生化物質(zhì)的測定方法

關(guān)于生化物質(zhì)的測定方法第一頁，共六十六頁，2022年，8月28日第二部分生化實驗技術(shù)

PART2BIOCHEMICALEXPERIMENTALTECHNIQUE生化物質(zhì)的分析檢測方法生化物質(zhì)的制備和分離純化蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)研究免疫學(xué)方法在生化實驗中的應(yīng)用第二頁，共六十六頁，2022年，8月28日第七章生化物質(zhì)的分析檢測方法滴定分析法光譜學(xué)方法放射性同位素方法一些特定生化物質(zhì)的分析檢測第三頁，共六十六頁，2022年，8月28日7-1滴定分析法適合滴定分析的條件常用的滴定方法注意事項第四頁，共六十六頁，2022年，8月28日適合滴定分析的條件反應(yīng)有嚴(yán)格的化學(xué)計量關(guān)系反應(yīng)能夠迅速完成有合適方法確定滴定終點第五頁，共六十六頁，2022年，8月28日常用的滴定方法酸堿滴定直接滴定、間接滴定氧化還原滴定重鉻酸鉀法、高錳酸鉀法、碘量法沉淀滴定配位滴定第六頁，共六十六頁，2022年，8月28日注意事項標(biāo)準(zhǔn)溶液與基準(zhǔn)物質(zhì)反應(yīng)條件的控制反應(yīng)的適用范圍滴定終點的判斷反應(yīng)干擾因素的消除結(jié)果的正確計算第七頁，共六十六頁，2022年，8月28日7-2光譜學(xué)方法電磁輻射與光譜光吸收的定量紫外與可見光光譜法熒光光度法紅外光譜法核磁共振法第八頁，共六十六頁，2022年，8月28日電磁輻射與光譜光屬于電磁波自然界中存在各種不同波長的電磁波分光光度法所使用的光譜范圍在200nm-10μ（1μ=1,000nm）之間200nm－400nm為紫外光區(qū)400nm－760nm為可見光區(qū)760nm－10,000nm為紅外光區(qū)第九頁，共六十六頁，2022年，8月28日光吸收的定量Lambert-Beer’sLaw-lgT=A=D=aCLT：transmittance；A：absorbance；D：opticaldensitya：absorbancecoefficient（摩爾吸光系數(shù)/百分吸光系數(shù)）L：distance/thickness第十頁，共六十六頁，2022年，8月28日分光光度計基本結(jié)構(gòu)簡介分光光度計因使用的波長范圍不同而分為紫外光區(qū)、可見光區(qū)、紅外光區(qū)以及萬用（全波段）分光光度計等。無論哪一類分光光度計都由下列五部分組成，即光源、單色器、狹縫、樣品池，檢測器系統(tǒng)

第十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日光源鎢燈和鹵鎢燈發(fā)射320－2000nm連續(xù)光譜，最適宜工作范圍為360－1000nm，穩(wěn)定性好，用作可見光分光光度計的光源。氫燈和氘燈能發(fā)射150－400nm的紫外結(jié)，可用作紫外光區(qū)分光光度計的光源。紅外線光源則由納恩斯特（Nernst）棒產(chǎn)生，此棒由ＺrＯ2:Ｙ2Ｏ3=17:3（Ｚr為鋯，Ｙ為釔）或Ｙ2Ｏ3，ＧeＯ2（Ｇe為鈰）及ＴhＯ2

（Ｔh為釷）之混合物制成。第十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日分光系統(tǒng)（單色器）與狹縫單色器是指能從混合光波中分解出來所需單一波長光的裝置，由棱鏡或光柵構(gòu)成。

狹縫是指由一對隔板在光通路上形成的縫隙，用來調(diào)節(jié)入射單色光的純度和強度，也直接影響分辯力。第十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日比色環(huán)比色環(huán)也叫樣品池，吸收器或比色皿，用來盛溶液，各個杯子壁厚度等規(guī)格應(yīng)盡可能完全相等，否則將產(chǎn)生測定誤差。玻璃比色杯只適用于可見光區(qū)，在紫外區(qū)測定時要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光學(xué)面，用后要及時洗滌，可用溫水或稀鹽酸，乙醇以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。第十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日檢測器系統(tǒng)檢測器產(chǎn)生的光電流以某種方式轉(zhuǎn)變成模擬的或數(shù)字的結(jié)果，模擬輸出裝置包括電流表、電壓表、記錄器、示波器及與計算機聯(lián)用等，數(shù)字輸出則通過模擬／數(shù)字轉(zhuǎn)換裝置如數(shù)字式電壓表等。第十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日紫外與可見光光譜法定量方法：吸光系數(shù)法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法、對照法注意事項：選擇合適的儀器和比色皿盡可能在吸光度0.1~1.0的范圍內(nèi)測定選擇合適的靈敏度盡可能做吸收光譜做空白與對照實驗第十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日熒光光度法激發(fā)光/發(fā)射光（熒光fluorescence）定量方法：直接測定法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法、對照法間接測定法：化學(xué)轉(zhuǎn)化法、熒光瘁滅法、敏化發(fā)光法第十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日注意事項：選擇合適的儀器和比色皿控制好測定的溶劑、濃度、酸度、溫度、時間，并盡量消除干擾因素選擇合適的激發(fā)波長和發(fā)射波長做空白與對照實驗熒光光度法比紫外可見光度法靈敏1000~10000倍第十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日紅外光譜法、核磁共振法主要進行物質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分的分析第十九頁，共六十六頁，2022年，8月28日分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用測定溶液中物質(zhì)的含量用紫外光譜等鑒定化合物第二十頁，共六十六頁，2022年，8月28日用紫外光譜鑒定化合物使用分光光度計可以繪制吸收光譜曲線。方法是用各種波長不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測定此溶液對每一種單色光的吸光度，然后以波長為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)繪制吸光度──波長曲線，此曲線即吸收光譜曲線。各種物質(zhì)有它自己一定的吸收光譜曲線，因此用吸收光譜曲線圖可以進行物質(zhì)種類的鑒定。第二十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日當(dāng)一種未知物質(zhì)的吸收光譜曲線和某一已知物質(zhì)的吸收光譜曲線開關(guān)一樣時，則很可能它們是同一物質(zhì)。一定物質(zhì)在不同濃度時，其吸收光譜曲線中，峰值的大小不同，但形狀相似，即吸收高峰和低峰的波長是一定不變的。紫外吸收光譜比較簡單，同一種物質(zhì)的紫外吸收光譜應(yīng)完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結(jié)構(gòu)不一定相同。除了特殊情況外，單獨依靠紫外吸收光譜決定一個未知物結(jié)構(gòu)，必須與其它方法配合。紫外吸收光譜分析主要用于已知物質(zhì)的定量分析和純度分析。第二十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日7-3放射性同位素方法-、-、-、x--：3H、14C、32P、35S、131I-：235U、238U、-：

60Co液體閃爍計數(shù)器法放射自顯影法第二十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日同位素符號半衰期β射線能量（MeV）氫-33H12.3年0.018碳-1414C5720年0.156磷－3232P14.3天1.71硫－3535S87.1天0.167碘－131131I8.05天0.605常用同位素的特征

第二十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日各種射線的特點α射線通過物質(zhì)時，主要是通過電離和激發(fā)把它的輻射能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)，其射程很短，一個1兆電子伏（1MeV）的α射線，在空氣中的射程

約1.0<厘米，在鉛金屬中只有23微米（um），一張普通紙就能將α射線完全擋住，但α射線的能量能被組織和器官全部吸收。

第二十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日

β射線也能引起物質(zhì)電離和激發(fā)，與α射線

的能量相同的β射線，在同一物質(zhì)中的射程比α要長得多，如>1MeVrβ射線，在空氣

中的射程是10米，高能量快速運動的β粒子，如磷－，能量為1.71MeV遇到物質(zhì)，特別是突然被原子序數(shù)高的物質(zhì)（如鉛，原子序數(shù)為82）阻止后，運動方向會發(fā)生改變，產(chǎn)生軔致輻射。軔致輻射是一種連續(xù)的電磁輻射，它發(fā)生的幾率與β射線的能量

和物質(zhì)的原子序數(shù)成正比，因此在防護上采用低密度材料，以減少軔致輻射。β射線能被不太厚的鋁層等吸收。

第二十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日γ射線的穿透力最強，射程最大，1MeV的r射線在空氣中的射程約有米之遠，r射線作用于物質(zhì)可產(chǎn)生光電效應(yīng)、康普頓效應(yīng)和電子對效應(yīng)，它不會被物質(zhì)完全吸收，只會隨著物質(zhì)厚度的增加而逐漸減弱。

第二十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日放射性強度及其度量單位

。放射性同位素不斷地衰變，它在單位時間內(nèi)發(fā)生衰變的原子數(shù)目叫做放射性強度（radioactivity），放射性強度的常用單位是居里（curie），表示在1秒鐘內(nèi)發(fā)生3.7×1010次核衰變，符號為Ci。

1Ci=3.7×1010dps=2.22×1012dpm

1mCi=3.7×107dps=2.22×109dpm

1μCi=3.7×104dps=2.22×106dpm

第二十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日1977年國際放射防護委員會（ICRP）發(fā)表的第26號出版物中，根據(jù)國際輻射單位

與測量委員會（ICRU）的建議，對放射性強度等計算單位采用了國際單位制（SI），

我國于1986年正式執(zhí)行。在SI中，放射性強度單位用貝柯勒爾（becquerel）表示，簡稱貝可，為1秒鐘內(nèi)發(fā)生一次核衰變，符號為Bq。1Bq=1dps=2.703×10-11Ci該單位在實

際應(yīng)用中減少了換算步驟，方便了使用。第二十九頁，共六十六頁，2022年，8月28日放射防護

就外照射而言，由于各種射線穿透能力不同，γ射線照射對機體的危害大于β射線，而β射線的危害性又大于α射線。受照射部位不同，受害程度出不同，對某種放射性同位素蓄積率高的組織或器官，必然受害嚴(yán)重。

第三十頁，共六十六頁，2022年，8月28日當(dāng)放射性物質(zhì)進入了體內(nèi)，對機體造成內(nèi)照射的情形下，α射線由于射程很短，其危害性大于β射線和γ射線的危害，而β射線的內(nèi)照射危害又大于γ射線。放射防護的必要性在于保護操作者本人免受輻射損傷，防止了必要的射線照射，保護周圍人群的健康和安全，做好放射性污物、污水的收集與處理，避免環(huán)境污染，保證實驗?zāi)軌蛘＿M行，取得的結(jié)果可靠。

第三十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日放射防護的三原則

1.放射實踐的正當(dāng)化

在進行任何放射性工作時，都應(yīng)當(dāng)代價和利益的分析，要求任何放射實踐，對人群和環(huán)境可能產(chǎn)生的危害比起個人和社會從中獲得的利益來，應(yīng)當(dāng)是很小的，即效益明顯大于付出的全部代價時，所進行的放射性工作就是正當(dāng)?shù)模侵档眠M行的。

第三十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日2.放射防護的最優(yōu)化

使放射性和照射量在可以合理達到的盡可能低的水平，避免一些不必要的照射，要求對放射實踐選擇防護水平時，必須在由放射實踐帶來的利益與所付出和健康損害的代價之間權(quán)衡利蔽，以期用最小的代價獲取最大的凈利益。第三十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日個人劑量限制

在放射實踐中，不產(chǎn)生過高的個體照射量，保證任何人的危險度不超過某一數(shù)值，即必須保證個人所受的放射性劑量不超過規(guī)定的相應(yīng)限值。規(guī)定工作人員全身均勻照射的年劑量當(dāng)量限制為50毫希沃特*（mSv），當(dāng)長期持續(xù)受放射性照射時，公眾中個人在一生中每年全身受照射的年劑量當(dāng)量限值不應(yīng)高于1mSv(0.1rem)，且以上這些限制不包括天然本底照射和醫(yī)療照射。

第三十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日同位素示蹤法基本原理和特點

同位素示蹤所利用的放射性核素（或穩(wěn)定性核素）及它們的化合物，與自然界存在的相應(yīng)普通元素及其化合物之間的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)是相同的，只是具有不同的核物理性質(zhì)。因此，就可以用同位素作為一種標(biāo)記，制成含有同位素的標(biāo)記化合物（如標(biāo)記食物，藥物和代謝物質(zhì)等）代替相應(yīng)的非標(biāo)記化合物。利用放射性同位素不斷地放出特征射線的核物理性質(zhì)，就可以用核探測器隨時追蹤它在體內(nèi)或體外的位置、數(shù)量及其轉(zhuǎn)變等

第三十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日1.靈敏度高

放射性示蹤法可測到10-14－10-18克水平

2.方法簡便

放射性測定不受其它非放射性物質(zhì)的干擾，可以省略許多復(fù)雜的物質(zhì)分離步驟

3.定位定量準(zhǔn)確

4.符合生理條件

第三十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日放射性同位素測量方法的選擇.

測量方法的選擇取決于射線種類對于α射線通?？捎昧蚧\晶體、電離室、核乳膠等方法探測；對能量高的β射線可用云母窗計數(shù)管、塑料閃爍晶體及核乳膠測定，對于能量低的β射線可用液體閃爍計數(shù)器測量：對于γ射線則用G-M計數(shù)管，碘化鈉（鉈）閃爍晶體探測。目前大多數(shù)實驗室主要采用晶體閃爍計數(shù)法和液體閃爍計數(shù)法兩種測量方式

第三十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日7-4一些特定生化物質(zhì)的分析檢測

蛋白質(zhì)的分析與檢測方法凱氏(Kjedahl)定氮法FOLIN-酚法雙縮脲法紫外分光光度法染料結(jié)合法水揚酸比色法其他折光法、旋光法、近紅外法譜法。第三十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日凱氏(Kjedahl)定氮法

凱氏定氮法可用于所有樣品中蛋白質(zhì)含量測定，因樣品中常含有核酸，生物堿，含N類脂、卟啉以及含N色素等非蛋白質(zhì)的含N化合物，故結(jié)果稱為粗蛋白含量。凱氏定N法：始于1833年，現(xiàn)有常量法、微量法、自動定氮儀法、半微量法、改良凱氏法。第三十九頁，共六十六頁，2022年，8月28日原理：樣品蛋白質(zhì)含量=樣品蛋白質(zhì)系數(shù)*樣品N含量樣品與濃H2SO4和催化劑一同加熱消化，使樣品中的蛋白質(zhì)分解，其中C和H被氧化為CO2逸出，而樣品的有機N轉(zhuǎn)化為NH3與H2SO4結(jié)合為（NH4）S2O，然后加堿蒸餾，使NH3蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可算出樣品的N含量。第四十頁，共六十六頁，2022年，8月28日

樣品消化2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4催化劑硫酸銅硫酸鉀硒(NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O第四十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日蒸餾：消化完全樣品+NaOH→堿性→加熱蒸餾→NH3↑2NaOH+（NH4）2SO4=2NH3↑+Na2SO4+2H2O

第四十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日吸收與滴定加熱蒸餾收出NH3硼酸溶液吸收，吸收完全后，用標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定。2NH3+4H3BO3=（NH4）2B4O7+5H2O（NH4）2B4O7+5H2O+2HCl=2NH4Cl+4H3BO4因為硼酸微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色的反應(yīng)，但有吸收NH3的作用。第四十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日適用范圍可適用于各類蛋白質(zhì)的測定。第四十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日操作方法

（1）樣品消化（2-3小時）樣品的準(zhǔn)確稱取樣品及有關(guān)試劑的加入加熱溫度的控制（防止暴沸現(xiàn)象）抽氣設(shè)施的安裝消化終點的判斷消化不完全的處理第四十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日（2）做好蒸餾的準(zhǔn)備工作凱氏定氮儀的安裝吸收瓶的洗滌與檢查（甲基紅-溴甲酚綠：酒紅色-藍綠色（PH：5.1））凱氏定氮儀的洗滌與檢查蒸餾操作練習(xí)（用0.1414%的硫酸銨）第四十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日（3）樣品的蒸餾（4）吸收（2%硼酸）（5）滴定（0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液）（甲基紅-溴甲酚綠：酒紅色-藍綠色（PH：5.1））第四十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日說明①所用試劑應(yīng)用無氨蒸餾水配制。②消化時不要用強火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘附壁上造成淪不完全，損失N。③消化過程中應(yīng)注意不時轉(zhuǎn)動瓶凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在壁上殘渣洗下，并促進消化完全。④樣品中若含脂肪or糖較多時，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，應(yīng)小火加熱，或加少量辛醇o(jì)r液體石蠟or硅油消泡劑并注意控制熱源強度。第四十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日⑤樣品消化液不易澄清時，可加30%H2O22~3ml消化⑥一般消化至透明后，繼續(xù)30ml,即可。但含特別難以氨化的氮化合物樣品，如：賴氨酸，組氨酸、色氨酸、酪氨酸，需延長時間、有機物消化完全呈藍色的淺綠色，但含F(xiàn)e高時，呈較深綠色。

第四十九頁，共六十六頁，2022年，8月28日⑦蒸餾前給水蒸汽發(fā)出器內(nèi)裝水至2/3容積處，甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)ml使其始終保持酸性，這樣可以逸避免水中NH3被蒸發(fā)而影響結(jié)果。

⑧2%硼酸吸收液每次用量10ml，用前加入甲基紅一溴甲酚綠混合指示劑2d。⑨蒸餾時，蒸氣發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程不得?；饠嗥駝t將發(fā)生倒吸。⑩加堿要足，操作要迅速，漏斗應(yīng)采用水封，以免NH3由此逸出。

第五十頁，共六十六頁，2022年，8月28日（11）微量法適合于測定含Nmg。（12）消化時，若用水泵做抽氣裝置，一定要等凱氏瓶從排氣管上取下后，才能關(guān)閉水源，否則會發(fā)生倒吸。（13）在使用凱氏定氮儀時，一定要小心，特別應(yīng)注意各個自由夾的正確使用。（14）凱氏定氮法可用于所有樣品中蛋白質(zhì)含量測定，因樣品中常含有核酸，生物堿，含N類脂、卟啉以及含N色素等非蛋白質(zhì)的含N化合物，故結(jié)果稱為粗蛋白含量。第五十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日

凱氏定N法具有，應(yīng)用范圍廣，靈敏度高，回收率好等特點，但消化樣品費時，操作產(chǎn)生大量大害氣體，污染環(huán)境為滿足工藝過程加快速控制分析，減少污染，簡便省時，又創(chuàng)立快速測定蛋白質(zhì)方法：第五十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日Folin試劑法（Lowry法）PRO+Cu++/OH-（磷鎢酸+磷鉬酸）蘭色物質(zhì)（500/700nm）第五十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日雙縮脲法

原理第五十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日

雙縮脲反應(yīng)PRO+Cu++/OH-

紫紅色物質(zhì)(560nm）在一定條件下，顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比NH2NHCOCONH2第五十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日特點及應(yīng)用范圍：本法靈敏度低，但操作簡單快速，常用于生化領(lǐng)域。本法亦適用于豆類，油料，米谷、等作物種子及肉類樣品和乳制品第五十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日操作方法①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以采用凱氏定N法測出pro含量樣為標(biāo)準(zhǔn)樣，按蛋白質(zhì)

mg分別取樣于8支50ml管子中，各加1mlCCl4再用堿性CuSO4稀釋至50ml，振搖10min，靜置1hr，取上層清液，離心5min，取上清于比色皿中，560nm以蒸餾水為參比測O.D.，以pro含量橫作標(biāo)，O.D.為縱坐標(biāo)，制標(biāo)準(zhǔn)曲線。②樣品測定：取樣品（蛋白質(zhì)