《生物酶研究論文開題報(bào)告》

PAGE4-開題報(bào)告畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）題目泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化研究題目類型題目來(lái)源學(xué)院專業(yè)指導(dǎo)教師職稱姓名年級(jí)學(xué)號(hào)一、立題依據(jù)(國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展或選題背景、研究意義等)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶(D-lactonohydrolase)具有高度的立體選擇性，可立體專一性拆分DL-泛解酸內(nèi)酯，生成D-泛解酸，根據(jù)專利文獻(xiàn)報(bào)道，產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶(D-lactnohoydrolase)的微生物菌株主要有以下幾種:鐮抱霉菌屬(Fusaruim)，赤霉菌屬(Gibberella)，粘帚霉菌屬(Gliocladium)，黑曲霉屬((Aspergillus)以及柱盤飽菌(Cylindrocarpon)等。其中鐮抱霉菌屬的尖鐮抱霉(FusariumOxysporm)和串珠鐮抱霉(Fusariummoniliform)已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。D-泛解酸內(nèi)酯作為一種重要的醫(yī)藥中間體，主要用于合成維生素類藥D一泛醇及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥D一泛酸鈣。D-泛醇和D-泛酸鈣可以通過(guò)DL-泛解酸內(nèi)醋分別與β-氨基丙醇、β-氨基丁酸反應(yīng)合成出各自的外消旋體再拆分的路線得到，但這種路線一直未見工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道，主要原因在于該方法要損失近一倍的成本較高的β-氨基丙醇、β-氨基丁酸，導(dǎo)致其生產(chǎn)成本過(guò)高。日前國(guó)內(nèi)外D-泛酸、D-泛酸鈣的上業(yè)中，均為先拆分DL-泛解酸內(nèi)酯，將得到的D-泛解酸內(nèi)醋和各自的另一中間體直接合成。對(duì)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的研究始于20世紀(jì)90年代，1994年日本的sakamoto等人對(duì)FusariumoxyspormIF05942菌株中可立體專一性拆分D-泛解酸內(nèi)酯的酶進(jìn)行了分離純化，并對(duì)酶的反應(yīng)條件進(jìn)行了探索性研究，確定了酶轉(zhuǎn)化的最佳反應(yīng)條件。同時(shí)對(duì)酶的分子質(zhì)量及亞基組成也進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該酶由兩個(gè)亞基組成。2002年，日本的Sakamoto等人發(fā)表了源一于真核生物的D-泛解酸內(nèi)酯水解酶基因序列，并將該基因修飾后轉(zhuǎn)至原核生物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行了過(guò)量表達(dá)，經(jīng)測(cè)定該表達(dá)產(chǎn)物有立體專一性拆分DL-泛解酸內(nèi)酷的活力。利用一該表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)取得了較好效果。這一研究解決了利用菌體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化所帶來(lái)的困難，提高了酶的活力及產(chǎn)物的收率。傳統(tǒng)的生產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯的方法為化學(xué)方法，手性拆分劑成本高，分離困難，并有環(huán)境污染和毒性問(wèn)題。隨著人們對(duì)綠色環(huán)保的追求，迫切需要尋求一種新的內(nèi)酯拆分技術(shù)來(lái)代替現(xiàn)在的技術(shù)，即酶法拆分泛解酸內(nèi)酯的技術(shù)。二、研究的主要內(nèi)容及預(yù)期目標(biāo)研究?jī)?nèi)容：D-泛解酸內(nèi)酯水解酶具有高度的立體選擇性，可立體專一拆分DL-泛解酸內(nèi)酯，生成D-泛解酸。D-泛解酸內(nèi)酯化后即得到D-泛解酸內(nèi)酯。D-泛解酸內(nèi)酯水解酶拆分DL-泛解酸內(nèi)酯具有毒性小、污染少等優(yōu)點(diǎn)。但是，直接利用游離酶進(jìn)行拆分反應(yīng)，反應(yīng)后酶無(wú)法回收利用，酶的利用效率很低。為了提高酶的利用效率，降低生產(chǎn)成本，本文對(duì)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化方法進(jìn)行了研究，并進(jìn)一步研究了固定化后的D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的水解工藝，為該酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本課題的主要研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面：1、利用實(shí)驗(yàn)室篩選得到的產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)a水解酶菌株FliferatzrmAS3.4738發(fā)酵產(chǎn)菌絲體，并采用適當(dāng)?shù)姆椒◤闹刑崛一泛解酸內(nèi)酯水解酶;2、選擇合適的固定化載體和固定化方法;3、對(duì)固定化條件進(jìn)行探討;4、對(duì)固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究;5、固定化酶轉(zhuǎn)化工藝的研究。預(yù)期目標(biāo)：實(shí)驗(yàn)選用了6種有代表性的樹脂D-3520、D-152、D-380、N-KA9、AB-8和ES-V-1進(jìn)行研究。通過(guò)運(yùn)用載體選擇法、酶活性測(cè)定方法來(lái)分析其對(duì)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的吸附作用，從而找出最優(yōu)的樹脂選擇以及運(yùn)行環(huán)境。三、研究方案（思路）（一）實(shí)驗(yàn)材料1、菌種腐皮鐮飽菌(Fl訴ratumAS3.4738)2、培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基（察氏培養(yǎng)基）：NaNO30.3%,KCI0.05%，K2HPO40.1%,FeSO40.001%，MgS04.7H2O0.05%,庶糖3%，瓊脂2%，pH6.7,12rC滅菌15min。種子培養(yǎng)基：甘油2%，蛋白胨1%,酵母膏1%，玉米衆(zhòng)1%，pH6.7。發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油3%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，玉米菜0.5%，pH6.7。3、主要藥品25%戊二酵水溶液、瓊脂粉、DL-泛解酸內(nèi)離標(biāo)準(zhǔn)品、D-泛解酸內(nèi)酯、可溶性淀粉、乙醇等。4、主要儀器HYG-II型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床、HS-1300-V型超凈臺(tái)、AB204-S型分析天平、CHB型普通光學(xué)顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)等。（二）實(shí)驗(yàn)流程四、論文進(jìn)度安排2019年1月上旬：，完成開題報(bào)告；2019年1月中旬-2020年1月上旬搜集、整理、分析研究資料，撰寫畢業(yè)論文初稿并提交初稿；2020年1月上旬：提交論文中期檢查報(bào)告；2020年3月：提交畢業(yè)論文二稿；2020年4月下旬：畢業(yè)論文定稿、查重，并整理、打印和裝訂畢業(yè)論文提交；2020年5月底：完成畢業(yè)論文答辯。五、主要參考文獻(xiàn)[1]王亞慧,侯海榮,陳明濤,孫春玲,郝苗苗.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)錫林浩特地區(qū)馬奶中泛酸含量的測(cè)定[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2019(24):66-68.[2]鄭貝貝.D-泛解酸內(nèi)酯結(jié)晶動(dòng)力學(xué)的研究[D].浙江工業(yè)大學(xué),2013.[3]韓君,周剛,解紅霞.HPLC法測(cè)定復(fù)合維生素B片中泛酸鈣的含量[J].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2019,41(05):503-504.[4]鄭貝貝,孫勤.D-泛解酸內(nèi)酯結(jié)晶系統(tǒng)過(guò)飽和度測(cè)量方法的選擇[J].化工時(shí)刊,2013,27(05):11-14.[5]胡雯雯,陶建偉,王慶偉,李靜,閻超,許旭.高精度定量毛細(xì)管電泳法同時(shí)測(cè)定復(fù)合維生素B片中B_1、B_2、B_6、煙酰胺及泛酸鈣[J].色譜,2019,37(06):661-665.[6]王開放,張梁,辛瑜,曾偉,丁重陽(yáng),石貴陽(yáng).D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的固定化及酶學(xué)性質(zhì)[J].生物加工過(guò)程,2019,17(02):159-165.[7]田浩,王志偉,顧文佳,曲勤鳳.微生物法測(cè)定食品中葉酸、泛酸、生物素、維生素B12注意事項(xiàng)和實(shí)踐[J].中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化,2018(17):127-130.[8]方富良,李娜.超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定乳蛋白深度水解配方粉中的泛酸[J].食品安全導(dǎo)刊,2018(21):69-70.[9]高亮.酮泛解酸內(nèi)酯還原酶的克隆表達(dá)及其在高效不對(duì)稱合成D-泛解酸內(nèi)酯中的應(yīng)用[D].浙江工業(yè)大學(xué),2017.[10]汪釗,黃美娟,高亮,應(yīng)向賢,趙嫚,孫杰.化學(xué)酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯的研究進(jìn)展[J].發(fā)酵科技通訊,2016,45(04):193-198.[11]王金金,郭振美,呂志果.不對(duì)稱催化合成手性泛解酸內(nèi)酯的研究進(jìn)展[J].工業(yè)催化,2014,22(05):335-340.六、指導(dǎo)教師