T-SHZSAQS 00161-2022 生鮮乳中金黃色葡萄球菌的定量檢測

ICS65.020.30CCSB40團 體 標 準T/SHZSAQS00161—2022生鮮乳中金黃色葡萄球菌的定量檢測2022-11-09發(fā)布 2022-11-09實施石河子市質(zhì)量標準化協(xié)會 發(fā)布T/SHZSAQS 00161—2022T/SHZSAQS 00161—2022PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前言 II1范引文件 1語定義 1黃葡球菌 1時量合鏈應(yīng) 1112器備試劑 2器設(shè)備 22定黃葡球物與針明 2增因 2增物 2物用明 2針明 2的段 3控粒 3驗法 3品備 3板備 3驗驟 3果定 4員護 4意項 4前 言本文件參照GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。張豫、何開兵、張靜、郭嘉、趙天藝、何白雪、張夢琦。T/SHZSAQS 00161—2022T/SHZSAQS 00161—2022PAGEPAGE4生鮮乳中金黃色葡萄球菌的定量檢測范圍本文件規(guī)定了生鮮乳中金黃色葡萄球菌定量檢測的術(shù)語與定義及儀器設(shè)備和試劑、鑒定金黃色葡萄球菌引物與探針說明、實驗方法、結(jié)果判定、人員防護、注意事項等。適用于生鮮乳中金黃色葡萄球菌的定量檢測。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489 驗生物全用求GB/T27401 實質(zhì)量制范NY/T541 物病實室驗樣YY/T1173 合鏈反分儀JJF1527 金黃色葡萄球菌屬革蘭氏陽性菌，不含芽胞和鞭毛，是微球菌科葡萄球菌屬細菌。在顯微鏡下呈葡萄串狀。PCR（QuantitativeReal-timeDNADNA應(yīng)用化學(xué)方法合成一對與已知擴增基因片段兩側(cè)DNA序列互補的寡核苷酸，作為PCR擴增的片段。待擴增的靶DNA。實時熒光定量PCR操作、校準方法均參考YY/T1173聚合酶鏈反應(yīng)分析儀和JJF1527-201聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準規(guī)范。:1.5mLPCRTipPCR（10μL～1000μL）DNAAceQUniversalU+ProbeMasterMixV2。金黃色葡萄球EbpS基因（GenBank:U48826.2）。EbpS-F:TTCTGGCAAGGTGAATAACTCGACEbpS-R:GCACTATTACTTGCTGCGCCTEbpS-Probe:TCGGTGCTGGAACAGCAGGTTTGGCT引物EbpS-F、EbpS-R、EbpS-Probe在使用時用滅菌雙蒸水稀釋成濃度為10umol/L。本實驗針對EbpS基因設(shè)計TaqMan探針，探針5’端標記為：6-FAM（6-羧基熒光素）；探針3’端標記為：BHQ1（熒光標記多肽）。預(yù)計擴增目的片段134bp。EbpS-pMD-19-T-DH5α大腸桿菌，涂布LB平板，次日挑取單克隆菌落，無菌操作臺內(nèi)接種至20mLLB液體培養(yǎng)基，搖床180rpm/min培養(yǎng)12h，取5mL菌液，提取EbpS陽性質(zhì)粒，用微量核酸濃度檢測儀檢測陽性質(zhì)粒濃度。采集哺乳動物新鮮原乳約（10～20）mL置于滅菌的帶蓋塑料管中，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。按照基因組DNA提取試劑盒的說明書提取各乳樣DNA。PCR30minqPCR反應(yīng)程序反應(yīng)溫度反應(yīng)循環(huán)污染消化21個循環(huán)預(yù)變性51個循環(huán)95℃1045個循環(huán)60℃30取出8EbpS陽性質(zhì)粒為陽性對照，以10度稀釋方法，提取乳樣DNA3qPCR反應(yīng)體系反應(yīng)組分添加量（μL）AceQUniversalU+Probe10F、R(10μM)各0.4TaqManProbe(10μM)0.2模板2無酶水至25μLPCRPCRCty=-3.3141x+44.364（y為CtDNA根據(jù)標準曲線計算孔中檢測核酸濃度，當(dāng)孔內(nèi)DNA濃度超過9.6ng/μL時，判定檢測結(jié)果為陽性，即生鮮乳中金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)大于9.56×104CFU/mL；當(dāng)孔內(nèi)DNA濃度小于9.6ng/μL時，判定檢測結(jié)果為陰性，生鮮乳中金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)小于9.56×104CFU/mL。實驗室工作人員在上班前應(yīng)進行個人衛(wèi)生處置，對全身進行噴霧消毒；進入實驗室后必須穿工作衣、戴工作帽、手套、膠套、醫(yī)用口罩；實驗室工作人員在每次接觸標本后立即進行清洗和消毒，手消毒可用75%乙醇或用0.3%～0.5%碘伏，嚴格按照洗手法搓揉