細胞中eIF-5A定位的方法研究

.PAGE*;;細胞中eIF-5A定位的方法研究項目完成單位：國家生物醫(yī)學分析中心項目完成人：周濤靳寶鋒楊怡李慧艷張颯張德添張學敏一、立題依據(jù)細胞凋亡的機制是目前研究的熱點問題之一，我們應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)初步進行了細胞凋亡相關(guān)機制的研究。以對阻斷泛素-蛋白酶體通路(簡稱UPS通路)極為敏感的白血病細胞系M-07e為模型，用泛素-蛋白酶體通路特異阻斷劑Z-TL-CHO誘導細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡前后雙向電泳上T蛋白點的表達量顯著增加，經(jīng)生物質(zhì)譜鑒定T蛋白點就是eIF-5A。這說明M-07e細胞凋亡過程中，eIF-5A被誘導表達，可能參與了細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導過程。那么，被誘導表達的過量的eIF-5A定位在細胞的什么位置？在細胞凋亡的過程中定位有無變化？如有，是如何變化的？總量上又是如何變化的?這都是需要解決的問題。eIF-5A的亞細胞定位雖有報道，但結(jié)果不一致，相互沖突。如：RuhlM等認為eIF-5A定位于細胞核，RosoriusO等人則進一步精確定位至細胞核的核孔復合物上，shiXP等認為eIF-5A主要定位于細胞質(zhì)中，而Jao和Chen等則認為eIF-5A為全細胞分布。因為蛋白質(zhì)的定位信息將為其功能的研究提供重要線索，因此我們同時采用了間接免疫熒光、熒光蛋白標記等方法進行eIF-5A亞細胞定位的研究。解決蛋白定位的問題，比較常用的是間接免疫熒光標記和免疫膠體金技術(shù)，近年來發(fā)展了利用綠色熒光蛋白(GFP)來示蹤胞內(nèi)蛋白的技術(shù)。間接免疫熒光標記技術(shù)因為是在光鏡水平進行研究，因此無法進行精確的亞細胞定位。而免疫膠體金技術(shù)則因為制樣過程繁瑣復雜，非特異性標記較高，且重復性差。利用GFP融合蛋白技術(shù)來進行活細胞定位研究是目前較為通行的一種方法，但仍是在光鏡水平進行研究，只是不需要制樣，沒有非特異性標記的影響。并且GFP的分子量為27kD，eIF-5A的分子量為16～18kD，若利用GFP來定位，是否對eIF-5A的定位有干擾還不清楚，因此我們必須尋找更好的定位分析方法。最近，美國圣迭哥大學Griffin,BA等合成了一種有機砷的化合物FlAsH，與特定的能形成α-螺旋的含4個半胱氨酸殘基的肽段結(jié)合后，可發(fā)射熒光。這種肽段一般只需要十幾個氨基酸殘基，但其核心區(qū)域必須是-Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys-。此外其衍生物中可發(fā)紅色熒光的ReAsH相對于FlAsH來說，還有另外一個特點，即在有氧情況下，可對二氨基聯(lián)苯(DAB)發(fā)生光轉(zhuǎn)化反應，經(jīng)激光掃描共聚集顯微鏡高強度激光照射后，可產(chǎn)生一種電鏡下可觀察的褐色產(chǎn)物，從而將激光掃描共聚焦顯微鏡與電鏡有機地結(jié)合起來，對蛋白質(zhì)進行精確定位。利用FlAsH和ReAsH可發(fā)射不同顏色熒光，又都是與同樣的肽段相結(jié)合的特點，可以在不同的時相對細胞內(nèi)該蛋白進行脈沖追蹤，實現(xiàn)對蛋白生命周期的觀察。激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM,以下簡稱共聚焦顯微鏡）因其獨特的設計原理，有效地排除了非焦平面信息，提高了分辨率及對比度，使圖像更為精確清晰，因此極其適于進行活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等定位及活體動態(tài)研究。二、主要研究內(nèi)容1．真核表達載體的構(gòu)建①引物設計利用引物設計軟件，根據(jù)FlAsH試劑所需的結(jié)構(gòu)，選定肽段Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Cys-Cys-Arg-Glu-Cys-Cys-Ala-Arg-Ala，根據(jù)此肽段并按照所需構(gòu)建的載體酶切位點的要求，設計如下引物：1．TCGAGGCTGAGGCTGCCGCCCGCGAGGCTTGCTGCCGCGAGTGCTGTGCCAGG2．CCGACTCCGACGGCGGGCGCTCCGCACGACGGCGCTCACGACACGGTCCGCCTAATGATCGGATTACTAGATC這1對序列通過計算機模擬檢索，引物自身無發(fā)卡結(jié)構(gòu)，且引物之間不形成二聚體。其中上游TCGAG為XhoI酶切位點，下游T為XbaICAGATC酶切位點。②載體構(gòu)建將以上合成引物退火后裝入pcDNA3.0載體的相應酶切位點，并將pEGFP-N1/eIF-5A用BamHI和HindIII進行雙酶切，把BamHI-eIF-5A-HindIII片段連入已構(gòu)建好pcDNA3.0/FlAsH，得到表達eIF-5A-FlAsH肽段融合蛋白質(zhì)的真核表達載體。2．免疫熒光檢測將均勻種植在玻片上的COS-7和HEK293細胞，用PBS洗3遍。4%多聚甲醛固定4℃30min，PBS洗3遍。0.2%TritonX-100-PBS5min。10%的小牛血清封閉（PBS稀釋），37℃30min。PBS洗后，加入eIF-5A抗體（1:500），4℃過夜。PBS洗3遍。加羊抗兔IgG-FITC（1:50），室溫30min，PBS洗后用激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。3．轉(zhuǎn)染真核細胞因為以上eIF-5A-FlAsH載體表達后的融合蛋白質(zhì)尚缺少合適的檢測方法，因此先用pEGFP-N1/eIF-5A進行轉(zhuǎn)染條件的探索。當cos7或293T細胞生長到對數(shù)生長期時，接種到共聚焦顯微鏡專用的玻璃底培養(yǎng)皿（35mmpetridish，10mmMicrowell）中，培養(yǎng)過夜。當細胞貼壁率達到30%~50%時，將表達載體質(zhì)粒2ug和脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)2l分別溶于100l無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)基中，充分混勻后，室溫放置15min，再將兩種溶液充分混勻，室溫放置30min。同時用無血清、無抗生素的DMEM洗滌待轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細胞2~3次，向DNA-脂質(zhì)體混合物中加入800l無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)基，混合后加入到培養(yǎng)細胞中。培養(yǎng)皿放入37℃孵箱孵育6~8hr后吸去雙無培養(yǎng)液，加入2~3ml含抗生素和10%FCS的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24~72hr。4．激光掃描共聚焦顯微鏡觀察將上述細胞分別在24、、36、48、72小時用共焦顯微鏡觀察，采用Bio-Rad公司Radiance2100?激光掃描共聚焦顯微鏡，激發(fā)波長為Arion激光器488nm，發(fā)射濾片選用HQ515/30帶通濾片。采集軟件是LaserSharp2000，采集時均選取一系列光學切片中熒光強度最大的一幅圖像，采集條件如下：Laser488nm，Power16.3%，Iris2.2，Gain20.2,black1.6。5．電鏡原位制樣及觀察原位包埋法：如原位特定細胞培養(yǎng)在35mm塑料培養(yǎng)皿或6孔板中，將細胞在培養(yǎng)皿內(nèi)進行固定、脫水、浸透、包埋和聚合。細胞面朝上與液體直接接觸。在光鏡下先選好被觀察的細胞區(qū)域然后再包埋。由于樣品很薄，塊面修成0.1×0.2mm長方形。切片前應盡量修去多余的樹脂，以便切片和觀察。聚合后的樣品塊必須先定位再修塊。三、結(jié)果與討論1.成功構(gòu)建FlAsH標簽質(zhì)粒，并將eIF-5A片段裝入標簽上游，酶切結(jié)果顯示與預期的長度一致（圖略）。2.利用免疫熒光標記技術(shù)檢測eIF-5A蛋白質(zhì)的亞細胞定位，檢測結(jié)果如圖1所示。在激光共聚焦顯微鏡下，COS-7和HEK293細胞輪廓清晰可見，細胞質(zhì)中的熒光染色明顯，細胞核內(nèi)無明顯的熒光染色，表明eIF-5A定位于胞漿中。ABAB圖1免疫熒光檢測eIF-5A亞細胞定位A：COS-7細胞；B：HEK293細胞轉(zhuǎn)染時間(hr)24364872GFPGFP-eIF5A圖2hypusine對eIF-5A的亞細胞定位的影響只定位在細胞質(zhì)中的細胞(%)轉(zhuǎn)染時間(hr)243648