細(xì)胞染色專題之一：臺盼藍(lán)

細(xì)胞染色專題之一：臺盼藍(lán)臺盼藍(lán)（TrypanBlue,也稱Directblue14）：一種死細(xì)胞染色用色素化學(xué)名：3,3'-{[3,3'-Dimethyl（1,1'-biphenyl）-4,4'-diyl]bis（azo）}bis（5-amino-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfonicacid）,tetrasodiumsalt3,3’-{[3,3’-二甲基-（1,1’-二苯基）-4,4’-二基]雙（偶氮）}-雙（5-氨基-4-羥基-2,7-萘二磺酸），四鈉鹽分子式：C34H24N6Na4O14S4分子量：960.81CASNumber:72-57-1外觀：黑褐色結(jié)晶粉末摩爾吸光度：＞69,000（在606nm附近）染色原理：細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。嚴(yán)格來說，臺盼藍(lán)染色檢測的是細(xì)胞膜的完整性，通常認(rèn)為細(xì)胞膜喪失完整性，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡。這被稱為染料排除測試（dyeexclusion），ErythrosinB（紅色）、negrosine、eosinY、AO和EB也用于此目的。通過顯微鏡很容易就能識別出死亡的被臺盼藍(lán)染色的細(xì)胞，并可使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。溶于水，可以配制成10mg/ml的水溶液，水溶液呈深藍(lán)色。臺盼藍(lán)主要用來鑒定原代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞分離后的存活情況，用0.4%臺盼藍(lán)直接染色5-10分鐘，在顯微鏡下觀察即可。應(yīng)用于細(xì)胞凋亡：如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。盡管在凋亡的早期到中期檢測是很困難的，此方法對反映細(xì)胞膜的完整性，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。儲存條件：常溫保存注意事項(xiàng)：臺盼藍(lán)對人體有毒臺盼藍(lán)染細(xì)胞時(shí)，時(shí)間不宜過長。否則，部分活細(xì)胞也會著色，會干擾計(jì)數(shù)。臺盼藍(lán)染色法對于懸浮細(xì)胞來說，還比較方便，對貼壁細(xì)胞來說，較為繁瑣。因?yàn)橐?，有時(shí)，96孔板不一定能消化干凈。而且，該法是測定細(xì)胞濃度的方法，與細(xì)胞懸液的體積有關(guān)，加入的胰蛋白酶或1640要計(jì)入終體積。可以說，該法相對準(zhǔn)確，可能有一些人為因素的干擾。細(xì)胞染色專題之二：美藍(lán)美藍(lán)英文名：Methyleneblue，Swissblue中文名：亞甲基藍(lán)、次甲基藍(lán)、品藍(lán)、美藍(lán)、亞甲藍(lán)、四甲基藍(lán)、鹽基湖藍(lán)、堿性亞甲天藍(lán)等。分子式：C16H18ClN3S分子量：319.85g/molCASNumber:61-73-4EINECSNumber:200-515-2熔點(diǎn)：100°C沸點(diǎn)：分解吸收峰：668nm和609nm。染色原理：美藍(lán)是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無色。用美藍(lán)對酵母活細(xì)胞染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，而對代謝作用微弱或死細(xì)胞，無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。因此，不僅用此法可觀察酵母細(xì)胞形態(tài)，也可用來鑒別酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞。細(xì)胞染色專題之三：吖啶橙吖啶橙：N,N,N',N'-tetramethylacridine-3,6-diamine中文名：3,6-雙（二甲基氨基）吖啶英文名:AcridineOrange（AO），Euchrysine，3,6-Acridinediamine，WaxolineOrangeA，AcridineOrangeBase，SolventOrange15，RhodulineOrange，RhodulineOrangeN，AcridineOrangeNO，RhodulineOrangeNO，BasicOrange分子式：C17H19N3分子量：265.35g/molCASnumber:10127-02-3外觀：橙色、紅棕色粉末染色原理：吖啶橙（AO）與雙鏈DNA形成發(fā)綠色熒光的復(fù)合物。AO還可與單鏈DAN或RNA形成發(fā)紅色熒光的復(fù)合物。一個(gè)AO分子嵌入雙鏈DNA的三個(gè)堿基對并發(fā)出最大波長為526nm（激發(fā)502nm）的綠色熒光。一個(gè)AO分子與單鏈DNA或RNA的一個(gè)磷酸基相互作用形成聚集或堆疊的結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)發(fā)出最大波長為650nm（激發(fā)460nm）的紅色熒光。因此，AO用于被利用來檢測雙鏈DNA和單鏈DNA或RNA。它使得用氬激光激發(fā)器或流式細(xì)胞儀同時(shí)測定DNA和RNA成為可能。光譜數(shù)據(jù)：與DNA作用時(shí)和熒光素相似，激發(fā)最大波長502nm，發(fā)射最大525nm（綠光）。于RNA作用時(shí)，激發(fā)最大波長移動到460nm（藍(lán)光），發(fā)射最大移動到650nm（紅光）。染色程序：用PBS或合適緩沖液制備10-50UMAO溶液。a）將1/10細(xì)胞培養(yǎng)基體積的AO溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中。b）37C下孵育細(xì)胞10-20分鐘。用PBS或合適緩沖液洗滌細(xì)胞2次。用帶有500nm激發(fā)和530nm發(fā)射濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。由于AO可能具有致癌性，因此操作過程中須格外小心?？梢杂?/10濃度的AO緩沖液代替培養(yǎng)基。儲存條件：避光，冷藏保存細(xì)胞染色專題之四：碘化丙啶碘化丙啶英文名：Propidiumiodide,Propidiumdiiodide;PI分子式：C27H34I2N4分子量：668.39外觀：紅棕色粉末應(yīng)用：DNA染色染色原理：碘化丙啶(PI)是一種漠化乙啶的類似物，它在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色。PI經(jīng)常被用來與Calcein-AM或者FDA等熒光化合物一起使用，能同時(shí)對活細(xì)胞和死細(xì)胞染色。光譜性質(zhì)：PI-DNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為535nm和615nm。染色過程：用PBS或適當(dāng)?shù)木彌_液制備10?50UM的PI溶液。a)將1/10培養(yǎng)基體積的PI溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中。b)在37°C培養(yǎng)細(xì)胞10-20分鐘。用PBS或合適的緩沖液洗滌細(xì)胞兩次。用535nm激發(fā)波長，615nm發(fā)射波長的濾光器的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。由于PI可能具有致癌性，請小心操作。也可以用1/10濃度的PI緩沖液代替培養(yǎng)基。保存條件：4C避光保存對人體有刺激性，請注意適當(dāng)防護(hù)細(xì)胞染色專題之五：羅丹明123羅丹明123：Rhodamine123分子式：C21H17C1N2O3分子量：381外觀：橙紅色、紅棕色固體/粉末溶解性：可溶于DMSOCASNumber：62669-70-9染色原理：Rh123是一種細(xì)胞通透性的、陽離子的熒光探針，容易被有活性的線粒體攝取，沒有細(xì)胞毒性。Rh123透過細(xì)胞膜在活細(xì)胞的線粒體內(nèi)聚集，發(fā)出黃綠色熒光，可用于對許多種細(xì)胞進(jìn)行染色，包括植物細(xì)胞和細(xì)菌。由于細(xì)胞內(nèi)ATP的量與Rh123的熒光強(qiáng)度之間有相關(guān)性，此化合物被應(yīng)用于檢測細(xì)胞內(nèi)的ATP。Rh123還用于癌癥研究。光譜性質(zhì)：lex\lem(MeOH)=505nm\534nm.e(505nm,MeOH)=97,000.染色步驟：將0.4mgRh123溶解到1mlDMSO中制備成1mMRh123-DMSO溶液。用載玻片準(zhǔn)備細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)目應(yīng)為5X10e4-5X10e5個(gè)/ml。孵育該載玻片，用PBS或Hank’s液洗滌細(xì)胞。用培養(yǎng)基稀釋1mMRh123溶液以制備1-20uMRh123緩沖液。將Rh123緩沖液a)加入載玻片并在37°C下孵育30分鐘至1小時(shí)。去除Rh123緩沖液并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。b)用帶有熒光素濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。加入細(xì)胞前將Rh123緩沖液放在37C下孵育。洗滌細(xì)胞后為了固定，加入10%福爾馬林緩沖液并孵育15-20分鐘，接著用PBS洗滌。儲存條件：避光冷藏保存細(xì)胞染色專題之六：漠乙錠漠乙錠：Ethidiumbromide化學(xué)名：漠化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基啡啶英文名：2,7—DiaminoT0—ethyl—6—phenylphenanthridiniumbromide，DiaminoT0—ethyl—9—phenylphenanthridiniumbromide，DiaminoT-ethyl-6-phenylphenantridiniumbromide，Diamino—5—ethyl—6—phenylphenanthridiniumbromide，Homidiumbromide，EB，EtBr別名：胡漠胺;漠乙胺菲啶;漠乙菲啶分子式：C21H20BrN3分子量：394.31g/molCASnumber:1239-45-8熔點(diǎn)：260-262C(fromwiki)性質(zhì)：從酒精中結(jié)晶的是具苦味的深紅晶體，熔點(diǎn)238?240°C；20°C時(shí)溶于20份水和750份氯仿。染色原理：EB不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，然而可以通過死細(xì)胞破損的細(xì)胞膜而對細(xì)胞核DNA染色。EB含有一個(gè)可以嵌入的堆積堿基之間的一個(gè)平面基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，由于EB-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率遠(yuǎn)大于未結(jié)合染料的熒光產(chǎn)率，所以當(dāng)電泳凝膠中含有游離EB時(shí)，也可檢測出少量DNA。它是一種高靈敏的熒光試劑，也是一種重要的熒光染料，常用于檢測DNA和RNA。EB與DNA結(jié)合后抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。光譜性質(zhì)：EB-DNA復(fù)合物的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為518nm和605nm。染色過程：用PBS或合適的緩沖液制備10-50UMEB溶液。a)將1/10培養(yǎng)基體積的EB溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中。b)37C下孵育細(xì)胞10-20分鐘。用PBS或合適的緩沖液洗滌細(xì)胞兩次。用帶有515nm激發(fā)波長和600nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。由于EB可能有致癌性，操作時(shí)須十分小心?？梢杂?/10濃度的EB緩沖液代替培養(yǎng)基。儲存條件：避光，冷凍保存細(xì)胞染色專題之七：曙紅Y曙紅：EosinY中文名：水溶伊紅；四漠熒光黃；朝紅；四漠熒光素鈉；曙紅鈉鹽；曙紅，水溶性；黃光曙紅英文名：EosineYellowish，Bromoeosine，TetrabromofluoresceinC.I.name：Acidred87分子式：C20H6O5Br4Na2分子量：691.9，性質(zhì)：以AgNO3滴定Br-，I-，SCN-等時(shí)用作吸附指示劑。CASNumber:17372-87-1MDLnumber：MFCD00005040ColourIndexNumber:45380光譜性質(zhì)：最大吸收524.8nm；最大激發(fā)490nm染色原理：EosinY為酸性染料，將胞質(zhì)染成粉紅色（嗜酸性），是組織和細(xì)胞化學(xué)常用染色試劑之一，常與蘇木精（hematoxylin，為堿性染料，將核染成紫藍(lán)色（嗜堿性））聯(lián)合使用（HE染色法）。在免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常作為襯染試劑以便于組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀察。存儲條件：室溫避光保存細(xì)胞染色專題之八：蘇木精蘇木精Hematoxylin中文名：蘇木色精，蘇木色素，蘇木精，蘇木素，洋蘇木素英文名：Hematoxyli7,11b-Dihydrobenzindeno[1,2-d]pyran-3,4,6a,9,10（6H）-pentol，NaturalBlack分子式：C16H14O6分子量：302.28性質(zhì)：無色棱形晶體，遇光變紅；熔點(diǎn)100-120°C；難溶于冷水和乙醚，易溶于熱水和熱乙醇，溶于堿、氨和硼砂的溶液。含有3分子結(jié)晶水，在100?120°C溶于本身的結(jié)晶水中。在水溶液中，特別是在堿溶液中易被空氣氧化成紅棕色的氧化蘇木精。C.I.name：NaturalblackC.I.number:75290CASnumber:517-28-2EINECSnumber:208-237-3BeilsteinRegistryNumber:91400EG/ECNumber：2082373MDLnumber：MFCD00078111染色原理：蘇木精是染細(xì)胞核的優(yōu)良材料，他能把細(xì)胞中不同的結(jié)構(gòu)分化出各種不同的顏色。分化時(shí)組織所染的顏色因處理的情況而異，用酸性溶液（如鹽酸一酒精）分化后呈紅色，水洗后仍恢復(fù)青藍(lán)色，用堿性溶液（如氨水）分化后呈藍(lán)色，水洗后呈藍(lán)黑色。用途：一種天然媒介染料。用于蠶絲、毛皮和皮革的染色以及棉布的印花，用不同的媒染劑可得到藍(lán)色或黑色。與重銘鹽、鐵鹽、亞鐵鹽、鋁鹽和錫鹽等一起可制成各種色淀。在分析化學(xué)中用于比色分析、顯微鏡分析，并用作pH值指示劑，變色范圍5.0?6.0,由黃色變紫色。作為天然色素，多用于食品工業(yè)、日化工業(yè)、皮革及織物染色等，病理實(shí)驗(yàn)中可作為細(xì)胞組織切片的染色劑.蘇木水提物最早被發(fā)現(xiàn)有抗癌作用，隨后的研究證明了其抗癌活性物質(zhì)就是蘇木精細(xì)胞染色專題之九：孔雀綠孔雀綠(MalachiteGreen)中文名：孔雀綠，孔雀石綠，堿性綠，鹽基品綠英文名：Malachitegreen，anilinegreen,basicgreen4,diamondgreenB,victoriagreenB，4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methyl]-N,N-dimethyl-aniline)分子式：C23H25ClN2(chloride)分子量：364.911g/mol(chloride)性質(zhì)：孔雀綠是有毒的三苯甲烷類化學(xué)物，既是染料，也是殺菌劑，可致癌?？兹甘G一般有二種。第一種是天然的礦石，為水合堿式碳酸銅[Cu(OH)2CO3或2CUOCO2H2O]，呈翠綠或草綠色的塊石，含71.9%CuO、19.9%CO2、比重3.9-4.03、能溶于酸類。主要用于銅的提煉和供作顏料，但并不用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。第二種是孑L雀石綠染料(MalachiteGreenDyestuff)，又有AnillneGreen、ChinaGreen、VictorlaGreen等多個(gè)名稱，是人工合成的有機(jī)化合物。它的生產(chǎn)是由1分子(mol)的苯甲醛Benzaldehyde和2分子的二甲苯胺Dimethylaniline在濃鹽酸混和下，加熱縮合成隱色素堿Leucobase，在酸性下加過氧化鉛使其氧化，并在(酸？堿？)性液中沉淀出色素堿，它是屬于三苯基甲烷型的綠色染料TryphenylMethaneDyestuffs。綠色閃光結(jié)晶，溶于水、酒精顯藍(lán)綠色；遇硫酸呈黃色，稀釋后呈暗橙色；水溶液加氫氧化鈉形成微帶綠光的白色沉淀。PH值在0.13?2.0變色為黃?淺藍(lán)?綠，PH值在11.5?13.2變色為藍(lán)綠?無色。CASnumber:569-64-2光譜性質(zhì)：最大吸收616.5nm染色原理：孔雀石綠可用作生物染色劑，把細(xì)胞或細(xì)胞組織染成藍(lán)綠色，方便在顯微鏡下研究?？兹甘G也用作絲綢、皮革和紙張的染料。雖然稱作孔雀石綠，但其實(shí)它不含有孔雀石的成份，只是兩者顏色相似而已。用于芽孢染色的步驟：取一干凈載片按無菌法取巨大芽孢桿菌菌體少許制成涂片，風(fēng)干固定后，在涂菌處滴加法7.6%的孔雀綠飽和水溶液，染色10分鐘后，用水沖洗，再用0.5%蕃紅花紅液染色彩1分鐘，水洗，風(fēng)干后鏡檢。芽孢被染成綠色，營養(yǎng)體呈紅色。細(xì)胞染色專題之十：DAPIDAPI中文名：4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲噪⑵英文名：4',6-diamidino-2-phenylindole，2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine，DAPIdihydrochloride分子式：C16H15N5分子量：277.324CASnumber:28718-90-3光譜性質(zhì)：與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)最大吸收/最大發(fā)射為358nm/461nm；與RNA結(jié)合時(shí)，最大發(fā)射移動到400nm左右。染色原理：DAPI為一種熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光，和EB相比，對雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍(lán)色熒光的細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記的效率高(幾乎為100%)，且對活細(xì)胞無毒副作用。DAPI染色常用于細(xì)胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。DAPI也常用于普通的細(xì)胞核染色以及某些特定情況下的雙鏈DNA染色。細(xì)胞經(jīng)熱激處理后用DAPI染色3分鐘，在熒光顯微鏡下可以看到到細(xì)胞核的形態(tài)變化。a、正常的煙草細(xì)胞核：核形完整，染色質(zhì)均勻。b、染色質(zhì)固縮，向外周聚集，形成周邊化。c、染色質(zhì)進(jìn)一步固縮，形成很多顆粒物質(zhì)。d、細(xì)胞核破裂形成碎片，核解體。染色步驟：在細(xì)胞移植前，將DAPI以一定的濃度加入培養(yǎng)基中，與細(xì)胞共同孵育過夜，用PBS緩沖液漂洗至少6次以洗掉未結(jié)合的DAPI，在用酶消化后離心收集細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液以備用。存儲條件：-20°C避光保存(?4°C?)注意事項(xiàng)：1、DAPI強(qiáng)烈致癌，操作時(shí)要戴上手套。2、貯存液用70%酒精配制，濃度100Pg/ml,可用黑紙包住，長期凍存。使用液按1:1000用PBS稀釋，最終濃度100ng/ml。3、DAPI是非常優(yōu)秀的DNA染料，固定過和沒有固定過的活細(xì)胞均可用DAPI染色。細(xì)胞染色專題之十一：結(jié)晶紫結(jié)晶紫（crystalviolet）中文名：（結(jié)）晶紫，氯化甲基玫瑰苯胺，結(jié)晶紫，龍膽紫，甲基青蓮，堿性紫，甲紫，其溶液俗稱“紫藥水”英文名：crystalviolet，Methylviolet2B，Methylviolet，methylrosanilinechloride，GentianViolet，BasicViolet，分子式：C24H28N3Cl分子量