流式細(xì)胞儀原理及軟件介紹課件

流式細(xì)胞儀

FLOWCYTOMETER流式細(xì)胞儀

FLOWCYTOMETERBeckmanCoulter流式細(xì)胞儀發(fā)展史1947年WallaceCoulter發(fā)明了庫(kù)爾特原理，用于血細(xì)胞分析1953年推出了世界上第一臺(tái)流式細(xì)胞分析儀CoulterCounterModelA1972年推出世界上第一臺(tái)激光流式細(xì)胞儀EPICSII1975年研制出世界上第一臺(tái)帶計(jì)算機(jī)的流式細(xì)胞儀1997年推出世界上第一臺(tái)單激光四色數(shù)字化流式細(xì)胞儀EPICSXL/MCL2000年首先將高精度數(shù)字化顏色補(bǔ)償技術(shù)ADC（AdvancedDigitalCompensation）應(yīng)用于流式平臺(tái)，引領(lǐng)流式進(jìn)入全新的全矩陣補(bǔ)償、全自動(dòng)補(bǔ)償和脫機(jī)補(bǔ)償時(shí)代2003年推出世界上第一臺(tái)單激光五色的流式細(xì)胞儀FC500/MCL，2005年升級(jí)為FC500/MPL2006年推出世界上第一臺(tái)具有EV參數(shù)同時(shí)進(jìn)行無成本絕對(duì)計(jì)數(shù)的多功能細(xì)胞分析系統(tǒng)QuantaSC，將流式細(xì)胞術(shù)與庫(kù)爾特原理完美結(jié)合，2007年推出MPL進(jìn)樣系統(tǒng)2007年收購(gòu)Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成為高端流式市場(chǎng)的領(lǐng)導(dǎo)者2009年，推出世界是第一臺(tái)三激光十色的分析型流式細(xì)胞儀Gallios/NaviosBeckmanCoulter流式細(xì)胞儀發(fā)展史1947年WaEPICSXL-ADC

QUANTASCCytomicsFC500BeckmanCoulterCelllabFamilyMoFloXDPGallios/NaviosCyanADPEPICSXL-ADCQUANTASCCytomicFC500硬件FC500硬件Whatisflowcytometry?流式細(xì)胞術(shù)是單個(gè)細(xì)胞/顆粒流過檢測(cè)裝置過程中，檢測(cè)到的物理和/或化學(xué)的特性。HowardShapiro,PracticalFlowCytometry,3rdEditionWhatisflowcytometry?流式細(xì)胞術(shù)是單分類分析型：只能分析用，液流進(jìn)入廢液筒分選型：回收目標(biāo)細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。要求管道絕對(duì)無菌。分類分析型：只能分析用，液流進(jìn)入廢液筒基本原理流路（液流系統(tǒng)）流動(dòng)室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細(xì)胞懸液5*105~1*106個(gè)/ml光路（光學(xué)系統(tǒng)）光源濾片光電倍增管PMTHV電路（電路系統(tǒng)）放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換分析系統(tǒng)：計(jì)算機(jī)基本原理流路（液流系統(tǒng)）液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)流路構(gòu)造流路構(gòu)造流路單細(xì)胞懸液大多數(shù)儀器是在50-300μm大小的孔徑中,將細(xì)胞懸液注射進(jìn)入鞘液中這一過程,成為流體動(dòng)力學(xué)聚焦流路單細(xì)胞懸液FLOWCELLInjector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluidFLOWCELLInjectorFluorescence光路系統(tǒng)光路系統(tǒng)光路構(gòu)造光路構(gòu)造光路光源檢測(cè)信號(hào)散射光信號(hào)

FS:前向角散射光

SS:側(cè)向角散射光(90度散射光)

熒光信號(hào) 熒光染料 光學(xué)濾片光路光源

光路光源 與通過的細(xì)胞聚焦在同一點(diǎn)上激光

空冷 488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,空冷/水冷EnterpriseII水冷Innova300系列 Innova70系列光路光源常用激光器及其通道分配表常用激光器及其通道分配表檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)信號(hào)散射光信號(hào)—前向散射光(FS)FS----Forward

(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的檢測(cè)器,為前向散射光檢測(cè)器

FS的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小,形狀及opticalhomogeneity有關(guān)FS用于檢測(cè)細(xì)胞或其他粒子的表面屬性 如:大小散射光信號(hào)—前向散射光(FS)FS----ForwardFALSSensorLaser前向散射光

FALSSensorLaser前向散射光前向散射光前向散射光散射光信號(hào)–側(cè)向散射光SS-Side

(AngelLight)Scatter

與激光束垂直方向的檢測(cè)器為側(cè)向檢測(cè)器,也稱為90度散射光檢測(cè)器SS用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) 如:胞漿內(nèi)顆粒多少,核質(zhì)比散射光信號(hào)–側(cè)向散射光SS-Side(AngelLFALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散射光FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散側(cè)向散射光側(cè)向散射光90DegreeScatter0

200

400

600

8001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionLightScatterGatingScale90DegreeScatter0200400600光路-熒光信號(hào)每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長(zhǎng),并激發(fā)后會(huì)有發(fā)射波長(zhǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)的即是它特定的發(fā)射波長(zhǎng).

利用各種不同波長(zhǎng)的光學(xué)濾片來收集(檢測(cè))這些光學(xué)信號(hào)光路-熒光信號(hào)每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長(zhǎng),并激發(fā)后會(huì)熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)(nm)發(fā)射波長(zhǎng)(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC633 670常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)(nm)發(fā)5ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5/PC75ColorSingleLaser(488nm)

F熒光染料比較(平均熒光強(qiáng)度)

Q-Prep/ImmunoPrep試劑系統(tǒng)PerCP<APC<FITC<ECD<PC5<PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APC熒光染料比較(平均熒光強(qiáng)度)PerCP<APC<FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)FluorescenceFALSSensorFluores光路-濾片特性

長(zhǎng)通濾片

–

允許長(zhǎng)于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過

短通濾片–

允許短于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過

帶通濾片–

允許一定帶寬的波長(zhǎng)通過光路-濾片特性長(zhǎng)通濾片–允許長(zhǎng)于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過光路-濾片特性當(dāng)以45o

角放置濾片時(shí),該濾片可以通過一定波長(zhǎng)的光,同時(shí)也可以阻斷并折射該波長(zhǎng)以下的光

這種方式的濾片稱為二向色性濾片(dichroicfilter)

光路-濾片特性當(dāng)以45o角放置濾片時(shí),該濾片可濾片帶通濾片BANDPASS(BP)只允許某些波長(zhǎng)的光通過二向色性濾片DICHROICFILTER一定波長(zhǎng)以上通過，該波長(zhǎng)以下折射630nmBandPassFilterTransmittedLightWhiteLightSource620-640nmLightDichroicFilter/Mirrorat45degReflectedlightTransmittedLightLightSource濾片帶通濾片BANDPASS(BP)630nmBa流式細(xì)胞儀原理及軟件介紹課件電路系統(tǒng)電路系統(tǒng)Optics-DetectorsPhotomultipliertube(PMT)

將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù))信號(hào)

Optics-DetectorsPhotomultipl不同的脈沖信號(hào)被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道(CHANNEL)的過程

不同的脈沖信號(hào)被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道(CHANNEL)的過程流式細(xì)胞儀原理及軟件介紹課件SingleParameterHistogram:CountvsMFISingleParameterHistogram:CoSingleParameterHistogramSingleParameterHistogramDualParameterHistogramsDualParameterHistogramsDualParameterHistogramsDualParameterHistogramsthanksthanks流式細(xì)胞儀

FLOWCYTOMETER流式細(xì)胞儀

FLOWCYTOMETERBeckmanCoulter流式細(xì)胞儀發(fā)展史1947年WallaceCoulter發(fā)明了庫(kù)爾特原理，用于血細(xì)胞分析1953年推出了世界上第一臺(tái)流式細(xì)胞分析儀CoulterCounterModelA1972年推出世界上第一臺(tái)激光流式細(xì)胞儀EPICSII1975年研制出世界上第一臺(tái)帶計(jì)算機(jī)的流式細(xì)胞儀1997年推出世界上第一臺(tái)單激光四色數(shù)字化流式細(xì)胞儀EPICSXL/MCL2000年首先將高精度數(shù)字化顏色補(bǔ)償技術(shù)ADC（AdvancedDigitalCompensation）應(yīng)用于流式平臺(tái)，引領(lǐng)流式進(jìn)入全新的全矩陣補(bǔ)償、全自動(dòng)補(bǔ)償和脫機(jī)補(bǔ)償時(shí)代2003年推出世界上第一臺(tái)單激光五色的流式細(xì)胞儀FC500/MCL，2005年升級(jí)為FC500/MPL2006年推出世界上第一臺(tái)具有EV參數(shù)同時(shí)進(jìn)行無成本絕對(duì)計(jì)數(shù)的多功能細(xì)胞分析系統(tǒng)QuantaSC，將流式細(xì)胞術(shù)與庫(kù)爾特原理完美結(jié)合，2007年推出MPL進(jìn)樣系統(tǒng)2007年收購(gòu)Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成為高端流式市場(chǎng)的領(lǐng)導(dǎo)者2009年，推出世界是第一臺(tái)三激光十色的分析型流式細(xì)胞儀Gallios/NaviosBeckmanCoulter流式細(xì)胞儀發(fā)展史1947年WaEPICSXL-ADC

QUANTASCCytomicsFC500BeckmanCoulterCelllabFamilyMoFloXDPGallios/NaviosCyanADPEPICSXL-ADCQUANTASCCytomicFC500硬件FC500硬件Whatisflowcytometry?流式細(xì)胞術(shù)是單個(gè)細(xì)胞/顆粒流過檢測(cè)裝置過程中，檢測(cè)到的物理和/或化學(xué)的特性。HowardShapiro,PracticalFlowCytometry,3rdEditionWhatisflowcytometry?流式細(xì)胞術(shù)是單分類分析型：只能分析用，液流進(jìn)入廢液筒分選型：回收目標(biāo)細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。要求管道絕對(duì)無菌。分類分析型：只能分析用，液流進(jìn)入廢液筒基本原理流路（液流系統(tǒng)）流動(dòng)室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細(xì)胞懸液5*105~1*106個(gè)/ml光路（光學(xué)系統(tǒng)）光源濾片光電倍增管PMTHV電路（電路系統(tǒng)）放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換分析系統(tǒng)：計(jì)算機(jī)基本原理流路（液流系統(tǒng)）液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)流路構(gòu)造流路構(gòu)造流路單細(xì)胞懸液大多數(shù)儀器是在50-300μm大小的孔徑中,將細(xì)胞懸液注射進(jìn)入鞘液中這一過程,成為流體動(dòng)力學(xué)聚焦流路單細(xì)胞懸液FLOWCELLInjector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluidFLOWCELLInjectorFluorescence光路系統(tǒng)光路系統(tǒng)光路構(gòu)造光路構(gòu)造光路光源檢測(cè)信號(hào)散射光信號(hào)

FS:前向角散射光

SS:側(cè)向角散射光(90度散射光)

熒光信號(hào) 熒光染料 光學(xué)濾片光路光源

光路光源 與通過的細(xì)胞聚焦在同一點(diǎn)上激光

空冷 488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,空冷/水冷EnterpriseII水冷Innova300系列 Innova70系列光路光源常用激光器及其通道分配表常用激光器及其通道分配表檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)信號(hào)散射光信號(hào)—前向散射光(FS)FS----Forward

(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的檢測(cè)器,為前向散射光檢測(cè)器

FS的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小,形狀及opticalhomogeneity有關(guān)FS用于檢測(cè)細(xì)胞或其他粒子的表面屬性 如:大小散射光信號(hào)—前向散射光(FS)FS----ForwardFALSSensorLaser前向散射光

FALSSensorLaser前向散射光前向散射光前向散射光散射光信號(hào)–側(cè)向散射光SS-Side

(AngelLight)Scatter

與激光束垂直方向的檢測(cè)器為側(cè)向檢測(cè)器,也稱為90度散射光檢測(cè)器SS用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) 如:胞漿內(nèi)顆粒多少,核質(zhì)比散射光信號(hào)–側(cè)向散射光SS-Side(AngelLFALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散射光FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散側(cè)向散射光側(cè)向散射光90DegreeScatter0

200

400

600

8001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionLightScatterGatingScale90DegreeScatter0200400600光路-熒光信號(hào)每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長(zhǎng),并激發(fā)后會(huì)有發(fā)射波長(zhǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)的即是它特定的發(fā)射波長(zhǎng).

利用各種不同波長(zhǎng)的光學(xué)濾片來收集(檢測(cè))這些光學(xué)信號(hào)光路-熒光信號(hào)每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長(zhǎng),并激發(fā)后會(huì)熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)(nm)發(fā)射波長(zhǎng)(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC633 670常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)(nm)發(fā)5ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5/PC75ColorSingleLaser(488nm)

F熒光染料比較(平均熒光強(qiáng)度)

Q-Prep/ImmunoPrep試劑系統(tǒng)PerCP<APC<FITC<ECD<PC5<PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APC熒光染料比較(平均熒光強(qiáng)度)PerCP<APC<FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)FluorescenceFALSSensorFluores光路-濾片特性

長(zhǎng)通濾片

–

允許長(zhǎng)于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過

短通濾片–

允許短于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過

帶通濾片–

允許一