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O+能量，大量繁殖；無氧時，酵母菌能進(jìn)行酒精發(fā)酵，反應(yīng)式為：C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2+能量2．條件：繁殖最適溫度 20℃左右 ，酒精發(fā)酵一般控制在18℃-25℃ 。3．自然發(fā)酵菌種來源：附著于葡萄皮上的野生型酵母菌?，F(xiàn)在工廠化生產(chǎn)果酒，為提高果酒的品質(zhì)，更好地抑制其它微生物的生長，采取的措施是直接在果汁中加入人工培養(yǎng)的酵母菌。（二）果醋的制作原理1．菌種：醋酸菌，屬于原核生物，新陳代謝類為異養(yǎng)需氧型當(dāng)氧氣、糖源都充足時，將糖分解成醋酸；當(dāng)無糖有乙醇時，氧氣充足時，將乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸。反應(yīng)式是：C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O。2．條件：最適合溫度為30～35℃，需要充足的氧氣。3．菌種來源：一般人工加入醋酸菌或醋曲。到當(dāng)?shù)厣a(chǎn)食醋的工廠或菌種保藏中心購買。（三）實驗設(shè)計流程圖及裝置1、流程挑選葡萄沖洗榨汁酒精發(fā)酵果酒發(fā)酵 果酒果醋2、裝置充氣口作用在醋酸發(fā)酵時連接充氣泵進(jìn)行充氣；排氣口作用排出酒精發(fā)酵時產(chǎn)生的CO2；出料口作用是用來取樣的。排氣口要通過一個長而彎曲的膠管與瓶身連接，其目的是防止空氣中微生物的污染。使用該裝置制酒時，應(yīng)該關(guān)閉充氣口；制醋時，應(yīng)將充氣口連接充氣泵，通入無菌空氣。如果沒有充氣裝置，可以將瓶蓋打開，在瓶蓋上紗布，以減少空氣中塵土污染。注意：如果用的是帶蓋的瓶子來做，在酒精發(fā)酵過程中每隔12小時左右要將瓶蓋擰松一次（注意不能打開），以放出CO2再擰緊。在制作果醋時，瓶蓋換成紗布。（四）實驗結(jié)果分析與評價可通過嗅覺和品嘗初步鑒定，并用重絡(luò)酸鉀檢驗酒精存在。在酸性條件下重絡(luò)酸鉀與酒精反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色。（五）操作過程應(yīng)注意的問題（1）為防止發(fā)酵液被污染，體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒。（2）葡萄汁裝入發(fā)酵瓶時，要留出大約1/3的空間。（3）制作葡萄酒時將溫度嚴(yán)格控制在18-25℃，時間控制在10-12d左右，可通過出料口對發(fā)酵的情況進(jìn)行及時的監(jiān)測。（4）制葡萄醋的過程中，將溫度嚴(yán)格控制在30-35℃，時間控制在7-8d，并注意適時通過充氣口充入無菌空氣?！疽呻y點撥】認(rèn)為應(yīng)該先沖洗葡萄還是先除去枝梗？沖洗時還應(yīng)注意哪些問題？應(yīng)該先沖洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗時引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機(jī)會；還應(yīng)注意不能重復(fù)多次沖洗，以免菌種流失。認(rèn)為應(yīng)該從哪些方面防止發(fā)酵液被污染？需要從發(fā)酵制作的過程進(jìn)行全面的考慮，因為操作的每一步都可能混入雜菌。例如：榨汁機(jī)、發(fā)酵裝置要清洗干凈；每次排氣時只需擰松瓶蓋、不要完全揭開瓶蓋等。腐乳的制作1.腐乳制作的原理（1）腐乳的發(fā)酵有多種微生物的協(xié)同作用，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一種絲狀真菌。代謝類型是異養(yǎng)需氧型。生殖方式是孢子生殖，營腐生生活。（2） 毛霉 等微生物產(chǎn)生的蛋白酶可以將豆腐中的 蛋白質(zhì) 分解成小分子的 肽 和 氨基酸 ；脂肪酶可以將 脂肪 水解成 甘油 和 脂肪酸 。（3）現(xiàn)代的腐乳生產(chǎn)是在嚴(yán)格的無菌條件下，將優(yōu)良毛霉菌種直接接種在豆腐上，這樣可以避免 其他菌種的污染 ，保證 產(chǎn)品的質(zhì)量 。2.腐乳制作的實驗流程：讓豆腐長出毛霉→ 加鹽腌制 → 加鹵湯裝瓶 →密封腌制。前期發(fā)酵的主要作用：1.創(chuàng)造條件讓毛霉生長。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。后期發(fā)酵主要是酶與微生物協(xié)同參與生化反應(yīng)的過程。通過各種輔料與酶的緩解作用，生成腐乳的香氣。（1）毛霉的生長：將豆腐塊平放在籠屜內(nèi)，將籠屜中的控制在15～18℃，并保持一定的溫度。來源：1.來自空氣中的毛霉孢子，2.直接接種優(yōu)良毛霉菌種（2）食鹽的作用：1.抑制微生物的生長，避免腐敗變質(zhì)2.析出水分，是豆腐變硬，在后期制作過程中不易酥爛3.調(diào)味作用，給腐乳以必要的咸味（3）配制鹵湯：鹵湯直接關(guān)系到腐乳的色、香、味。鹵湯是由酒及各種香辛料配制而成的。鹵湯中酒的含量一般控制在12%左右。酒的作用：1.防止雜菌污染以防腐2.與有機(jī)酸結(jié)合形成酯，賦予腐乳風(fēng)味3.酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵時間的長短有很大關(guān)系，酒精含量越高，對蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延長；酒精含量過低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質(zhì)的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。香辛料的作用：1.調(diào)味作用2.殺菌防腐作用3.參與并促進(jìn)發(fā)酵過程防止雜菌污染：①用來腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干凈后要用沸水消毒。②裝瓶時，操作要迅速小心。整齊地擺放好豆腐、加入鹵湯后，要用膠條將瓶口密封。封瓶時，最好將瓶口通過酒精燈的火焰，防止瓶口被污染?！疽呻y點撥】1.利用所學(xué)的生物學(xué)知識，解釋豆腐長白毛是怎么一回事？答：豆腐上生長的白毛是毛霉的白色菌絲。嚴(yán)格地說是直立菌絲，在豆腐中還有匍匐菌絲。2.我們平常吃的豆腐，哪種適合用來做腐乳？答：含水量為70%左右的豆腐適于作腐乳。用含水量過高的豆腐制腐乳，不易成形。3.吃腐乳時，你會發(fā)現(xiàn)腐乳外部有一層致密的“皮”。這層“皮”是怎樣形成的呢？它對人體有害嗎？它的作用是什么？答：“皮”是前期發(fā)酵時在豆腐表面上生長的毛霉菌絲，它能形成腐乳的“體”，使腐乳成形。“皮”對人體無害。泡菜的制作及亞硝酸鹽含量的測定1、原理：菌種是乳酸菌，代謝類型是異養(yǎng)厭氧型。在無氧條件下，將糖分解為乳酸。繁殖方式是二分裂。反應(yīng)式為：C6H12O62C3H6O3+能量含抗生素牛奶不能生產(chǎn)酸奶的原因是抗生素殺死乳酸菌。常見的乳酸菌有乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。乳酸桿菌常用于生產(chǎn)酸奶。2、亞硝酸鹽：白色粉末，易溶于水，在食品生產(chǎn)中用作食品添加劑。膳食中的亞硝酸鹽一般不危害人體健康，當(dāng)人體攝入總量達(dá)0.3～0.5g時，會引起中毒；當(dāng)攝入總量達(dá)3g時，會引起死亡。亞硝酸鹽被吸收后隨尿液排出體外，但在適宜pH、溫度和一定微生物作用下形成致癌物質(zhì)亞硝胺。一般在腌制10天后亞硝酸鹽含量開始降低，故在10天后食用最好。3、泡菜腌制過程（1）泡菜壇的選擇①應(yīng)選用火候好、無砂眼、無裂紋、壇沿深、蓋子吻合好的泡菜壇。②檢查時可將壇口向上壓入水中，看壇內(nèi)有無滲水現(xiàn)象。（2）腌制亞硝酸鹽含量發(fā)酵時間（d）①過程：將清水和鹽以4：1的質(zhì)量比例配制鹽水。將鹽水煮沸冷卻后備用。將蔬菜裝至半壇時加入香辛料，裝至八成滿時，加入鹽水，要使鹽水沒過全部菜料蓋好壇蓋。將壇蓋邊沿的水槽中注滿水并注意補(bǔ)水，以保證壇內(nèi)的乳酸菌發(fā)酵所需的無氧環(huán)境。亞硝酸鹽含量發(fā)酵時間（d）②條件：控制腌制的時間、溫度和食鹽的用量。溫度過高、食鹽用量過低，腌制時間過短，容易造成細(xì)胞大量繁殖，亞硝酸鹽含量增加。4、亞硝酸鹽的測定方法：比色法原理：在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)后，與N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結(jié)合形成玫瑰紅色染料，與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)顯色液目測比較，估算泡菜中亞硝酸鹽含量。四、果酒、果醋、腐乳、泡菜制作的比較制作內(nèi)容比較項目果酒果醋腐乳泡菜（酸奶）所用菌種酵母菌（真核）異養(yǎng)兼性厭氧醋酸菌（原核）異養(yǎng)需氧毛霉等（真核）異養(yǎng)需氧乳酸菌（原核）異養(yǎng)厭氧發(fā)酵條件前期需氧，后期不需氧一直需氧一直需氧不需氧控制條件O2的有無無氧有氧有氧無氧最適溫度18℃～25℃30℃～35℃15℃～18℃常溫時間控制10～12天7～8天腌制8天左右腌制10天左右其他條件封閉充氣口適時充氣控制鹽酒用量控制鹽水比例實驗流程圖挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵↓↓果酒果醋讓豆腐上長也毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制相關(guān)反應(yīng)式專題二微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題1微生物的實驗室培養(yǎng)培養(yǎng)基：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，是進(jìn)行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。1、培養(yǎng)基分類：劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點用途按物理性質(zhì)液體培養(yǎng)基不加凝固劑工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基加凝固劑，如瓊脂微生物純化分離、鑒定、活菌計數(shù)等按功能用途選擇培養(yǎng)基允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基從眾多微生物中分離出特定的微生物。舉例見注（3）鑒別培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品對分離的菌種作進(jìn)一步鑒定。如以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變紅，則培養(yǎng)基中有尿素分解菌；伊紅－美藍(lán)培養(yǎng)基可以鑒別大腸桿菌，菌落呈現(xiàn)黑色，帶有金屬光澤注：（1）培養(yǎng)時需震蕩、攪拌的則判斷為液體培養(yǎng)基（2）微生物的純化、分離、鑒定、活菌計數(shù)都需要在固體培養(yǎng)基上形成肉眼可見單菌落來進(jìn)行，單菌落只能在固體培養(yǎng)基形成，不能在液體培養(yǎng)基中形成。（3）配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù)及舉例①在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)。例如,加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌;②改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。例如以尿素為唯一氮源是可以分離出尿素分解菌；以纖維素粉為主要碳源，配以剛果紅染色法可以篩選出纖維素分解菌。以無機(jī)碳源作為唯一碳源的培養(yǎng)基可以分離出自養(yǎng)型微生物以缺乏氮源培養(yǎng)基中可以分離出固氮微生物;以石油作為唯一碳源時,可以分離出石油分解菌。③改變微生物的培養(yǎng)條件。例如,將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境下培養(yǎng),可以得到耐高溫的微生物。2、培養(yǎng)基的成分：培養(yǎng)基的化學(xué)成分包括水、無機(jī)鹽、碳源、氮源等。還需滿足不同微生物對pH、溫度、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及O2的要求。營養(yǎng)要素常見來源功能碳源無機(jī)碳源CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳無機(jī)物①有機(jī)碳既是碳源又是能源，無機(jī)碳源則不能提供能量②構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物；有機(jī)碳源糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、石油、花生粉餅等含碳有機(jī)物氮源無機(jī)氮源無機(jī)氮：NH3、銨鹽、硝酸鹽、N2等合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮的代謝產(chǎn)物有機(jī)氮源牛肉膏、蛋白胨、核酸等特殊營養(yǎng)物質(zhì)維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶、堿基等①酶和核酸的組成成分；②參與代謝過程中的酶促反應(yīng)注：（1）牛肉膏、蛋白胨既屬于碳源也屬于氮源，還含有特殊的營養(yǎng)物質(zhì)如維生素等。（2）判斷同化類型以碳源為依據(jù)，以無機(jī)碳源作為碳源來源的微生物為自養(yǎng)型微生物，反之為異養(yǎng)型。異養(yǎng)微生物只能利用有機(jī)碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。（3）只有固氮微生物才能利用N2。CO2和NH3分別是硝化細(xì)菌碳源和氮源，其中NH3即是硝化細(xì)菌的氮源又是能源物質(zhì)（4）需氧型微生物液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時需透氣、震蕩培養(yǎng)。震蕩培養(yǎng)能提高培養(yǎng)液中溶解氧的含量還能使菌體與培養(yǎng)液充分接觸，提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率；厭氧性微生物培養(yǎng)時需密閉處理無需震蕩，如需提高原料利用率可在培養(yǎng)時密閉攪拌。（5）微生物需要的基本營養(yǎng)成分包括水、無機(jī)鹽、碳源、氮源四大類；有些還需特殊營養(yǎng)物質(zhì)；植物需要的營養(yǎng)成分包括水、礦質(zhì)元素（即無機(jī)鹽）、二氧化碳三大類；動物需要的營養(yǎng)成分包括水、無機(jī)鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六大類。無菌技術(shù)：獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。④實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。1、消毒與滅菌的區(qū)別（1）消毒指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。常用消毒方法如下：①煮沸消毒法（如日常飲食的消毒）②巴氏消毒法（對于一些不耐高溫的液體，如牛奶）③化學(xué)藥劑消毒（如用酒精、氯氣、石炭酸等進(jìn)行）、④紫外線消毒（表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，如接種室、接種箱、無菌操作臺）。（2）滅菌則是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有①灼燒滅菌（接種工具如接種環(huán)、接種針；接種過程中的試管口或瓶口等；涂布器引燃）②干熱滅菌（能耐高溫、需保持干燥的物品，如培養(yǎng)皿和金屬用品等用干熱滅菌箱）③高壓蒸汽滅菌（如培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋）。三、制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1、方法步驟：①計算：根據(jù)培養(yǎng)基配方的比例和所需培養(yǎng)基的體積計算各種成分的用量②稱量③溶化:溶化后調(diào)PH并定容，調(diào)PH后再滅菌④滅菌:裝培養(yǎng)基的錐形瓶用高壓蒸汽滅菌法，培養(yǎng)皿用干熱滅菌⑤倒平板：培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰附近進(jìn)行。2、倒平板操作的步驟：見選修1第17頁（了解）注意事項(1)培養(yǎng)基滅菌后,需冷卻至50℃左右時才能倒平板。(2)左手拿培養(yǎng)皿,右手拿錐形瓶,左手拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙,皿蓋不要完全打開。(3)整個操作在酒精燈火焰旁進(jìn)行,避免雜菌污染。(4)平板冷凝后要倒置的原因:①防止皿蓋上的冷凝水落入培養(yǎng)基,造成污染。②防止培養(yǎng)基表面的水分過度地?fù)]發(fā)接種后培養(yǎng)過程中平板也需倒置是主要為了防止培養(yǎng)基表面的水分過度地?fù)]發(fā)。(5)若倒平板時,培養(yǎng)基濺在皿蓋和皿底之間的部位,這個平板應(yīng)丟棄。四、微生物的純化培養(yǎng)（將聚集在一起的微生物通過平板劃線法或稀釋涂布平板法接種在固體培養(yǎng)基上，使其分散成單個細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后形成單個菌落的過程）微生物接種常用方法：平板劃線法與稀釋涂布平板法（步驟見選修一第18、19頁）方法平板劃線法稀釋涂布平板法概念通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面以便獲得單個菌落。將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)以便獲得單個菌落。包括系列稀釋操作和涂布平板操作兩步接種工具接種環(huán)涂布器注意事項(1)接種環(huán)的灼燒①第一次劃線前:殺死接種環(huán)上的微生物,避免污染培養(yǎng)物②兩次劃線中:殺死殘留菌種,保證每次劃線菌種來自上次劃線末端③劃線結(jié)束后:殺死殘留菌種,避免污染環(huán)境和感染操作者(2)燒灼接種環(huán)后,要冷卻后再進(jìn)行操作,以免溫度太高殺死菌種(3)劃線時最后一區(qū)域不要與第一區(qū)域相連(4)劃線用力要大小適當(dāng),防止用力過大將培養(yǎng)基劃破(1)稀釋操作時:①每支試管及其中的9mL水、移液管等均需滅菌;操作時,試管口和移液管應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行②每次注入菌液后需吹吸三次，使菌液與水充分混勻。(2)涂布平板時①涂布器用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒,取出時,讓多余酒精在燒杯中滴盡,然后將沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上引燃②涂布器引燃處理后需冷卻后使用，以免溫度太高殺死菌種③用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。用途(1)菌種純化、分離、鑒定(1)菌種純化、分離、鑒定（2）活菌計數(shù)(3)形成以菌種為透明圈時的應(yīng)用目的都是將聚集的菌種在培養(yǎng)基上分散成單個細(xì)胞以便形成形成由單個菌落培養(yǎng)接種后都需將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng),防止培養(yǎng)基表面的水分過快揮發(fā)五、結(jié)果分析與評價（思考課本20頁第二段的幾個問題）1、培養(yǎng)基的制作是否合格：將未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2天，無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。2、接種操作是否符合無菌要求3、是否進(jìn)行了及時的觀察與記錄六、菌種的保存（1）頻繁使用的菌種，采用臨時保藏的方法。缺點：保存時間不長，菌種易被污染或產(chǎn)生變異。（2）需要長期保存的菌種，采用甘油管藏的方法。課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)尿素被土壤中的細(xì)菌分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的細(xì)菌之所以能分解尿素，是因為他們能合成脲酶一、實驗室中微生物的分離篩選原理人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。通常將微生物接種到選擇培養(yǎng)基上來進(jìn)行分離篩選。二、統(tǒng)計菌落數(shù)目1、方法：測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法（活菌計數(shù)法）和顯微鏡直接計數(shù)法。2、原理：稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目的原理當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活細(xì)菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般設(shè)置3～5個平板，選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計數(shù)，并取平均值。3、計算公式：每克樣品中的菌落數(shù)=（C/V）*M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（ml），M代表稀釋倍數(shù)。注意事項：（1）、一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進(jìn)行計數(shù)（2）、通常選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30~300之間、適于計數(shù)的平板。因為不同微生物的數(shù)量不同，所以分離不同微生物往往采用不同的稀釋度。如測定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用104105106倍范圍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)；測定真菌的數(shù)量，一般選用102103104倍范圍的稀釋液（3）、同一稀釋度下涂布3個或3個以上的平板培養(yǎng)，目的是設(shè)置重復(fù)試驗，以保證試驗準(zhǔn)確，使結(jié)果更具有說服力。（4）、稀釋涂布平板法統(tǒng)計的活菌數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。（5）、要設(shè)置對照4、實驗步驟：（尿素分解菌的計數(shù)和分離可同時進(jìn)行）（1）土壤取樣：土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。在富含有機(jī)質(zhì)的土壤表層有更多的微生物。（2）制備培養(yǎng)基（3）樣品的稀釋與接種（設(shè)置空白對照和條件對照）（4）微生物的培養(yǎng)與觀察①不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。②每隔24小時統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致一樓菌落的數(shù)目。③一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間），同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征（包括形狀、大小、隆起程度、顏色等方面）?？筛鶕?jù)菌落的特征初步鑒別微生物（5）細(xì)菌計數(shù)每克樣品中的菌落數(shù)=（C/V）*M課題3分解纖維素的微生物的分離纖維素，一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。纖維素與纖維素酶（1）棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。（2）纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養(yǎng)。一、纖維素分解菌的篩選1、篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過顏色反應(yīng)直接對微生物進(jìn)行篩選。剛果紅染色法種類：一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。2、篩選原理：剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，但不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生反應(yīng)。當(dāng)我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅－纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。3、分離分解纖維素的微生物的實驗流程①土壤取樣：選擇富含纖維素的環(huán)境②選擇培養(yǎng)：目的是用選擇性培養(yǎng)基增加纖維素分解菌的數(shù)量，此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定③梯度稀釋④涂布平板：將樣品涂布到鑒別培養(yǎng)基上⑤挑選產(chǎn)生透明圈的菌落此試驗的接種方法是：稀釋涂布平板法二、課題延伸對分解纖維素的微生物進(jìn)行了初步的篩選后，只是分離純化的第一步，為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定量的測定。專題三植物的組織培養(yǎng)技術(shù)課題一菊花的組織培養(yǎng)一、基本概念：1、細(xì)胞分化：在生物個體發(fā)育過程中，細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上出現(xiàn)穩(wěn)定性差異的過程。2、愈傷組織：離體的植物組織或細(xì)胞，在培養(yǎng)了一段時間以后，會通過細(xì)胞分裂，形成愈傷組織，愈傷組織的細(xì)胞排列疏松而無規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。3脫分化：由高度分化的植物組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細(xì)胞的脫分化，或者叫做去分化。4、再分化：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官，這個過程叫做再分化。再分化形成的試管苗，移栽到地里，可以發(fā)育成完整的植物體。5、全能性：具有某種生物全套遺傳信息的任何一個活細(xì)胞，都具有發(fā)育成完整個體的能力，即每個生物細(xì)胞都具有全能性。二、植物組織培養(yǎng)的基本過程外植體eq\o(――→,\s\up7(脫分化))愈傷組織eq\o(――→,\s\up7(再分化))幼苗―→移栽植物組織培養(yǎng)的原理：利用了植物細(xì)胞的全能性三、影響植物組織培養(yǎng)的條件1、材料：不同的植物組織，培養(yǎng)的難易程度差別很大。同一植物材料的年齡、保存時間的長短等也會影響實驗結(jié)果。菊花組織培養(yǎng)一般選擇未開花植物的莖上部新萌生的側(cè)枝作材料。一般來說，容易進(jìn)行無性繁殖的植物容易進(jìn)行組織培養(yǎng)。選取生長旺盛嫩枝進(jìn)行組培的是嫩枝生理狀態(tài)好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。2、營養(yǎng)：需要配制適宜的培養(yǎng)基。常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，主要成分包括：①大量元素；②微量元素；③有機(jī)物④常常還需要添加植物激素大量元素和微量元素提供植物細(xì)胞所必需的無機(jī)鹽；有機(jī)物中的蔗糖提供碳源，維持細(xì)胞滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營養(yǎng)為主，不需添加激素；MS培養(yǎng)基則需提供大量無機(jī)營養(yǎng)，常常添加激素。植物激素：生長素和細(xì)胞分裂素是最常用的植物激素。兩者用量的比例影響植物細(xì)胞的發(fā)育方向（如表1）。其濃度、使用的先后順序、用量的比例等都影響實驗結(jié)果（如表2）。表一表2生長素／細(xì)胞分裂素比值與結(jié)果比值高時有利于根的分化，抑制芽的形成比值低時有利于芽分化，抑制根的形成比值適中促進(jìn)愈傷組織生長使用順序?qū)嶒灲Y(jié)果先生長素，后細(xì)胞分裂素有利于分裂但不分化先細(xì)胞分裂素，后生長素細(xì)胞既分裂也分化同時使用分化頻率提高3、環(huán)境條件：PH、溫度、光照等環(huán)境條件也很重要。不同的植物對各種條件的要求往往不同。進(jìn)行菊花的組織培養(yǎng)，一般將pH控制在5.8左右，溫度控制在18~22℃，并且每日用日光燈照射12h.四、實驗操作（一）配制MS固體培養(yǎng)基：1、配制各種母液：將各種成分按配方比例配制成的濃縮液（培養(yǎng)基母液）。使用時根據(jù)母液的濃縮倍數(shù)，計算用量，并加蒸餾水稀釋。2、配制培養(yǎng)基：應(yīng)加入的物質(zhì)有瓊脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有機(jī)物和植物激素的母液，并用蒸餾水定容到1000毫升，調(diào)節(jié)PH，最后分裝到錐形瓶。在菊花組織培養(yǎng)中，可以不添加植物激素。原因是菊花莖段組織培養(yǎng)比較容易。3、滅菌：采取的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌。（二）外植體的消毒外植體：用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。選材——沖刷——分別用70%的酒精、0.1%的氯化汞消毒——沖洗。注意：對外植體進(jìn)行表面消毒時，就要考慮藥劑的消毒效果，又要考慮植物的耐受能力。（三）接種：接種過程中插入外植體時形態(tài)學(xué)上端朝上，每個錐形瓶接種7～8個外植體。外植體接種與細(xì)菌接種相似，操作步驟相同，而且都要求無菌操作。（四）培養(yǎng)：應(yīng)該放在無菌箱中進(jìn)行，并定期進(jìn)行消毒，保持適宜的溫度（18~22℃）和光照（12h）（五）移栽（六）栽培外植體在培養(yǎng)過程中可能會被污染，原因有外植體消毒不徹底；培養(yǎng)基滅菌不徹底；接種中被雜菌污染；錐形瓶密封性差等。五、植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：1、實現(xiàn)優(yōu)良品種的快速繁殖，保持遺傳性狀的一致；2、培育脫毒作物，以提高作物產(chǎn)量；3、可以實現(xiàn)花卉的連續(xù)生產(chǎn)，不受開花季節(jié)的限制；4、培育作物新品種以及細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)、制作人工種子等；專題二月季的花藥培養(yǎng)被子植物的花粉的發(fā)育被子植物花藥為囊狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部含有許多花粉?；ǚ凼怯苫ǚ勰讣?xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂而形成的，因此，花粉是單倍體的生殖細(xì)胞。被子植物花粉的發(fā)育要經(jīng)歷小孢子四分體時期、單核期和雙核期等階段。自己畫出從小孢子母細(xì)胞到形成精子的流程圖二、產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑通過花藥培養(yǎng)產(chǎn)生花粉植株（即單倍體植株）一般有兩種途徑，一種是花粉通過胚狀體階段發(fā)育為植物，另一種是花粉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上先形成愈傷組織，再將其誘導(dǎo)分化成植株。這兩種途徑之間并沒有絕對的界限，主要取決于培養(yǎng)基中激素的種類及其濃度配比。自己畫示意圖：注意：①無論哪種產(chǎn)生方式，都要先誘導(dǎo)生芽，再誘導(dǎo)生根②胚狀體：植物體細(xì)胞組織培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)產(chǎn)生的形態(tài)與受精卵發(fā)育成的胚非常類似的結(jié)構(gòu)，其發(fā)育也與受精卵發(fā)育成的胚類似，有胚芽、胚根、胚軸等完整結(jié)構(gòu)，就像一粒種子，又稱為細(xì)胞胚。影響花藥培養(yǎng)的因素誘導(dǎo)花粉能否成功及誘導(dǎo)成功率的高低，受多種因素影響，其中材料的選擇與培養(yǎng)基的組成是主要的影響因素·親本的生理狀況：花粉早期時的花藥比后期的更容易產(chǎn)生花粉植株，一般選擇月季的初花期?！ず线m的花粉發(fā)育時期：一般來說，在單核期，細(xì)胞核由中央移向細(xì)胞一側(cè)的時期，花藥培養(yǎng)成功率最高·花蕾：選擇完全未開放的花蕾，為了能挑選到單核期的花藥。此外親本植株的生長條件、材料的低溫預(yù)處理以及接種密度等對誘導(dǎo)成功率都有一定影響實驗操作1、材料的選取：選擇花藥時，一般要通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。確定花粉發(fā)育時期的最常用的方法是醋酸洋紅法。但是，某些植物的花粉細(xì)胞核不易著色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色2、材料的消毒3、接種和培養(yǎng)：滅菌后的花蕾，要在無菌條件下除去萼片和花瓣，并立即將花藥接種到培養(yǎng)基上。在剝離花藥時，要盡量不損傷花藥（否則接種后容易從受傷部位長生愈傷組織），同時還要徹底去除花絲，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成，通常每瓶接種花藥7～10個,培養(yǎng)溫度控制在25℃左右,不需要光照.幼小植株形成后才需要光照.一般經(jīng)過20～30天培養(yǎng)后,會發(fā)現(xiàn)花藥開裂,長出愈傷組織或形成胚狀體。將愈傷組織及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分化出再生植株。如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥內(nèi)就會產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。還需要對培養(yǎng)出來的植株做進(jìn)一步的鑒定和篩選。植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的相同之處是：培養(yǎng)基配制方法、無菌技術(shù)及接種操作等基本相同。植物組織培養(yǎng)技術(shù)和花藥離體培養(yǎng)技術(shù)的異同項目內(nèi)容菊花的組織培養(yǎng)月季的花藥培養(yǎng)理論依據(jù)植物細(xì)胞的全能性基本過程脫分化→再分化外植體的細(xì)胞類型體細(xì)胞生殖細(xì)胞操作流程制備培養(yǎng)基→外植體消毒→接種→培養(yǎng)→移栽→栽培選材→消毒→接種和培養(yǎng)→篩選和誘導(dǎo)→移栽→栽培選育影響因素選材、營養(yǎng)、植物激素、pH、溫度、陽光等培養(yǎng)結(jié)果正常植株單倍體植株可育性可育高度不育，秋水仙素處理后可育五、花藥培養(yǎng)的應(yīng)用：主要用于單倍體育種，用二倍體植物的花藥經(jīng)花藥培養(yǎng)為單倍體植株，再經(jīng)人工誘導(dǎo)是染色體數(shù)目加倍，重新恢復(fù)到正常植株的染色體數(shù)目。這樣的植株能正常生殖且為純合子專題6植物有效成分的提取課題一植物芳香油的提取一、植物芳香油的來源天然香料的主要來源：植物、動物。此外真菌也能產(chǎn)生芳香化合物。植物芳香油可來自不同植物的不同部位，根、莖、葉、花、果實、種子都可以提取芳香油。如玫瑰花用于提取玫瑰油，樟樹樹干用于提取樟油。芳香油的物理性質(zhì)：揮發(fā)性強(qiáng)，易溶于有機(jī)溶劑，比重較輕化學(xué)本質(zhì)：以萜類化合物及其衍生物為主。二、植物芳香油的提取方法植物芳香油的提取方法有蒸餾、壓榨和萃取等。具體采用那種方法要根據(jù)植物原料的特點來定。提取方法實驗原理方法步驟適用原料特點優(yōu)點局限性（缺點）水蒸氣蒸餾法水蒸汽可將揮發(fā)性較強(qiáng)的芳香油攜帶出來形成油水混合物，冷卻后水油分層1.水蒸氣蒸餾2.分離油層3.除水過濾適用于提取玫瑰油、薄荷油等揮發(fā)性較強(qiáng)的原料簡單易行便于分離有些原料不適用，如柑橘、檸檬等會導(dǎo)致原料焦糊，有效成分水解等問題壓榨法通過機(jī)械加壓，壓榨出果皮中的芳香油1.石灰水浸泡、漂洗2.壓榨、過濾、靜置3.再過濾適用于柑橘、檸檬等易焦糊且含芳香油較高原料的提取生產(chǎn)成本低，易保持原料原來的結(jié)構(gòu)和功能分離較為困難，出油率較低萃取法芳香油易溶于有機(jī)溶劑，溶劑揮發(fā)后得到芳香油1.粉碎、干燥2.萃取、過濾3.濃縮不適于用水蒸氣蒸餾的原料，可考慮用萃取法，要求原料的顆粒要盡可能細(xì)小，能充分浸泡在有機(jī)溶劑中出油率高，易分離有機(jī)溶劑必須事先精制，除去雜質(zhì)，否則會影響芳香油的質(zhì)量玫瑰精油和橘皮精油提取的實驗設(shè)計（一）玫瑰精油提取的實驗設(shè)計1、原理：玫瑰精油是制作高級香水的主要成分，能使人產(chǎn)生愉悅感。由于玫瑰精油化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，能隨水蒸氣一同蒸餾，通常采用水蒸氣蒸餾法中的水中蒸餾法。2實驗流程：玫瑰油＋水水蒸氣蒸餾油水混合物分離油層除水玫瑰油。（1:4）（加氯化鈉（加無水硫酸鈉用分液漏斗)再過濾）氯化鈉的作用：增加水層密度，促使油水混合物（乳濁液）中油和水的分離。無水硫酸鈉的作用：吸收油層中的水分。3、蒸餾裝置包括：整套蒸餾裝置可分為左、中、右三部分，其中左邊的部分通過加熱進(jìn)行蒸餾，中部將蒸餾物冷凝，右邊的部分用來接收。安裝儀器一般都按照自下而上、從左到右的順序。保證進(jìn)水口在下，出水口在上，拆卸儀器的順序與安裝時相反。蒸餾時，先通水再加熱，完畢后先撤出熱源，然后停止通水。4、實驗步驟：①采集玫瑰花：采集盛花期（5月中上旬）的玫瑰花，清水清洗瀝干。②裝入蒸餾原料：稱取50g玫瑰花放入蒸餾瓶，添加200mL蒸餾水。③安裝蒸餾裝置：按照從左向右、自下到上次序安裝水蒸氣蒸餾裝置。④加熱蒸餾：控制蒸餾時間和速度（1～2滴/秒），獲得乳白色乳濁液；拆卸裝置。⑤分離油層：向乳濁液加入NaCl溶液后，利用分液漏斗分離出上面的