環(huán)狀RNA的研究課件

揭開環(huán)狀RNA的神秘面紗環(huán)狀RNA類病毒？擬病毒？偶然錯(cuò)配出現(xiàn)的？有什么功能？怎么形成的？現(xiàn)有的研究結(jié)果怎樣？存在于動(dòng)物體內(nèi)or體外也可以？未來研究的可深入方向？類病毒是目前已知最小的可傳染的致病因子，比普通病毒簡單。類病毒是無蛋白質(zhì)外殼保護(hù)的游離的共價(jià)閉合環(huán)狀單鏈RNA分子，侵入宿主細(xì)胞后自我復(fù)制，并使宿主致病或死亡。類病毒的分子量在0.5～1.2×105，是已知的最小RNA衛(wèi)星壞死病毒大小的1/4。1971年首次報(bào)道的馬鈴薯紡錘形塊莖病類病毒(PSTV)只有359個(gè)核苷酸，最小的草矮生類病毒(HSV)僅含290～300個(gè)核苷酸，較大的柑桔裂皮病類病毒(CEV)亦只含371個(gè)核苷酸。目前關(guān)于類病毒的感染和復(fù)制機(jī)理尚不清楚。擬病毒也稱為類類病毒，它是一種環(huán)狀單鏈RNA。它的侵染對(duì)象是植物病毒。被侵染的植物病毒被稱為輔助病毒，擬病毒必須通過輔助病毒才能復(fù)制。單獨(dú)的輔助病毒或擬病毒都不能使植物受到感染。20世紀(jì)80年代以來，在澳大利亞陸續(xù)從絨毛煙、苜蓿、莨菪和地下三葉草上發(fā)現(xiàn)了四種新的植物病毒。這些病毒的蛋白質(zhì)衣殼內(nèi)都含有兩種RNA分子，一種分子量為1.5×106Da的線狀RNA1，另一種為分子量約為105Da的類似于類病毒的環(huán)狀RNA2，這種RNA2分子被稱為擬病毒(Virusoid)。30年前，通過電子顯微鏡的觀察第一次在真核生物中發(fā)現(xiàn)了RNAs能夠以環(huán)狀的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。錯(cuò)排外顯子傳統(tǒng)認(rèn)為的拼接模式如左圖所示，按照5端到3端的順序依次進(jìn)行外顯子的轉(zhuǎn)錄；右圖為環(huán)狀RNA的拼接模式假想圖，主要是關(guān)于不帶A尾等末端結(jié)構(gòu)的外顯子的供體與受體的假設(shè)。

最具特征性的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物存在于噬齒類動(dòng)物中。小鼠的Y染色體性別決定基因由單一的外顯子組成。過去認(rèn)為它對(duì)應(yīng)的RNA是以線性形式存在而具有翻譯蛋白質(zhì)的功能。現(xiàn)在的研究表明它主要是以環(huán)狀的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，并且基本沒有翻譯功能。有研究表明染色體上SRY外顯子的錯(cuò)亂逆序復(fù)制形成環(huán)狀。另外還有鈉轉(zhuǎn)運(yùn)基因（NCX1）和大鼠細(xì)胞色素P4502C24基因也低水平的表達(dá)為環(huán)狀亞型。盡管沒有實(shí)質(zhì)的證據(jù)，NCX1基因的環(huán)狀亞型被認(rèn)為具有翻譯蛋白的功能。但這些已知的研究報(bào)告均認(rèn)為人體細(xì)胞中環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物的水平遠(yuǎn)低于線性分子。于是，環(huán)狀RNA被認(rèn)為是偶然出現(xiàn)在動(dòng)物體內(nèi)又或者說是線性RNA的一個(gè)形成前體。本文作者收集5名患有急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)患兒的腫瘤樣本，利用IlluminaGAII對(duì)ALL樣品進(jìn)行末端配對(duì)測(cè)序，隨后將生成的讀值與數(shù)據(jù)庫中人類轉(zhuǎn)錄組外顯子-外顯子連接(exon-exonjunction,EEJ)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對(duì)，他們發(fā)現(xiàn)有超過1200種基因轉(zhuǎn)錄物中存在順序錯(cuò)亂的外顯子。其中大量的轉(zhuǎn)錄物表明基因中存在的相當(dāng)大比例的異構(gòu)體。更進(jìn)一步的試驗(yàn)中，作者證實(shí)這種外顯子錯(cuò)排現(xiàn)象不僅存在于白血病細(xì)胞中，在Hela細(xì)胞系及正常人原代血細(xì)胞中也有。并且，對(duì)3種白細(xì)胞類型的RNA測(cè)序試驗(yàn)結(jié)果顯示有800多種基因存在重排異構(gòu)體，約占轉(zhuǎn)錄物比例的10%。另外，研究人員對(duì)通過公共渠道獲得的HeLa細(xì)胞和人類胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，也發(fā)現(xiàn)了1748種非標(biāo)準(zhǔn)序列的外顯子異構(gòu)體。對(duì)小鼠大腦RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后的結(jié)果證實(shí)，這樣的異構(gòu)體同樣也存在于其他動(dòng)物中。通過隨后的統(tǒng)計(jì)學(xué)及生物化學(xué)分析，研究人員推導(dǎo)出這樣的結(jié)論，外顯子重排通常形成了環(huán)狀而非線性的轉(zhuǎn)錄物，數(shù)以百計(jì)這樣的轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中呈高水平表達(dá)，甚至在某些情況下水平與標(biāo)準(zhǔn)的異構(gòu)體相似。環(huán)狀RNA的生物源性目前為止還是不清楚本文作者使用之前鑒定的一個(gè)高表達(dá)環(huán)狀RNA，主要研究其對(duì)miR-7的影響。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)這一環(huán)狀RNA包含了70個(gè)miR-7的結(jié)合位點(diǎn)，并將其命名為ciRS-7(circularRNAspongeformiR-7)。而ciRS-7的表達(dá)使得miR-7活性受到抑制，miR-7靶基因表達(dá)增高，研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)這是因?yàn)閏iRS-7捕獲和失活了miR-7。MicroRNAs是一些通過結(jié)合和阻止mRNA翻譯阻斷基因表達(dá)的短片段RNA。而MiR-7的靶標(biāo)與癌癥和帕金森氏病存在著關(guān)聯(lián)。本文還對(duì)前面提到的環(huán)狀SRY對(duì)miR-138功能的影響進(jìn)行了研究。這也是目前來說第一次對(duì)自然表達(dá)的環(huán)狀RNA功能的研究。C圖為轉(zhuǎn)染了SRY表達(dá)載體和空載體在HEK293細(xì)胞（細(xì)胞中存在miR-138和miR-769）上的表達(dá)量。D圖為轉(zhuǎn)染了SRY表達(dá)載體和空載體在HEK293細(xì)胞（細(xì)胞中存在miR-138和miR-7）上的表達(dá)量這說明環(huán)狀SRY在miR-138存在時(shí)能提高表達(dá)量，或許存在與miR-138的結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)，這也再次證明環(huán)狀RNA分子與miRNA存在功能調(diào)節(jié)上的關(guān)系。無獨(dú)有偶，差不多時(shí)間發(fā)表于nature上的另一篇研究環(huán)狀RNA功能的文章也將注意力放在了miRNA上面。這一研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)一種人類的circRNAs，它能夠調(diào)節(jié)翻譯小腦退化相關(guān)的蛋白1的轉(zhuǎn)錄物，故稱之為CDR1as。而這一circRNAs上含有63個(gè)隱藏的miRNA-7結(jié)合位點(diǎn)。在石斑魚體內(nèi)敲除miRNA或者CDR1as表達(dá)都會(huì)影響其中腦的發(fā)育。圖為石斑魚的腦組織，可以看出miRNA與CDR1as均能損害其中腦的發(fā)育，但當(dāng)二者一起作用時(shí)卻出現(xiàn)了拮抗作用，中腦發(fā)育的影響不大。CDR1asandmiR-7haveoverlappingandspecificexpressioninneuronaltissuesCDR1as和miR-7在小鼠神經(jīng)元細(xì)胞上能夠一樣地表達(dá)，但是在小鼠的其他組織中CDR1as幾乎不表達(dá)，而miR-7則在各個(gè)組織中均有表達(dá)，而且個(gè)別組織中表達(dá)量很大。1、這兩篇發(fā)表nature上的文章作者都有提到，環(huán)狀RNA的功能可能還有很多，但是從他們的實(shí)驗(yàn)可以得出一個(gè)結(jié)論就是：環(huán)狀RNA可以調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)。2、從后面這篇文章來看，環(huán)狀RNA本身可能就具有調(diào)節(jié)mRNA的功能，并且反過來講的話，miRNA可能也會(huì)作用于circRNAs，它們的作用可能是相互的。3、值得一提的是，關(guān)于miRNA的研究目前已經(jīng)很多了，而circRNAs的具體研究則剛剛起步，這或許