免疫組織化學(xué)-課件

免疫組織化學(xué)Immunohistochemistry1PPT課件免疫組織化學(xué)Immunohistochemistry1PP概念：免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)是利用抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)呈色反應(yīng)來檢測組織和細胞中某種化學(xué)成分的一門技術(shù),是傳統(tǒng)的免疫學(xué)和組織化學(xué)相結(jié)合而發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，也叫原位免疫學(xué)（Insituimmunology）。特點或優(yōu)點：（1）特異性強、靈敏度高；（2）可定性、定位、定量觀察；（3）將形態(tài)學(xué)改變與功能和代謝變化結(jié)合起來；免疫組化概述2PPT課件免疫組化概述2PPT課件IHC不僅具有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)（包括LM和EM水平）能對組織和細胞進行仔細、客觀觀察的優(yōu)點（特別是經(jīng)蘇木精或伊紅復(fù)染后），而且還克服了傳統(tǒng)免疫學(xué)反應(yīng)只能定性和定量（離體、液相），而不能定位的缺點。IHC則可在原位和固相對染色結(jié)果進行觀察。目前IHC的定位可精確到亞微結(jié)構(gòu)水平。

隨著IHC技術(shù)的發(fā)展和圖象分析技術(shù)的發(fā)展，IHC已進入多標(biāo)記（雙標(biāo)記）和定量研究的階段，使IHC在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，不僅用于研究，也用于診斷。IHC與核酸分子雜交相結(jié)合形成的原位雜交技術(shù)（insituhybridization，ISH）既特異性強、靈敏，又具定位、可視的特點。3PPT課件IHC不僅具有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)（包括LM和EM水平——IHC技術(shù)源于免疫熒光術(shù)（immunofluorescence,IF），從1941年~1950年Coons等用了10年首創(chuàng)了

熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)——檢測肺組織內(nèi)的肺炎雙

球菌，六、七十年代IF在科研中占據(jù)著主導(dǎo)地位——1968年中根一穗（Nakane）等創(chuàng)建了酶標(biāo)抗體技

術(shù)（immunoperoxidase，IPO）——鐵蛋白標(biāo)記Ab技術(shù);

——1974年Stemberger改良上述技術(shù)，建立辣根過氧

化物酶－抗體過氧化物酶（PAP）技術(shù)，使免疫

細胞化學(xué)得到廣泛應(yīng)用；一、IHC的發(fā)展簡史4PPT課件一、IHC的發(fā)展簡史4PPT課件——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—銀染色法、半抗原標(biāo)記法、免疫電鏡技術(shù)相繼問世?！?0年代分子雜交技術(shù)、原位雜交技術(shù)、免疫細胞化學(xué)分類方法迅速發(fā)展；——2000年各種免疫組化技術(shù)更加成熟，使免疫組化技術(shù)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項有力工具。其應(yīng)用范圍深達醫(yī)學(xué)各個學(xué)科，是目前生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的基本技術(shù)之一；——國內(nèi)起步晚，從70s開始。5PPT課件——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—銀染色5PP（一）方法學(xué)1.從傳統(tǒng)的抗原、抗體反應(yīng)（免疫反應(yīng)）→親和反應(yīng)。新的親和物質(zhì)對有：生物素與卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A蛋白（SPA）與IgG，凝集素與受體，激素與受體。這些親和對親和力強，且可與多種標(biāo)記物（熒光素、酶、同位素、膠體金、鐵蛋白等）結(jié)合，由此產(chǎn)生了親和組織化學(xué)（affinityhistochemistry），這些方法特異性、敏感性、穩(wěn)定性高，更方便、適于某些特殊觀察（如EM）。2.從單一顯示某種物質(zhì)（單標(biāo)記）→顯示多種物質(zhì)（雙標(biāo)記）。3.從LM→EM（超微結(jié)構(gòu)）：免疫電鏡、膠體金法、金銀法。4.從定性→定量，圖象分析（IA）、流式細胞術(shù)（FCM）。5.IHC與ISH相結(jié)合，可在不同水平檢測DNA、mRNA、protein。6.原位PCR+IHC可在組織原位通過擴增檢測微量目的DNA。7.趨于標(biāo)準(zhǔn)化、自動化。二、IHC的現(xiàn)狀和發(fā)展前景6PPT課件二、IHC的現(xiàn)狀和發(fā)展前景6PPT課件（二）技術(shù)分類

1.根據(jù)染色方式分成：①貼片染色②漂浮染色2.根據(jù)Ag-Ab結(jié)合方式分成：①直接法②間接法③多層法

3.按標(biāo)記物的性質(zhì)分成：①免疫熒光技術(shù)（免疫熒光法）②免疫酶技術(shù)（酶標(biāo)抗體法、橋法、PAD法、ABC法）③免疫金屬技術(shù)（免疫鐵蛋白法、免疫金染色

法、蛋白A金法）7PPT課件（二）技術(shù)分類7PPT課件（三）標(biāo)記物1.必要性：組織細胞內(nèi)Ag-Ab結(jié)合反應(yīng)一般是不可

見的，若在鏡下檢測，則必須具有可視性標(biāo)記物。

2.常用標(biāo)記物①熒光素：最常用的是異硫一氰酸熒光素（Fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）---熒光顯微鏡下呈綠色熒光;四乙基羅達明（rho—damineRB200）---熒光顯微鏡下發(fā)橙紅色熒光②酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶。③生物素：（Biotin）④鐵蛋白金等：主要應(yīng)用于免疫電鏡。⑤其他：如同位素（因涉及污染和防護難一般不用）8PPT課件（三）標(biāo)記物8PPT課件（四）IHC的應(yīng)用1.

只要是形態(tài)科學(xué)均可采用:包括病理學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、生物學(xué)、病原微生物的檢測（病毒、細菌、寄生蟲等）、皮膚病學(xué)、器官移植等。2.

可用于多種材料：A.各種組織（冰凍組織、formalin固定組織、石蠟包埋組織兼可）；B.各種細胞(穿刺、體液、涂片、血細胞、培養(yǎng)細胞等）。3.

用于診斷：腫瘤病理學(xué)等（大中醫(yī)院）。4.

用于科研：臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，尤其是形態(tài)學(xué)專業(yè)研究生常用IHC，或IHC+分生技術(shù)；最近幾年，分子生物學(xué)研究異常活躍，但最終還要歸到形態(tài)上來，用免疫組織化學(xué)方法對所研究的大分子進行定位，進而深入研究其功能。9PPT課件（四）IHC的應(yīng)用9PPT課件（一）標(biāo)本的收集與處理

IHC染色成功與否及其質(zhì)量如何，除染色方法本身外，對材料的處理也至關(guān)重要，它包括：取材、固定、脫水、包埋、切片等。目的：保存好Ag的數(shù)量及活性、保持組織細胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。材料的來源：人體及實驗動物；細胞和組織；新鮮的及固定的。1、組織標(biāo)本的取材與儲存來源：活檢取材、手術(shù)切除、實驗動物組織等。要求：要快、要?。?×1×0.4cm），避免擠壓。處理：冰凍→即用或保存；固定→即用或保存。三、樣品的準(zhǔn)備、處理10PPT課件三、樣品的準(zhǔn)備、處理10PPT課件

2、細胞標(biāo)本的取材與儲存來源：血細胞、穿刺細胞、體液細胞等。處理：細胞多時直接涂片、干燥、固定、染色；細胞少需離心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；對于體外培養(yǎng)細胞：貼壁生長細胞（內(nèi)皮C、纖維C、神經(jīng)C等）在培養(yǎng)皿底置載玻片；懸浮生長細胞需離心沉淀，再涂片、固定，即用或冰凍保存。

11PPT課件2、細胞標(biāo)本的取材與儲存11PPT課件

（二）固定（fixation）

1、固定的含義

固定是指以某種化學(xué)物質(zhì)使蛋白質(zhì)、酶類（變性）、脂質(zhì)、糖類等物質(zhì)保持在組織細胞原位，避免Ag溶解、擴散、丟失；保持組織細胞的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。

根據(jù)Ag對固定劑的耐受性，可將其分為：不穩(wěn)定Ag（如細胞表面Ag，不耐甲醛，宜用丙酮）、半穩(wěn)定Ag及穩(wěn)定Ag，后二者多為蛋白、肽類、酶類物質(zhì)。固定有時間性，太短達不到固定目的，太長交聯(lián)過度，封閉Ag。

12PPT課件（二）固定（fixation）12PPT課件

2、常用固定劑及其用途1.10%的formalin（4%的甲醛formaldehyde）：以pH7.4的PBS配制，優(yōu)點：穿透力強、固定快、組織收縮??；適于固定蛋白、肽類、酶、糖。IHC常用4%多聚甲醛polyformaldehyde灌注固定及后固定，時間4~6h。2.2.5%的戊二醛，同上。也可用2%戊二醛與2%多聚甲醛混合液固定，尤對超微結(jié)構(gòu)保存好。醛類固定劑的缺點是易封閉抗原，必要時需抗原修復(fù)。3.70%的酒精（乙醇），優(yōu)點：固定蛋白好，缺點：組織收縮嚴(yán)重；時間：2h。4.70%丙酮，優(yōu)點：滲透快；缺點：對形態(tài)保存不好；用于對冰凍切片和細胞涂片的固定；時間：10min。5.混合固定液：Bouin液：40%PF250ml、冰醋酸50ml、飽和苦味酸250ml；還有PLP固定液，較適合免疫組化。6.四氧化鋨（OsO4鋨酸）：常用PBS配制1%鋨酸溶液后固定1h，用于免疫組化及電鏡觀察。有強烈刺激，需在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。13PPT課件2、常用固定劑及其用途13PPT課件（三）組織的脫水、浸蠟、包埋和切片

前三步只用于石蠟切片，冰凍切片和振動切片不需此步驟。切片可分為：石蠟切片：脫水、透明、浸蠟、包埋、切片5~7μm；冰凍切片：浸糖，20%~30%蔗糖4oC過夜，減少冰晶；OCT包埋；液氮速凍，減輕組織破壞。病理切片要薄，5~7μm；腦片通常

30~50μm厚。振動切片：不需做任何包埋，固定后的組織可直接用振動切片機做各種厚度的切片，并在染色后可進一步制作電鏡標(biāo)本觀察。

14PPT課件（三）組織的脫水、浸蠟、包埋和切片14PPT課件（四）防脫片劑

（1）

蛋白甘油，蛋清與甘油1：1攪拌、過濾、防腐；（2）1%的鉻礬明膠涂片；（3）0.1%的多聚賴氨酸涂片，晾干備用。配制時用塑料瓶而不能用玻璃瓶；

（4）

購買商品化的進口硅化玻片；

（5）APES（氨丙基三乙氧基硅烷），1：50丙酮稀釋，浸片20~30秒，晾干備用；貼片時要一步到位。15PPT課件（四）防脫片劑15PPT課件（五）抗原修復(fù)

近年興起的新技術(shù)。目的：暴露被交聯(lián)封閉的Ag。主要適用于經(jīng)長期formalin固定的標(biāo)本、石蠟包埋標(biāo)本；也可用于冰凍切片。常用的方法有：（1）

微波加熱切片煮沸10~20min，室溫自然冷卻，所用溶液有：①飽和NaCL溶液；②10mMpH6.0的枸櫞酸鈉緩沖液；③4M的尿素等；④pH8.0TBS;（2）高壓鍋處理將切片放入10mM、pH6.0的枸櫞酸鈉緩沖液容器中，置鍋內(nèi)加蓋噴氣3~10min，自然冷卻。（3）酶消化處理：常用0.1%的胰蛋白酶（含0.1%CaCL2，pH7.8）37。C10min。或0.4%胃蛋白酶37。C30min;16PPT課件（五）抗原修復(fù)16PPT課件

（一）基本染色方法

熒光素標(biāo)記抗體：FITC、直接法TRITC等標(biāo)記抗體法酶標(biāo)記抗體：HRP、AP等

熒光素標(biāo)記抗體間接法

酶標(biāo)記抗體（三步法）

非標(biāo)記抗體法：酶橋法、PAP法、APAAP法;

親和組化法：ABC法、LAB法、LsAB法、BRAB法;

雙重標(biāo)記：阻斷法（酸洗Ⅰ抗）、非阻斷法（連續(xù)染）四、免疫組織化學(xué)技術(shù)17PPT課件四、免疫組織化學(xué)技術(shù)17PPT課件1．直接法

熒光素直接標(biāo)記特異性抗體（一抗）上，標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合（在切片上）熒光顯微鏡下觀察→檢測抗原。

優(yōu)點：簡單，時間短，

特異性強。

缺點：靈敏度低，所

需抗體量大

（不經(jīng)濟）。

應(yīng)用：基本不用了！！18PPT課件1．直接法優(yōu)點：簡單，時間短，18PPT課件2．間接法

熒光素標(biāo)記在二抗上（二抗：抗產(chǎn)生一抗動物的IgG抗體）?！@色后鏡檢特點：1、敏感性較直接法高3-4倍，但特異性較低；2、不必標(biāo)記每種一抗，只需標(biāo)記某一種動物的二抗；3、一抗可高度稀釋，節(jié)省一抗，且可用PBS代替一抗做空白對照。19PPT課件2．間接法

熒光素標(biāo)記在二抗上（二抗：抗產(chǎn)生一抗動3．非標(biāo)記Ab橋法：

“橋法”是酶標(biāo)記抗體的改進，經(jīng)過三次抗體，其二抗為未標(biāo)記橋抗體。（1）單橋法20PPT課件3．非標(biāo)記Ab橋法：20PPT課件(2)雙橋法

在三抗之后，將二抗和三抗再重復(fù)一次，可增大染色強度?！锾貏e提示：注意動物種屬關(guān)系

特點：敏感性高，但酶濃度不好掌握；與組織非特異性結(jié)合的酶不易洗去，背景染色重。21PPT課件(2)雙橋法21PPT課件4．過氧化物酶—抗過氧化物酶法（Peroxidaseanti-peroxidasemethod，簡稱PAP法）

是橋法的改良，用第二抗體作“橋梁”，先與第一抗體結(jié)合，再與PAP復(fù)合物聯(lián)結(jié)，形成抗原—抗體—抗IgG抗體—PAP復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。特點：靈敏度高，比間接熒光法敏感20倍，比間接酶標(biāo)記抗體法敏感100倍22PPT課件4．過氧化物酶—抗過氧化物酶法（Peroxidasean

5．親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法（avidin-biotin-peroxidasecomplextechnique，簡稱ABC法）。

關(guān)鍵的程序步驟為3步：

Ag+Ab1+（Ab2-B）+AB★C

復(fù)合物（Ab2-B

為生物素標(biāo)記的第二抗體）（B★為生物素標(biāo)記的過氧化物酶）

AB★C復(fù)合物是avidin與酶聯(lián)biotin在使用前30min配置，混勻。1個avidin分子結(jié)合了3個biotin分子，剩下1個結(jié)合點與2抗的生物素結(jié)合，avidin起橋聯(lián)作用。23PPT課件5．親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法（avidi（1）ABC復(fù)合物的制備：（2）ABC法反應(yīng)原理：特點：ABC法敏感性更高，比PAP法敏感20~40倍，背景也更清晰。24PPT課件（1）ABC復(fù)合物的制備：（2）ABC法反應(yīng)原理：特點：ABABC法示意圖25PPT課件ABC法示意圖25PPT課件染色結(jié)果觀察（BrdU）26PPT課件染色結(jié)果觀察（BrdU）26PPT課件

6、酶標(biāo)親和素-生物素技術(shù)（labelledavidin-biotintechnique，簡稱LAB法）。即用辣根過氧化物酶直接標(biāo)記avidin，用biotin標(biāo)記2抗。關(guān)鍵步驟為3步：

Ag+Ab1+（Ab2-B）+A★

（A★為HRP標(biāo)記的卵白素）

A★與2抗的生物素結(jié)合，avidin起橋聯(lián)作用。如將該法中的卵白素（avidin）變換成鏈霉卵白素(streptavidin)，LAB法即成LsAB法，或稱SP法。據(jù)認(rèn)為LAB法比ABC法敏感2~4倍，而LsAB法因鏈霉卵白素不與組織細胞中內(nèi)源性生物素結(jié)合而特異性更高?，F(xiàn)在SP法已趨于取代ABC法而廣為應(yīng)用。27PPT課件6、酶標(biāo)親和素-生物素技術(shù)（labelle生物素化Ⅱ抗AB復(fù)合物酶標(biāo)鏈卵白素AvidinBiotinPeroxidaseⅠ抗組織抗原ABC法（3步完成）LsAB（SP）法（3步完成）28PPT課件AB復(fù)合物酶標(biāo)鏈卵白素AvidinBiotinPeroxid鏈霉卵白素酶生物素底物抗原SP法示意圖29PPT課件鏈霉卵白素酶生物素底物抗原SP法示意圖29PPT課件（二）免疫組化染色步驟（以ABC法為例）

1)、切片常規(guī)脫蠟至水：二甲苯雖然可以反復(fù)使用，但次數(shù)不宜多。乙醇的濃度是從高到低，與脫水時相反。

2)、滅活內(nèi)源性酶：博士德推薦應(yīng)用3%的雙氧水，但實際操作中，使用30%雙氧水和純甲醇按1:9的溶劑比混合較為理想。

3)、抗原修復(fù)：暴露被交聯(lián)封閉的Ag。

4)、正常山羊血清封閉：封閉時應(yīng)該注意室溫與時間的相對關(guān)系。室溫低，時間就要長一些，反之亦然。另外，保持反應(yīng)池濕潤是重要的一環(huán)，否則，前功盡棄。后面的步驟也是如此。

5)、一抗反應(yīng)：一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強度與背景有直接關(guān)系。一般說來，陽性染色強度不夠時，可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時間；背景過高時則相反。

孵育時間與溫度：抗原抗體充分反應(yīng)是得到可靠結(jié)果的關(guān)鍵。因此，控制溫度與時間也是一個嚴(yán)肅的問題。由于室溫控制較為困難，建議4℃冰箱過夜（≥18h）。30PPT課件（二）免疫組化染色步驟（以ABC法為例）

1)、切片常規(guī)脫6)、二抗（生物素化IgG）反應(yīng)：建議濕盒內(nèi)37OC1h，另外儀器顯示溫度37℃，但實際只有23℃，自然結(jié)果難以令人滿意。

7)、SABC染色（37℃）：這是博士德的人性化之處，直接就可以用。

8)、DAB顯色鏡下控時：DAB濃度應(yīng)該比推薦的要低一些，這樣可以便于控制反應(yīng)時間以及在合適的時候中止反應(yīng)。同時注意，使用后殘余的DAB應(yīng)妥善處理，而不是隨便倒入下水道，因為它有致癌性。

9)、蘇木素輕度復(fù)染：不建議使用。盡管復(fù)染后標(biāo)本層次分明，但實際情況是，這樣有時也會掩蓋陽性結(jié)果，從而使前功盡棄。

10)、脫水透明：脫水乙醇的濃度由低到高，有一個較準(zhǔn)確判斷脫水成功與否的辦法是：觀察透明后盛二甲苯容器的壁，若發(fā)現(xiàn)白色霧狀現(xiàn)象，則說明脫水不成功，應(yīng)再次脫水。透明時間不要太長，1分鐘左右就可以了。

11)、封片：封片時，中性樹脂量宜少，同時注意不要產(chǎn)生氣泡。31PPT課件6)、二抗（生物素化IgG）反應(yīng)：建議濕盒內(nèi)37OC1h，（三）免疫組化染色基本技術(shù)及注意事項1．實驗計劃根據(jù)課題的內(nèi)容選用動物，選用配套的Ab。如Ab-I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無交叉，則不能用其他動物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必須來源于鼠，否則不能連接成復(fù)合物②若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差異，在貼片方面最好貼于同一張載片上，否則無可比性。③選用的試劑可靠，貨源充足，隨時可取。32PPT課件（三）免疫組化染色基本技術(shù)及注意事項32PPT課件2．Ab稀釋度（如系購買的藥盒有工作液和原液）（1）工作液：無須稀釋（2）原液：應(yīng)參照其提供的工作液濃度進行預(yù)試驗原液的保存（-20℃）凍存——應(yīng)選最佳稀度凍存。③若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍，而后分裝10μl/瓶→凍存（-20℃）于冰箱備用。（3）Ab濃度的選擇

Ab濃度不可太高或太低，因為Ag-Ab結(jié)合需在一定濃度范圍內(nèi)進行，若一方過剩則形成復(fù)合物小且少；極過剩時已形成的復(fù)合物亦會解體而呈現(xiàn)假陰性。

——并非Ab濃度越高越好。

33PPT課件2．Ab稀釋度（如系購買的藥盒有工作液和原液）33PPT3．Ab滴片技術(shù)

——所滴的抗體應(yīng)與切片上的組織剛好吻合。［注意］滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。要領(lǐng)：甩凈組織周圍的水。34PPT課件3．Ab滴片技術(shù)34PPT課件4．Ab孵育技術(shù)（1）必須在濕盒內(nèi)進行，以防抗體的蒸發(fā)和干片。（2）溫度與時間4℃過夜（＞16h）

37℃

1hor參考說明書5．光鏡控制顯色方法（1）室內(nèi)操作：注意溫度與時間的關(guān)系，室溫最宜5分鐘。（2）染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。35PPT課件4．Ab孵育技術(shù)35PPT課件▲染色失敗的幾種原因：（1）所染的全部切片均為陰性結(jié)果，包括陽性對照在內(nèi)。全部（－）原因可能：①染色未完全嚴(yán)格按照操作步驟進行；②漏加一種抗體，或抗體失效；③緩沖液內(nèi)含疊氮化鈉，抑制了酶的活性；④底物中所加H2O2

量少或失效；⑤復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)36PPT課件▲染色失敗的幾種原因：36PPT課件（2）所有切片均呈陽性反應(yīng)，原因可能是：

①切片在染色過程中抗體過濃，或干燥了。②緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準(zhǔn)確，洗滌不徹底。③使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應(yīng)時間過長。④抗體溫育的時間過長。⑤H2O2

濃度過高，呈色速度過快。粘附劑太厚。37PPT課件（2）所有切片均呈陽性反應(yīng)，原因可能是：37PPT課件（3）所有切片背景過深，原因可能是：

①未加酶消化處理切片。②切片或涂片過厚。③漂洗不夠。④底物呈色反應(yīng)過久。⑤蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血。⑥使用全血清抗體稀釋不夠。（4）陽性對照染色良好，檢測的陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)。最常見的原因是：標(biāo)本的固定和處理不當(dāng)。38PPT課件（3）所有切片背景過深，原因可能是：38PPT課件謝謝聆聽！39PPT課件謝謝聆聽！39PPT課件免疫組織化學(xué)Immunohistochemistry40PPT課件免疫組織化學(xué)Immunohistochemistry1PP概念：免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)是利用抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)呈色反應(yīng)來檢測組織和細胞中某種化學(xué)成分的一門技術(shù),是傳統(tǒng)的免疫學(xué)和組織化學(xué)相結(jié)合而發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，也叫原位免疫學(xué)（Insituimmunology）。特點或優(yōu)點：（1）特異性強、靈敏度高；（2）可定性、定位、定量觀察；（3）將形態(tài)學(xué)改變與功能和代謝變化結(jié)合起來；免疫組化概述41PPT課件免疫組化概述2PPT課件IHC不僅具有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)（包括LM和EM水平）能對組織和細胞進行仔細、客觀觀察的優(yōu)點（特別是經(jīng)蘇木精或伊紅復(fù)染后），而且還克服了傳統(tǒng)免疫學(xué)反應(yīng)只能定性和定量（離體、液相），而不能定位的缺點。IHC則可在原位和固相對染色結(jié)果進行觀察。目前IHC的定位可精確到亞微結(jié)構(gòu)水平。

隨著IHC技術(shù)的發(fā)展和圖象分析技術(shù)的發(fā)展，IHC已進入多標(biāo)記（雙標(biāo)記）和定量研究的階段，使IHC在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，不僅用于研究，也用于診斷。IHC與核酸分子雜交相結(jié)合形成的原位雜交技術(shù)（insituhybridization，ISH）既特異性強、靈敏，又具定位、可視的特點。42PPT課件IHC不僅具有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)（包括LM和EM水平——IHC技術(shù)源于免疫熒光術(shù)（immunofluorescence,IF），從1941年~1950年Coons等用了10年首創(chuàng)了

熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)——檢測肺組織內(nèi)的肺炎雙

球菌，六、七十年代IF在科研中占據(jù)著主導(dǎo)地位——1968年中根一穗（Nakane）等創(chuàng)建了酶標(biāo)抗體技

術(shù)（immunoperoxidase，IPO）——鐵蛋白標(biāo)記Ab技術(shù);

——1974年Stemberger改良上述技術(shù)，建立辣根過氧

化物酶－抗體過氧化物酶（PAP）技術(shù)，使免疫

細胞化學(xué)得到廣泛應(yīng)用；一、IHC的發(fā)展簡史43PPT課件一、IHC的發(fā)展簡史4PPT課件——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—銀染色法、半抗原標(biāo)記法、免疫電鏡技術(shù)相繼問世?！?0年代分子雜交技術(shù)、原位雜交技術(shù)、免疫細胞化學(xué)分類方法迅速發(fā)展；——2000年各種免疫組化技術(shù)更加成熟，使免疫組化技術(shù)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項有力工具。其應(yīng)用范圍深達醫(yī)學(xué)各個學(xué)科，是目前生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的基本技術(shù)之一；——國內(nèi)起步晚，從70s開始。44PPT課件——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—銀染色5PP（一）方法學(xué)1.從傳統(tǒng)的抗原、抗體反應(yīng)（免疫反應(yīng)）→親和反應(yīng)。新的親和物質(zhì)對有：生物素與卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A蛋白（SPA）與IgG，凝集素與受體，激素與受體。這些親和對親和力強，且可與多種標(biāo)記物（熒光素、酶、同位素、膠體金、鐵蛋白等）結(jié)合，由此產(chǎn)生了親和組織化學(xué)（affinityhistochemistry），這些方法特異性、敏感性、穩(wěn)定性高，更方便、適于某些特殊觀察（如EM）。2.從單一顯示某種物質(zhì)（單標(biāo)記）→顯示多種物質(zhì)（雙標(biāo)記）。3.從LM→EM（超微結(jié)構(gòu)）：免疫電鏡、膠體金法、金銀法。4.從定性→定量，圖象分析（IA）、流式細胞術(shù)（FCM）。5.IHC與ISH相結(jié)合，可在不同水平檢測DNA、mRNA、protein。6.原位PCR+IHC可在組織原位通過擴增檢測微量目的DNA。7.趨于標(biāo)準(zhǔn)化、自動化。二、IHC的現(xiàn)狀和發(fā)展前景45PPT課件二、IHC的現(xiàn)狀和發(fā)展前景6PPT課件（二）技術(shù)分類

1.根據(jù)染色方式分成：①貼片染色②漂浮染色2.根據(jù)Ag-Ab結(jié)合方式分成：①直接法②間接法③多層法

3.按標(biāo)記物的性質(zhì)分成：①免疫熒光技術(shù)（免疫熒光法）②免疫酶技術(shù)（酶標(biāo)抗體法、橋法、PAD法、ABC法）③免疫金屬技術(shù)（免疫鐵蛋白法、免疫金染色

法、蛋白A金法）46PPT課件（二）技術(shù)分類7PPT課件（三）標(biāo)記物1.必要性：組織細胞內(nèi)Ag-Ab結(jié)合反應(yīng)一般是不可

見的，若在鏡下檢測，則必須具有可視性標(biāo)記物。

2.常用標(biāo)記物①熒光素：最常用的是異硫一氰酸熒光素（Fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）---熒光顯微鏡下呈綠色熒光;四乙基羅達明（rho—damineRB200）---熒光顯微鏡下發(fā)橙紅色熒光②酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶。③生物素：（Biotin）④鐵蛋白金等：主要應(yīng)用于免疫電鏡。⑤其他：如同位素（因涉及污染和防護難一般不用）47PPT課件（三）標(biāo)記物8PPT課件（四）IHC的應(yīng)用1.

只要是形態(tài)科學(xué)均可采用:包括病理學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、生物學(xué)、病原微生物的檢測（病毒、細菌、寄生蟲等）、皮膚病學(xué)、器官移植等。2.

可用于多種材料：A.各種組織（冰凍組織、formalin固定組織、石蠟包埋組織兼可）；B.各種細胞(穿刺、體液、涂片、血細胞、培養(yǎng)細胞等）。3.

用于診斷：腫瘤病理學(xué)等（大中醫(yī)院）。4.

用于科研：臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，尤其是形態(tài)學(xué)專業(yè)研究生常用IHC，或IHC+分生技術(shù)；最近幾年，分子生物學(xué)研究異?；钴S，但最終還要歸到形態(tài)上來，用免疫組織化學(xué)方法對所研究的大分子進行定位，進而深入研究其功能。48PPT課件（四）IHC的應(yīng)用9PPT課件（一）標(biāo)本的收集與處理

IHC染色成功與否及其質(zhì)量如何，除染色方法本身外，對材料的處理也至關(guān)重要，它包括：取材、固定、脫水、包埋、切片等。目的：保存好Ag的數(shù)量及活性、保持組織細胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。材料的來源：人體及實驗動物；細胞和組織；新鮮的及固定的。1、組織標(biāo)本的取材與儲存來源：活檢取材、手術(shù)切除、實驗動物組織等。要求：要快、要?。?×1×0.4cm），避免擠壓。處理：冰凍→即用或保存；固定→即用或保存。三、樣品的準(zhǔn)備、處理49PPT課件三、樣品的準(zhǔn)備、處理10PPT課件

2、細胞標(biāo)本的取材與儲存來源：血細胞、穿刺細胞、體液細胞等。處理：細胞多時直接涂片、干燥、固定、染色；細胞少需離心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；對于體外培養(yǎng)細胞：貼壁生長細胞（內(nèi)皮C、纖維C、神經(jīng)C等）在培養(yǎng)皿底置載玻片；懸浮生長細胞需離心沉淀，再涂片、固定，即用或冰凍保存。

50PPT課件2、細胞標(biāo)本的取材與儲存11PPT課件

（二）固定（fixation）

1、固定的含義

固定是指以某種化學(xué)物質(zhì)使蛋白質(zhì)、酶類（變性）、脂質(zhì)、糖類等物質(zhì)保持在組織細胞原位，避免Ag溶解、擴散、丟失；保持組織細胞的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。

根據(jù)Ag對固定劑的耐受性，可將其分為：不穩(wěn)定Ag（如細胞表面Ag，不耐甲醛，宜用丙酮）、半穩(wěn)定Ag及穩(wěn)定Ag，后二者多為蛋白、肽類、酶類物質(zhì)。固定有時間性，太短達不到固定目的，太長交聯(lián)過度，封閉Ag。

51PPT課件（二）固定（fixation）12PPT課件

2、常用固定劑及其用途1.10%的formalin（4%的甲醛formaldehyde）：以pH7.4的PBS配制，優(yōu)點：穿透力強、固定快、組織收縮?。贿m于固定蛋白、肽類、酶、糖。IHC常用4%多聚甲醛polyformaldehyde灌注固定及后固定，時間4~6h。2.2.5%的戊二醛，同上。也可用2%戊二醛與2%多聚甲醛混合液固定，尤對超微結(jié)構(gòu)保存好。醛類固定劑的缺點是易封閉抗原，必要時需抗原修復(fù)。3.70%的酒精（乙醇），優(yōu)點：固定蛋白好，缺點：組織收縮嚴(yán)重；時間：2h。4.70%丙酮，優(yōu)點：滲透快；缺點：對形態(tài)保存不好；用于對冰凍切片和細胞涂片的固定；時間：10min。5.混合固定液：Bouin液：40%PF250ml、冰醋酸50ml、飽和苦味酸250ml；還有PLP固定液，較適合免疫組化。6.四氧化鋨（OsO4鋨酸）：常用PBS配制1%鋨酸溶液后固定1h，用于免疫組化及電鏡觀察。有強烈刺激，需在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。52PPT課件2、常用固定劑及其用途13PPT課件（三）組織的脫水、浸蠟、包埋和切片

前三步只用于石蠟切片，冰凍切片和振動切片不需此步驟。切片可分為：石蠟切片：脫水、透明、浸蠟、包埋、切片5~7μm；冰凍切片：浸糖，20%~30%蔗糖4oC過夜，減少冰晶；OCT包埋；液氮速凍，減輕組織破壞。病理切片要薄，5~7μm；腦片通常

30~50μm厚。振動切片：不需做任何包埋，固定后的組織可直接用振動切片機做各種厚度的切片，并在染色后可進一步制作電鏡標(biāo)本觀察。

53PPT課件（三）組織的脫水、浸蠟、包埋和切片14PPT課件（四）防脫片劑

（1）

蛋白甘油，蛋清與甘油1：1攪拌、過濾、防腐；（2）1%的鉻礬明膠涂片；（3）0.1%的多聚賴氨酸涂片，晾干備用。配制時用塑料瓶而不能用玻璃瓶；

（4）

購買商品化的進口硅化玻片；

（5）APES（氨丙基三乙氧基硅烷），1：50丙酮稀釋，浸片20~30秒，晾干備用；貼片時要一步到位。54PPT課件（四）防脫片劑15PPT課件（五）抗原修復(fù)

近年興起的新技術(shù)。目的：暴露被交聯(lián)封閉的Ag。主要適用于經(jīng)長期formalin固定的標(biāo)本、石蠟包埋標(biāo)本；也可用于冰凍切片。常用的方法有：（1）

微波加熱切片煮沸10~20min，室溫自然冷卻，所用溶液有：①飽和NaCL溶液；②10mMpH6.0的枸櫞酸鈉緩沖液；③4M的尿素等；④pH8.0TBS;（2）高壓鍋處理將切片放入10mM、pH6.0的枸櫞酸鈉緩沖液容器中，置鍋內(nèi)加蓋噴氣3~10min，自然冷卻。（3）酶消化處理：常用0.1%的胰蛋白酶（含0.1%CaCL2，pH7.8）37。C10min。或0.4%胃蛋白酶37。C30min;55PPT課件（五）抗原修復(fù)16PPT課件

（一）基本染色方法

熒光素標(biāo)記抗體：FITC、直接法TRITC等標(biāo)記抗體法酶標(biāo)記抗體：HRP、AP等

熒光素標(biāo)記抗體間接法

酶標(biāo)記抗體（三步法）

非標(biāo)記抗體法：酶橋法、PAP法、APAAP法;

親和組化法：ABC法、LAB法、LsAB法、BRAB法;

雙重標(biāo)記：阻斷法（酸洗Ⅰ抗）、非阻斷法（連續(xù)染）四、免疫組織化學(xué)技術(shù)56PPT課件四、免疫組織化學(xué)技術(shù)17PPT課件1．直接法

熒光素直接標(biāo)記特異性抗體（一抗）上，標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合（在切片上）熒光顯微鏡下觀察→檢測抗原。

優(yōu)點：簡單，時間短，

特異性強。

缺點：靈敏度低，所

需抗體量大

（不經(jīng)濟）。

應(yīng)用：基本不用了??！57PPT課件1．直接法優(yōu)點：簡單，時間短，18PPT課件2．間接法

熒光素標(biāo)記在二抗上（二抗：抗產(chǎn)生一抗動物的IgG抗體）?！@色后鏡檢特點：1、敏感性較直接法高3-4倍，但特異性較低；2、不必標(biāo)記每種一抗，只需標(biāo)記某一種動物的二抗；3、一抗可高度稀釋，節(jié)省一抗，且可用PBS代替一抗做空白對照。58PPT課件2．間接法

熒光素標(biāo)記在二抗上（二抗：抗產(chǎn)生一抗動3．非標(biāo)記Ab橋法：

“橋法”是酶標(biāo)記抗體的改進，經(jīng)過三次抗體，其二抗為未標(biāo)記橋抗體。（1）單橋法59PPT課件3．非標(biāo)記Ab橋法：20PPT課件(2)雙橋法

在三抗之后，將二抗和三抗再重復(fù)一次，可增大染色強度?！锾貏e提示：注意動物種屬關(guān)系

特點：敏感性高，但酶濃度不好掌握；與組織非特異性結(jié)合的酶不易洗去，背景染色重。60PPT課件(2)雙橋法21PPT課件4．過氧化物酶—抗過氧化物酶法（Peroxidaseanti-peroxidasemethod，簡稱PAP法）

是橋法的改良，用第二抗體作“橋梁”，先與第一抗體結(jié)合，再與PAP復(fù)合物聯(lián)結(jié)，形成抗原—抗體—抗IgG抗體—PAP復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。特點：靈敏度高，比間接熒光法敏感20倍，比間接酶標(biāo)記抗體法敏感100倍61PPT課件4．過氧化物酶—抗過氧化物酶法（Peroxidasean

5．親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法（avidin-biotin-peroxidasecomplextechnique，簡稱ABC法）。

關(guān)鍵的程序步驟為3步：

Ag+Ab1+（Ab2-B）+AB★C

復(fù)合物（Ab2-B

為生物素標(biāo)記的第二抗體）（B★為生物素標(biāo)記的過氧化物酶）

AB★C復(fù)合物是avidin與酶聯(lián)biotin在使用前30min配置，混勻。1個avidin分子結(jié)合了3個biotin分子，剩下1個結(jié)合點與2抗的生物素結(jié)合，avidin起橋聯(lián)作用。62PPT課件5．親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法（avidi（1）ABC復(fù)合物的制備：（2）ABC法反應(yīng)原理：特點：ABC法敏感性更高，比PAP法敏感20~40倍，背景也更清晰。63PPT課件（1）ABC復(fù)合物的制備：（2）ABC法反應(yīng)原理：特點：ABABC法示意圖64PPT課件ABC法示意圖25PPT課件染色結(jié)果觀察（BrdU）65PPT課件染色結(jié)果觀察（BrdU）26PPT課件

6、酶標(biāo)親和素-生物素技術(shù)（labelledavidin-biotintechnique，簡稱LAB法）。即用辣根過氧化物酶直接標(biāo)記avidin，用biotin標(biāo)記2抗。關(guān)鍵步驟為3步：

Ag+Ab1+（Ab2-B）+A★

（A★為HRP標(biāo)記的卵白素）

A★與2抗的生物素結(jié)合，avidin起橋聯(lián)作用。如將該法中的卵白素（avidin）變換成鏈霉卵白素(streptavidin)，LAB法即成LsAB法，或稱SP法。據(jù)認(rèn)為LAB法比ABC法敏感2~4倍，而LsAB法因鏈霉卵白素不與組織細胞中內(nèi)源性生物素結(jié)合而特異性更高。現(xiàn)在SP法已趨于取代ABC法而廣為應(yīng)用。66PPT課件6、酶標(biāo)親和素-生物素技術(shù)（labelle生物素化Ⅱ抗AB復(fù)合物酶標(biāo)鏈卵白素AvidinBiotinPeroxidaseⅠ抗組織抗原ABC法（3步完成）LsAB（SP）法（3步完成）67PPT課件AB復(fù)合物酶標(biāo)鏈卵白素AvidinBiotinPeroxid鏈霉卵白素酶生物素底物抗原SP法示意圖68PPT課件鏈霉卵白素酶生物素底物抗原SP法示意圖29PPT課件（二）免疫組化染色步驟（以ABC法為例）

1)、切片常規(guī)脫蠟至水：二甲苯雖然可以反復(fù)使用，但次數(shù)不宜多。乙醇的濃度是從高到低，與脫水時相反。

2)、滅活內(nèi)源性酶：博士德推薦應(yīng)用3%的雙氧水，但實際操作中，使用30%雙氧水和純甲醇按1:9的溶劑比混合較為理想。

3)、抗原修復(fù)：暴露被交聯(lián)封閉的Ag。

4)、正常山羊血清封閉：封閉時應(yīng)該注意室溫與時間的相對關(guān)系。室溫低，時間就要長一些，反之亦然。另外，保持反應(yīng)池濕潤是重要的一環(huán)，否則，前功盡棄。后面的步驟也是如此。

5)、一抗反應(yīng)：一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強度與背景有直接關(guān)系。一般說來，陽性染色強度不夠時，可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時間；背景過高時則相反。

孵育時間與溫度：抗原抗體充分反應(yīng)是得到可靠