現(xiàn)代生物學(xué)實(shí)驗(yàn)介紹課件三rna技術(shù)

RNA技術(shù)中心法則熒光定量PCR

(RealTimeQuantitativePCR)基因芯片（Microarray）轉(zhuǎn)錄組分析(RNA-Seq)RNA干擾(RNAinterference)常用RNA技術(shù)實(shí)時(shí)定量PCR

Real-TimeQuantitativePCR5實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)時(shí)定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料，實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR過程中熒光信號(hào)的累積強(qiáng)度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。兩種熒光標(biāo)記法1.染料染色

-SYBRGreenI

-EB2.探針標(biāo)記

-Taqman

-分子信標(biāo)

SYBRGreenI的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm1.熒光染料法SYBRGreenI的發(fā)光強(qiáng)度與DNA的量成正比

染料法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單，僅需要設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物，不需要設(shè)計(jì)探針，通用性好；成本低；可通過溶解曲線分析檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。低通量實(shí)驗(yàn)一般優(yōu)先考慮使用SYBRGreenI染料法。缺點(diǎn)SYBRGreenI方法對(duì)PCR擴(kuò)增特異性要求較高

SYBRGreenI可與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會(huì)影響定量的精確性SYBRGreenI不能區(qū)分不同擴(kuò)增片段發(fā)出的熒光而導(dǎo)致它不能用于多重反應(yīng)

染料法的優(yōu)缺點(diǎn)2.熒光探針法(Taqman)TaqmanProbeQuencherReporter探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；探針降解，熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光信號(hào)Tagmanprobe的工作原理探針與PCR產(chǎn)物的數(shù)量關(guān)系每產(chǎn)生一個(gè)新的DNA片段，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位的熒光信號(hào)信號(hào)強(qiáng)度與DNA的copy數(shù)成正比1.擴(kuò)增曲線描述PCR動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線稱為擴(kuò)增曲線。PCR的擴(kuò)增曲線實(shí)際上并不是一條標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是呈S型曲線CyclesFluoresces161.擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線分三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段(基線期)：擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段（對(duì)數(shù)期），PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可選擇該階段進(jìn)行定量分析。在平臺(tái)期：擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。172.熒光閾值一般把熒光PCR的前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline，基線期），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋。是人為設(shè)定的一個(gè)值，可設(shè)在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上。缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍（自動(dòng)）。2.熒光閾值3.

Ct值Cyclethreshold，就是當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)。線性圖譜半對(duì)數(shù)圖譜Ct值Ct值203.

Ct值Ct值與模版的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的Ct值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度。21三、絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線已知濃度的相應(yīng)DNA模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)得到未知濃度樣品的C(t)值絕對(duì)定量：從熒光到拷貝數(shù)

絕對(duì)定量舉例標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對(duì)定量舉例如未知樣本Ct為20.5，將Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：20.5=-3.183X+40.211X=（20.5-40.211）/-3.183=6.19未知樣本拷貝數(shù)=106.19

=1548816copies/ul相對(duì)定量的目的比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系）相對(duì)定量的問題樣品材料不均一造成的差別內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)要相對(duì)恒定，表達(dá)不受處理因素影響）對(duì)目的基因進(jìn)行均一化：去除樣本間加樣量不同帶來的誤差四、相對(duì)定量相對(duì)定量的方法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法△△Ct法△△Ct法△Ct，即Ct的變化值假定目的基因和參照基因的擴(kuò)增效率相同，均為100%＝2-(△Ct1-△Ct2)＝2-△△Ct△△Ct法舉例Cyp6B6aveCt18SRNAaveCt標(biāo)準(zhǔn)化的Cyp6B6△Ct校正△△Ct處理組22.812.310.5-1.4對(duì)照組24.512.611.90因此，處理組Cyp6B6基因的表達(dá)量是對(duì)照組的2-△△Ct=2-（-1.4）＝21.4＝2.64倍29引物設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)做溶解曲線Dissociationcurve特異性擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物引物二聚體基因芯片（Microarray）基因芯片的定義基因芯片（genechip），又稱DNA微陣列（microarray），將大量探針以高密度固定于支持物上，然后與標(biāo)記的核酸樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。基因芯片的基本原理:堿基互補(bǔ)匹配。

生物芯片的概念是Fodor等人于1991年提出(Fodoretal.,1991,Science)。在90年代初期，利用光原位合成的原理，在基質(zhì)上固定高密度的寡核苷酸的DNA測序芯片。

1995年Schena(Science,1995)等人，把擬南芥的45個(gè)基因固定在一張玻片上，并行檢測擬南芥45個(gè)基因的表達(dá)情況，這是第一次結(jié)合了高精度機(jī)械手點(diǎn)樣系統(tǒng)、熒光標(biāo)記技術(shù)、雙通道熒光掃描技術(shù)和數(shù)據(jù)分析軟件，是第一次真正意義上的用DNA芯片技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)分析的應(yīng)用。基因芯片的發(fā)展Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray基因芯片的發(fā)展基因芯片的分類(一)按載體材料分類玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。(二)按點(diǎn)樣方式分類原位合成芯片、點(diǎn)樣芯片。(三)按基因芯片的使用功能測序芯片、表達(dá)譜芯片、基因差異表達(dá)分析芯片。

sampletargethybridizationlabelprobeimageDataanalysis基因芯片分析流程基因芯片的應(yīng)用基因測序基因測序芯片技術(shù)中雜交測序技術(shù)和鄰堆雜交技術(shù)都能進(jìn)行高效快速的測序。基因芯片技術(shù)用于測序提出的較早，利用135000個(gè)探針的陣列對(duì)人類線粒體基因組測序，準(zhǔn)確率達(dá)99％以上。基因表達(dá)分析

在現(xiàn)在已經(jīng)明確包括人類、酵母菌及一些細(xì)菌等在內(nèi)的多種生物的全基因序列的條件下，基因芯片依靠其高度密集的核苷酸探針，能夠?qū)⒁环N生物所有的基因?qū)?yīng)的mRNA或cDNA或者該生物的全部ORF都編排在一張芯片上，從而簡便地檢測每個(gè)基因在不同環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄水平。整體分析多個(gè)基因的表達(dá)則能夠全面并且非常準(zhǔn)確地揭示基因產(chǎn)物和其轉(zhuǎn)錄模式之間的關(guān)系。同時(shí)，細(xì)胞的基因表達(dá)產(chǎn)物決定了細(xì)胞的生化組成、細(xì)胞的構(gòu)造、調(diào)控系統(tǒng)及功能范圍，根據(jù)已知基因表達(dá)產(chǎn)物的特性，基因芯片技術(shù)能夠全面、動(dòng)態(tài)地了解生活細(xì)胞在分子水平的活動(dòng)。疾病診斷隨著基因芯片使用范圍的增加，其在疾病的早期診斷、分類、指導(dǎo)預(yù)后和尋找致病基因上都有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。在癌癥的診斷上，醫(yī)生們通常依靠檢測一些基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)變化水平來進(jìn)行診斷。通過基因芯片技術(shù)對(duì)這些基因的檢測，可以對(duì)以上疾病進(jìn)行準(zhǔn)確的早期診斷?；蛐酒夹g(shù)還可用于病原菌的鑒定，通過構(gòu)建多種細(xì)菌的抗原決定簇和毒力因子的基因芯片，可以用于診斷臨床上不明確的感染性疾病的感染源。轉(zhuǎn)錄組分析(RNA-Seq)RNA-seq技術(shù)簡介RNA-Seq(RNAsequencing)，即RNA測序又稱轉(zhuǎn)錄組測序，就是把mRNA和non-codingRNA（ncRNA）全部或者其中一些用高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序分析的技術(shù)。ncRNA非編碼RNA(ncRNA)主要包括有以下幾種：轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)，核糖體RNA(rRNA)，小核RNA(snRNA)，核仁小分子RNA(snoRNA)，細(xì)胞質(zhì)小分子RNA(scRNA)，不均一核RNA(hnRNA)及小RNA(microRNA,miRNA)等。非編碼RNA具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，如對(duì)染色體結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)RNA加工修飾及穩(wěn)定性的影響，對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響，甚至對(duì)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)定性都有一定的影響。所以近年來，許多通過RNA-seq進(jìn)行測序分析的文章都包括對(duì)ncRNA的分析，并且發(fā)現(xiàn)了許多新的ncRNA。ShotGun文庫構(gòu)建DNA片段固定簇序列讀取反應(yīng)圖像獲得和處理序列組裝和比較單條模板擴(kuò)增1234TTTT…T

G

C

T

…RNA-seq技術(shù)流程1.樣品RNA準(zhǔn)備2.測序文庫構(gòu)建使用oligodT微珠純化mRNAmRNA片段化處理反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成合成雙鏈cDNA雙鏈DNA末端修復(fù)及3’末端加‘A’使用特定的測序接頭連接DNA片段兩端高保真聚合酶擴(kuò)增構(gòu)建成功的測序文庫3.DNA成簇（Cluster）擴(kuò)增4.高通量測序（IlluminaGenomeAnalyzerIIx）5.數(shù)據(jù)分析原始數(shù)據(jù)讀取與數(shù)據(jù)庫比對(duì)并進(jìn)行注釋深層次數(shù)據(jù)分析RNA-seq流程RNA-Seq的應(yīng)用

利用單堿基分辨率的RNA-Seq技術(shù)可極大地豐富基因注釋的很多方面內(nèi)容,包括5′/3′邊界鑒定、UTRs區(qū)域鑒定以及新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域鑒定等。RNA-Seq還可對(duì)可變剪接進(jìn)行定量研究。轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究在發(fā)現(xiàn)序列差異方面，如融合基因鑒定、編碼序列多態(tài)性研究等，RNA-seq也具有很大的潛力。轉(zhuǎn)錄本變異研究RNA-Seq一個(gè)特別強(qiáng)大的優(yōu)勢是它可以捕捉不同組織或狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化而無需對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行復(fù)雜的標(biāo)準(zhǔn)化?；虮磉_(dá)水平研究RNA干擾(RNAinterference)轉(zhuǎn)錄后沉默Post-transcriptionalgenesilencing(PTGS)

一些小的雙鏈RNA(siRNA)可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAi）。

RNAi的發(fā)現(xiàn)具有劃時(shí)代的意義，它不僅深入揭示了細(xì)胞內(nèi)基因沉默的機(jī)制，而且它還是后基因組時(shí)代基因功能分析的有力工具，極大地促進(jìn)了人類揭示生命奧秘的進(jìn)程；此外，siRNA本身還是一種極具前景的基因靶向藥物，可廣泛地用于諸如癌癥等疾病的治療。鑒于siRNA技術(shù)的巨大意義與廣闊應(yīng)用前景，2002年美國《科學(xué)》雜志將其評(píng)為全球年度十大科學(xué)進(jìn)展之首。RNA干擾（RNAinterference,RNAi）RNAi研究史

1990年，在對(duì)矮牽?；ǎ╬etunias）進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)協(xié)同抑制現(xiàn)象"cosuppression"，導(dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時(shí)都被抑制。

1995，研究發(fā)現(xiàn)注入反義RNA及正義鏈RNA都能抑制線蟲par-1

基因的表達(dá)；三年后，首次將雙鏈RNA注入到線蟲中,結(jié)果表現(xiàn)出比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默效果，這種技術(shù)的成熟使得大規(guī)模篩選線蟲RNAi誘導(dǎo)的功能缺失突變體成為可能，并引發(fā)后繼的大量針對(duì)這種模式生物基因敲除的研究。在果蠅的研究中同樣發(fā)現(xiàn)RNAi。通過顯微注射或者通過基因槍將dsRNA注入果蠅胚胎中能夠引發(fā)基因沉默。在過去的幾年中RNAi技術(shù)在果蠅的研究中成為一種反向遺傳工具，用于鑒定功能缺失表型。

2001年Elbashir等《Nature》上首次報(bào)道通過21個(gè)核苷酸的siRNA成功地在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性基因沉默。隨后，在小鼠等多種細(xì)胞中也取得了成功。協(xié)同抑制現(xiàn)象"cosuppression"牽?；ǎ╬etunias）

1995年，研究發(fā)現(xiàn)注入反義RNA及正義鏈RNA都能抑制線蟲par-1

基因的表達(dá)；三年后，首次將雙鏈RNA注入到線蟲中,結(jié)果表現(xiàn)出比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默效果，這種技術(shù)的成熟使得大規(guī)模篩選線蟲RNAi誘導(dǎo)的功能缺失突變體成為可能，并引發(fā)后繼的大量針對(duì)這種模式生物基因敲除的研究。線蟲（C.elegans）2006年的諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)獲得者：AndrewZ.FireCraigC.Mello在起始步驟，加入的dsRNA被Dicer酶切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段

在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex,orRISC）

激活的RISC通過堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上激活RISC需要一個(gè)ATP依賴的將siRNA解雙鏈的過程并在距離siRNA3'端12個(gè)堿基的位置切割mRNA

RNAi原理RNAi作用的特點(diǎn)高效性

研究發(fā)現(xiàn)RNAi過程中不同濃度的dsRNA產(chǎn)生的效果一樣。Miki等研究水稻OsRac基因家族的功能時(shí),通過構(gòu)建單一基因片段的植物表達(dá)載體,成功地抑制了OsRac基因家族的多個(gè)基因。說明RNAi可實(shí)現(xiàn)在一個(gè)個(gè)體或一個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)沉默多個(gè)基因。高度特異性

由dsRNA誘導(dǎo)的RNAi只引起與dsRNA同源的mRNA降解,不影響其它基因的表達(dá),具有很高的特異性。siRNA具有特征性的結(jié)構(gòu):5’末端為磷酸基,3’末端為羥基,并且有2個(gè)突出的單鏈核苷酸。這種結(jié)構(gòu)對(duì)RNAi是十分必要的。ATP依賴性研究發(fā)現(xiàn),如果除去或降低內(nèi)源性ATP含量,dsRNA對(duì)靶基因的抑制作用明顯降低或消失,加入外源性ATP后,抑制作用仍未加強(qiáng)。說明RNAi是一個(gè)對(duì)ATP依賴的過程,且外源性ATP對(duì)此無促進(jìn)作用。

可傳播性

在植物中,RNAi信號(hào)可以通過胞間連絲或維管組織在細(xì)胞間傳遞;而在動(dòng)物中,RNAi信號(hào)的擴(kuò)散需要特殊蛋白參與,在膜上形成跨膜通道