基因克隆技術(shù)課件

2008.11.28基因克隆的技術(shù)方法探討

2008.11.28基因克隆的技術(shù)方法探討1基因工程所用到的酶系（一）限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）能識(shí)別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶。簡稱為限制性酶（restritionenzyme）?；蚬こ趟玫降拿赶担ㄒ唬┫拗菩院怂醿?nèi)切酶（restrict2取微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成三個(gè)斜體字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后發(fā)現(xiàn)幾個(gè)不同的酶，則用羅馬數(shù)字加以表示。EcoRI表示大腸桿菌屬名第一個(gè)字母E：表示種名頭兩個(gè)字母co：表示株名R：表示該菌中第一個(gè)被分離出來的酶。I：取微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組3HindIII的識(shí)別序列：5`-AAGCTT-3`3`-TTCGAA-5`5`-AAGCTT-3`3`-TTCGAA-5`切割后形成具有粘性末端（cohesiveend）的DNA片段：限制性酶一般不在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上切割，而是交錯(cuò)切割結(jié)果形成5或3單鏈突出的粘性末端的DNA限制片段。二個(gè)具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以通過堿基的互補(bǔ)及DNA連接酶的作用而重新連接起來。HindIII的識(shí)別序列：5`-AAGCTT-34HpaI的識(shí)別序列：5`-GTTAAC-3`3`-CAATTG-5`5`-GTTAAC-3`3`-CAATTG-5`切割后形成具有平末端（bluntend）的DNA片段：限制酶在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上切割，形成的DNA片段沒有突出的單鏈。具有平末端的DNA片段也可以在DNA連接酶的作用連接起來HpaI的識(shí)別序列：5`-GTTAAC-35（三）DNA連接酶（DNAligase）DNA連接酶可以將兩個(gè)DNA片段的3’-OH與5’-P連接起來

（二）DNA聚合酶具有催化DNA鏈從5’→3’方向聚合反應(yīng)的活性，還具有從5’→3’(其小片段)和從3’→5’(大片段)的外切核酸酶活性。

（三）DNA連接酶（DNAligase）（二）DNA聚合酶6基因克隆技術(shù)課件7三、基因工程所用到的克隆載體以擴(kuò)增外源DNA為目的載體-克隆載體（cloningvector）（1）載體在細(xì)胞中必須能夠進(jìn)行獨(dú)立自主地復(fù)制（3）載體必須具有可供選擇的遺傳標(biāo)記（2）載體應(yīng)具有酶切位點(diǎn)，便于外源DNA的插入三、基因工程所用到的克隆載體以擴(kuò)增外源DNA為目的載體-克隆8a）低分子量；還應(yīng)具備的特點(diǎn)：b）具有較高拷貝數(shù)；c）易于導(dǎo)入細(xì)胞；d）具有安全性；a）低分子量；還應(yīng)具備的特點(diǎn)：b）具有較高拷貝數(shù)；c）易于導(dǎo)9基因克隆技術(shù)課件10穿梭載體穿梭載體11表達(dá)載體表達(dá)載體12基因工程的基本過程1.基因分離或合成：2.體外重組3.重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞4.特定克隆子的篩選基因工程的基本過程1.基因分離或合成：2.體外重組3.13基因克隆技術(shù)課件14構(gòu)建基因文庫（目的基因所在菌株）導(dǎo)入缺陷型菌株或突變菌株篩選能功能互補(bǔ)的克隆獲得目的基因鳥槍法克隆新的目的基因構(gòu)建基因文庫（目的基因所在菌株）導(dǎo)入缺陷型菌株或突變菌株篩選15有機(jī)磷水解酶基因的克隆文庫構(gòu)建有機(jī)磷水解酶基因的克隆文庫構(gòu)建16TotalDNAextractionSau3AIpartialdigest(gatc)TotalDNAextractionSau3AIpar17Recoveryof2-4kbfragmentsligation載體脫磷puc19載體BamHI酶切puc19載體提取gatcctagSau3AI:ggatcccctaggBamHI:轉(zhuǎn)化,挑選轉(zhuǎn)化子篩選陽性克隆Recoveryof2-4kbfragmentslig18在理論上，構(gòu)建的基因文庫采用Clarke的統(tǒng)計(jì)公式計(jì)算：N=ln（1-p）/ln（1-x/y）P是從建成的文庫中可能篩選出某個(gè)基因的概率，x指該文庫中每個(gè)獨(dú)立克隆所含有外源DNA片段的平均長度，y是該生物基因組的大小，N是該文庫應(yīng)含的克隆數(shù)目。在理論上，構(gòu)建的基因文庫采用Clarke的統(tǒng)計(jì)公式計(jì)算：19Positiveclonesandpuc19陽性克隆在含有相應(yīng)農(nóng)藥的平板上產(chǎn)生水解圈Positiveclonesandpuc19陽性克隆在20基因克隆技術(shù)課件21基因克隆技術(shù)課件22如何做亞克隆?-----以四氫嘧啶降解相關(guān)基因?yàn)槔O(shè)計(jì)一個(gè)功能驗(yàn)證的策略設(shè)計(jì)一個(gè)片段分解的策略選擇合適的載體選擇內(nèi)切酶種類和設(shè)計(jì)引物載體雙酶切片段PCR克隆,雙酶切酶連轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5а三親雜交到KT功能驗(yàn)證如何做亞克隆?-----以四氫嘧啶降解相關(guān)基因?yàn)槔O(shè)計(jì)一個(gè)功23雙酶切雙酶切酶連雙酶切雙酶切酶連24內(nèi)切酶的選擇只有ApaI和EcoRI可供選擇內(nèi)切酶的選擇只有ApaI和EcoRI可供選擇255’---CGCTGAATTCGTGAAGTTGCCATATCGCTTAG---3’5’---TATAGGGCCCTTGGCTTGATCGCTAAA---3’正向引物反向引物EcoRIApaI保護(hù)堿基保護(hù)堿基5’---CGCTGAATTCGTGAAGTTGCCATAT262008.11.28基因克隆的技術(shù)方法探討

2008.11.28基因克隆的技術(shù)方法探討27基因工程所用到的酶系（一）限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）能識(shí)別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶。簡稱為限制性酶（restritionenzyme）?；蚬こ趟玫降拿赶担ㄒ唬┫拗菩院怂醿?nèi)切酶（restrict28取微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成三個(gè)斜體字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后發(fā)現(xiàn)幾個(gè)不同的酶，則用羅馬數(shù)字加以表示。EcoRI表示大腸桿菌屬名第一個(gè)字母E：表示種名頭兩個(gè)字母co：表示株名R：表示該菌中第一個(gè)被分離出來的酶。I：取微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組29HindIII的識(shí)別序列：5`-AAGCTT-3`3`-TTCGAA-5`5`-AAGCTT-3`3`-TTCGAA-5`切割后形成具有粘性末端（cohesiveend）的DNA片段：限制性酶一般不在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上切割，而是交錯(cuò)切割結(jié)果形成5或3單鏈突出的粘性末端的DNA限制片段。二個(gè)具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以通過堿基的互補(bǔ)及DNA連接酶的作用而重新連接起來。HindIII的識(shí)別序列：5`-AAGCTT-330HpaI的識(shí)別序列：5`-GTTAAC-3`3`-CAATTG-5`5`-GTTAAC-3`3`-CAATTG-5`切割后形成具有平末端（bluntend）的DNA片段：限制酶在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上切割，形成的DNA片段沒有突出的單鏈。具有平末端的DNA片段也可以在DNA連接酶的作用連接起來HpaI的識(shí)別序列：5`-GTTAAC-331（三）DNA連接酶（DNAligase）DNA連接酶可以將兩個(gè)DNA片段的3’-OH與5’-P連接起來

（二）DNA聚合酶具有催化DNA鏈從5’→3’方向聚合反應(yīng)的活性，還具有從5’→3’(其小片段)和從3’→5’(大片段)的外切核酸酶活性。

（三）DNA連接酶（DNAligase）（二）DNA聚合酶32基因克隆技術(shù)課件33三、基因工程所用到的克隆載體以擴(kuò)增外源DNA為目的載體-克隆載體（cloningvector）（1）載體在細(xì)胞中必須能夠進(jìn)行獨(dú)立自主地復(fù)制（3）載體必須具有可供選擇的遺傳標(biāo)記（2）載體應(yīng)具有酶切位點(diǎn)，便于外源DNA的插入三、基因工程所用到的克隆載體以擴(kuò)增外源DNA為目的載體-克隆34a）低分子量；還應(yīng)具備的特點(diǎn)：b）具有較高拷貝數(shù)；c）易于導(dǎo)入細(xì)胞；d）具有安全性；a）低分子量；還應(yīng)具備的特點(diǎn)：b）具有較高拷貝數(shù)；c）易于導(dǎo)35基因克隆技術(shù)課件36穿梭載體穿梭載體37表達(dá)載體表達(dá)載體38基因工程的基本過程1.基因分離或合成：2.體外重組3.重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞4.特定克隆子的篩選基因工程的基本過程1.基因分離或合成：2.體外重組3.39基因克隆技術(shù)課件40構(gòu)建基因文庫（目的基因所在菌株）導(dǎo)入缺陷型菌株或突變菌株篩選能功能互補(bǔ)的克隆獲得目的基因鳥槍法克隆新的目的基因構(gòu)建基因文庫（目的基因所在菌株）導(dǎo)入缺陷型菌株或突變菌株篩選41有機(jī)磷水解酶基因的克隆文庫構(gòu)建有機(jī)磷水解酶基因的克隆文庫構(gòu)建42TotalDNAextractionSau3AIpartialdigest(gatc)TotalDNAextractionSau3AIpar43Recoveryof2-4kbfragmentsligation載體脫磷puc19載體BamHI酶切puc19載體提取gatcctagSau3AI:ggatcccctaggBamHI:轉(zhuǎn)化,挑選轉(zhuǎn)化子篩選陽性克隆Recoveryof2-4kbfragmentslig44在理論上，構(gòu)建的基因文庫采用Clarke的統(tǒng)計(jì)公式計(jì)算：N=ln（1-p）/ln（1-x/y）P是從建成的文庫中可能篩選出某個(gè)基因的概率，x指該文庫中每個(gè)獨(dú)立克隆所含有外源DNA片段的平均長度，y是該生物基因組的大小，N是該文庫應(yīng)含的克隆數(shù)目。在理論上，構(gòu)建的基因文庫采用Clarke的統(tǒng)計(jì)公式計(jì)算：45Positiveclonesandpuc19陽性克隆在含有相應(yīng)農(nóng)藥的平板上產(chǎn)生水解圈Positiveclonesandpuc19陽性克隆在46基因克隆技術(shù)課件47基因克隆技術(shù)課件48如何做亞克隆?-----以四氫嘧啶降解相關(guān)基因?yàn)槔O(shè)計(jì)一個(gè)功能驗(yàn)證的策略設(shè)計(jì)一個(gè)片段分解的策略選擇合適的載體選擇內(nèi)切酶種類和設(shè)計(jì)引物載體雙酶切片段PCR克隆,雙酶切酶連轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5а三親雜交到KT功能驗(yàn)證如何做亞克隆?-----以四氫嘧