酶工程 第七章 酶分子定向進(jìn)化

酶工程

EnzymeEngineering林范學(xué)

fanxuelin@1/501第七章酶分子定向進(jìn)行酶分子定向進(jìn)化（enzymemoleculardirectedevolution）是模擬自然進(jìn)化過程（隨機(jī)變異和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。簡稱酶定向進(jìn)化（enzymedirectedevolution）2分子定向進(jìn)化

以各種生物大分子為進(jìn)化對象，目的是改良目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)、功能和特性，主要包括：酶分子定向進(jìn)化蛋白質(zhì)定向進(jìn)化核酸分子定向進(jìn)化。1993年,美國科學(xué)家ArnoldFH首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念，并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶。3定向進(jìn)化示意圖隨機(jī)突變+定向選擇＝目標(biāo)突變體細(xì)菌誘發(fā)突變的因素50

0C培養(yǎng)突變體庫選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長溫度為370C最適生長溫度提高了！4天然酶的局限酶催化的精確性和有效性常常不能很好地滿足酶學(xué)研究和工業(yè)化應(yīng)用的要求穩(wěn)定性差活性低使催化效率很低缺乏有商業(yè)價(jià)值的催化功能天然酶的局限性源于酶的自然進(jìn)化過程。5現(xiàn)代生物工程對酶的要求能具備長期穩(wěn)定性和活性能適用于水及非水相環(huán)境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物的原材料6酶定向進(jìn)化的基本過程基因的隨機(jī)突變定向選擇酶基因隨機(jī)突變構(gòu)建突變基因文庫篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶反復(fù)進(jìn)行易錯(cuò)PCRDNA重排基因家族重排平板篩選法熒光篩選法噬菌體表面展示法細(xì)胞表面展示法核糖體表面展示法高通量篩選7第一節(jié)酶基因體外隨機(jī)突變第二節(jié)酶突變基因的定向選擇第三節(jié)酶分子定向進(jìn)化的應(yīng)用8第一節(jié)酶基因體外隨機(jī)突變基因體外隨機(jī)突變方法的特點(diǎn)隨機(jī)突變方法特點(diǎn)易錯(cuò)PCR技術(shù)error-pronePCR從酶的單一基因出發(fā)，在特定的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使堿基配對出現(xiàn)錯(cuò)誤而引起基因突變基因重排技術(shù)DNAshuffling從兩條以上的正突變基因出發(fā)，經(jīng)過酶切和不加引物的PCR擴(kuò)增，使堿基序列重新排布而引起基因突變基因家族重排技術(shù)DNAfamilyshuffling從基因家族的若干基因出發(fā)，經(jīng)過酶切和不加引物的PCR擴(kuò)增，使堿基序列重新排布而引起基因突變9一、易錯(cuò)PCR技術(shù)易錯(cuò)PCR技術(shù)(error-pronePCR)是從酶的單一基因出發(fā)，在改變反應(yīng)條件下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，使擴(kuò)增得到的基因出現(xiàn)堿基配對錯(cuò)誤，從而引起基因突變的技術(shù)過程。(1)易錯(cuò)PCR反應(yīng)過程①雙鏈DNA變性：85-95℃②引物與單鏈DNA退火結(jié)合：50-70℃③引物延伸：70-75℃10(2)易錯(cuò)PCR反應(yīng)條件①M(fèi)g2+濃度較高，以穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基對。普通PCRMg2+濃度0.5-2.5mmol/L，易錯(cuò)PCR提高M(jìn)g2+濃度。②添加Mn2+

，以降低聚合酶對模版的特異性。③4種底物的濃度比改變，即采用濃度不平衡的各種底物，使堿基配對錯(cuò)誤出現(xiàn)頻率增加。易錯(cuò)PCR具體反應(yīng)條件要根據(jù)進(jìn)化目的、DNA聚合酶種類和模版情況等多次試驗(yàn)而確定。1112易錯(cuò)PCR示意圖13易錯(cuò)PCR,遺傳變化只發(fā)生在單一分子內(nèi)部,所以屬于無性進(jìn)化（asexualevolution）。采用易錯(cuò)PCR時(shí)，要控制好適當(dāng)?shù)耐蛔冾l率。突變頻率太低，難于篩選到理想的正突變體突變頻率太高，增加篩選工作量（大多突變?yōu)樨?fù)突變和中性突變）一般情況下,一個(gè)目的基因通過易錯(cuò)PCR引起的錯(cuò)配堿基數(shù)目控制在2-5個(gè)。通常采用連續(xù)易錯(cuò)PCR(SequentialerrorpronePCR)：將一次PCR擴(kuò)增得到的有益突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板,連續(xù)反復(fù)進(jìn)行隨機(jī)誘變。14Chen.K和Arnold在1993年采用易錯(cuò)PCR對該枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行了體外進(jìn)化研究。他們通過降低反應(yīng)體系中dATP的濃度,對編碼該酶從第49位氨基酸到C端的DNA片段進(jìn)行易錯(cuò)PCR,經(jīng)篩選得到的幾個(gè)突變株在高濃度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明顯提高,其中突變體PC3在60%的DMF中,酶活力是野生型的256倍。將PC3再進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的定向進(jìn)化,得到的突變體酶活力比PC3還要高3倍。15易錯(cuò)PCR特點(diǎn)：操作簡便，隨機(jī)突變豐富正突變概率低，突變基因文庫較大，篩選工作量大適合較小基因（＜800bp）的定向進(jìn)化16二、DNA重排技術(shù)DNA重排（DNAshuffling）技術(shù)又稱DNA改組技術(shù)，是從兩種以上的同源正突變基因出發(fā)，用酶切成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。

此方法又稱為有性PCR(SexualPCR),通過將親本基因群中的突變盡可能組合在一起,以導(dǎo)致更大的變異,最終獲得具有最佳突變組合1994年由Stemmer等人首次提出，使用該技術(shù)使β-內(nèi)酰胺酶定向進(jìn)化，催化效率提高32000倍。17DNAshuffling18DNA重組裝原理圖(DNAshuffling)1.DNaseI產(chǎn)生隨機(jī)片段；2.隨機(jī)片段變性；3.隨機(jī)片段復(fù)性；4.延伸反復(fù)重復(fù)2-4步后，可獲得全長DNA片段

19其基本操作過程:（1）靶基因經(jīng)隨機(jī)突變產(chǎn)生含不同突變類型的親本基因群,用DNaseI隨機(jī)切割;（2）得到的片段經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán),在該過程中,這些片段之間互為引物和模板進(jìn)行擴(kuò)增,直至獲得全長基因;（3）再加入基因的兩端引物進(jìn)行常規(guī)PCR,最終獲得發(fā)生改組的基因庫。20DNA重排技術(shù)特點(diǎn)正突變體概率高，進(jìn)化速度較快在獲得全長基因之前要除去DNaseI。DNA重排技術(shù)的改進(jìn)交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)隨機(jī)引物體外重組技術(shù)211、交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)交錯(cuò)延伸PCR

(StaggerextensionprocessPCR，StEP)是在PCR反應(yīng)中,將含不同點(diǎn)突變的模板（兩個(gè)或多個(gè)DNA片段）混合,將常規(guī)的退火和延伸合并為一步,并大大縮短其反應(yīng)時(shí)間（55℃，5s）,從而只能合成出非常短的新生鏈,經(jīng)變性的新生鏈再作為引物隨機(jī)地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸,此過程反復(fù)進(jìn)行直至獲得全長基因。結(jié)果會產(chǎn)生間隔的含不同模板序列的新生DNA分子。22在同一個(gè)反應(yīng)體系中以兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)的DNA片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，把PCR反應(yīng)中常規(guī)的退火和延伸合并為一步，并且大大縮短反應(yīng)時(shí)間（55℃，5s），在反應(yīng)過程中，引物先與一個(gè)模板結(jié)合，進(jìn)行延伸，隨之進(jìn)行多次變性和短時(shí)的退火—延伸反應(yīng)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)中，不同長度的延伸片段在變性時(shí)與原先的模板分開，退火時(shí)與另一個(gè)模板結(jié)合，再進(jìn)行延伸。通過在不同的模板上交替延伸，所合成的DNA片段中包含有不同模板上的信息，直到獲得全長的突變基因。23StEP過程1個(gè)引物2個(gè)模板退火結(jié)合延伸產(chǎn)生短片段短片段為引物與模板退火結(jié)合繼續(xù)延伸片段至全長的基因長度分離全長基因，加入外源引物擴(kuò)增全長基因。24252、隨機(jī)引物體外重組技術(shù)隨機(jī)引物體外重組技術(shù)（random-priminginvitrorecombination，RPR）采用單鏈DNA為模板，配合若干條隨機(jī)序列引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的DNA小片段，然后除去模板，這些DNA小片段互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增，通過堿基序列的重新排布而獲得全長突變基因。2627與常規(guī)DNA改組相比,RPR技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn):(1)可利用單鏈DNA為模板,故可直接用mRNA或cDNA

為親本進(jìn)行進(jìn)化。(2)在該方法中,隨機(jī)片段不是由親本基因切割獲得,故大大降低了親本DNA的制備量。(3)省去DNaseI

切割過程,更為簡單。(4)合成的隨機(jī)引物具有同樣長度,無序列傾向性。在理論上,PCR擴(kuò)增時(shí)模板上每個(gè)堿基都應(yīng)被復(fù)制或以相似的頻率發(fā)生突變。(5)隨機(jī)引發(fā)合成的DNA片段大小,不受DNA模板長度的限制。28三、基因家族重排技術(shù)基因家族重排技術(shù)（genefamilyshuffling）又稱基因家族改組技術(shù)，是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用酶（DNaseI）切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR擴(kuò)增，使DNA堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。29DNAshuffling與Familyshuffling：基本過程大致相同出發(fā)基因不同30當(dāng)以單一的酶分子基因進(jìn)行定向進(jìn)化時(shí),基因的多樣化起源于易錯(cuò)PCR

等反應(yīng)中產(chǎn)生的隨機(jī)突變,所以采用這種過程累積有益突變的速度比較慢。從自然界中存在的基因家族出發(fā),利用它們之間的同源序列進(jìn)行DNA改組。由于每一個(gè)天然酶的基因都經(jīng)過千百萬年的進(jìn)化,并且基因之間存在比較顯著的差異,所以獲得的重組基因庫充分體現(xiàn)了基因的多樣化，排除了不必要的突變，大大加速了基因的體外進(jìn)化速度。DNAshufflingFamilyshuffling31單鏈化限制性內(nèi)切酶消化DnaseI消化無外源引物PCR重組基因庫片段化同源基因常規(guī)PCR3種基因家族改組方法原理圖1.常規(guī)基因家族改組。2.單鏈DNA介導(dǎo)的基因家族改組。3.限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因家族改組3種基因家族改組方法獲得的突變基因多樣性比較

Kikuchi采用后2種改組方法，從兒茶酚2,3-雙加氧酶的2個(gè)同源基因出發(fā),對其進(jìn)行體外定向進(jìn)化的研究。最終篩選到的進(jìn)化酶在50℃的半衰期分別比兩種天然酶延長12和26倍。1007550250123產(chǎn)生的雜合基因百分比32第二節(jié)酶基因突變的定向選擇酶基因突變的定向選擇是在人工控制條件的特殊環(huán)境下，按照人們所設(shè)定的進(jìn)化方向?qū)ν蛔兓蜻M(jìn)行選擇，以獲得具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。突變基因基因載體重組DNA突變基因文庫目的基因進(jìn)化酶基因重組組裝篩選表達(dá)33一、突變基因文庫的構(gòu)建突變基因文庫的構(gòu)建是將各種不同的突變基因與載體重組，再轉(zhuǎn)入適宜的細(xì)胞或包裝成重組λ噬菌體的技術(shù)過程。構(gòu)建突變基因文庫是選擇獲得所需突變基因的重要步驟，必須注意基因文庫的包容性和完整性，以構(gòu)建豐富多樣的高質(zhì)量的突變基因文庫。構(gòu)建突變基因文庫的過程主要包括載體的選擇、基因重組、形成基因文庫等。34（一）構(gòu)建基因文庫的質(zhì)量要求構(gòu)建的突變基因文庫必須盡可能地把各種突變基因包含在其中，并且能夠完整地反映基因的結(jié)構(gòu)和功能信息。所以突變基因文庫不但必須具有包容性，還必須具有突變基因序列的完整性。351.文庫的包容性突變基因文庫的包容性是指所構(gòu)建的文庫必須盡可能地包含基因的任何一種可能的突變信息，包括正突變、負(fù)突變、和中性突變，以便進(jìn)行全面的篩選。要求構(gòu)建的文庫必須有足夠大的容量，通常一個(gè)包容性好的文庫應(yīng)具有106甚至更大的庫容量。362.文庫的完整性突變基因文庫的完整性是指文庫中包含的DNA片段必須盡可能完整地反映基因的結(jié)構(gòu)和功能信息，以便通過篩選得到的突變基因能夠通過表達(dá)獲得完整的具有催化功能的進(jìn)化酶。

37（二）構(gòu)建突變基因文庫的主要過程構(gòu)建突變基因文庫的過程主要包括：載體的選擇基因重組形成基因文庫等。381.載體的選擇突變基因文庫的構(gòu)建，要通過DNA連接酶的作用，將突變基因與適當(dāng)?shù)妮d體（vector）重組，所以首先要根據(jù)目的基因的特性、載體的特點(diǎn)和重組DNA的篩選方法等選擇適宜的載體。質(zhì)粒載體噬菌體DNA載體黏粒載體噬菌粒載體39（1）質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plasmid）是存在于微生物細(xì)胞內(nèi)染色體外的遺傳單位，是一種閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒載體是由天然質(zhì)粒經(jīng)過人工改造而成的一種常用的基因克隆載體。適用于構(gòu)建原核生物基因文庫、cDNA庫和次級克隆。質(zhì)粒載體特點(diǎn)有自主的復(fù)制起點(diǎn)兩種以上的易于檢測的選擇性標(biāo)記多種限制性內(nèi)切核酸酶的單一酶切位點(diǎn)適合小片段DNA的重組40(2686bp)41（2）噬菌體DNA載體由噬菌體DNA改造而成的具有自我復(fù)制能力的載體。最適用于構(gòu)建真核生物基因文庫和cDNA庫。4243（3）黏粒載體黏粒（cosmid）是一類人工構(gòu)建的含有λDNA黏端（cos序列）和質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒載體，又稱柯斯質(zhì)粒。黏粒載體包括質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、抗性標(biāo)記基因、多克隆位點(diǎn)和λDNA的cos位點(diǎn)，既可以轉(zhuǎn)化大腸桿菌并按質(zhì)粒復(fù)制的方式進(jìn)行復(fù)制，又可以承載40Kb左右的外源DNA片段。常被用來構(gòu)建高等生物基因文庫常見黏粒載體：pHC79、pJB8、c2RB、cosEMBL等444546（4）噬菌粒載體噬菌粒（phagemid）是一類人工構(gòu)建的有M13單鏈DNA的基因間隔區(qū)與質(zhì)粒載體結(jié)合而成的基因載體。含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體。它兼具絲狀噬菌體與質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)47特點(diǎn)：1.雙鏈DNA既穩(wěn)定又高產(chǎn)，具有常規(guī)質(zhì)粒的特征；2.免除了將外緣DNA片段從質(zhì)粒亞克隆于噬菌體載體這一繁瑣又費(fèi)時(shí)的步驟；3.由于載體足夠小，故可得到長達(dá)10kb的外源DNA區(qū)段的單鏈。常見載體：pUC118、pCU11948492.基因重組基因重組（generecombination）是在體外通過DNA連接酶的作用，將基因與載體DNA連接在一起形成重組DNA的技術(shù)過程。黏性末端連接平頭末端連接修飾末端連接等。50（1）黏端連接將載體DNA和目的基因用形成黏性末端(stickyends)的同一種限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行切割，形成黏性末端，按照1：1的比例混合，經(jīng)過退火處理，使載體DNA與外源DNA的黏性末端結(jié)合，形成雙鏈結(jié)合體；在T4DNA連接酶的作用下雙鏈結(jié)合體連接形成穩(wěn)定重組DNA分子。5152（2）平端連接有些限制性內(nèi)切酶（如HPaI，SmaI等）作用于DNA分子后，形成的末端是平端(bluntends)。具有平端的質(zhì)粒載體DNA和外源DNA分子，可以在T4DNA連接酶的作用下，形成重組DNA分子。重組效率比黏端連接低很多提高外源DNA和質(zhì)粒DNA濃度提高T4DNA連接酶濃度降低ATP濃度避免亞精胺等多胺物質(zhì)的存在5354（4）修飾末端連接當(dāng)載體DNA和外源DNA的末端不相匹配時(shí)，T4DNA連接酶無法進(jìn)行連接。所以在連接之前，必須對兩個(gè)末端或期中一個(gè)進(jìn)行修飾處理，使兩種DNA的末端互相匹配，以便于連接，形成重組DNA。主要的修飾方法是引進(jìn)附加末端。附加末端可以是單鏈DNA，也可以是雙鏈DNA,可以在一個(gè)末端附加，也可以在兩個(gè)末端都附加。55一端加接頭（adapterorlinker）56兩端加接頭57同聚加尾法分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。非酶切位點(diǎn)58銜接物(linker)連接合成linker(一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的平端雙鏈),用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。5960DNA接頭

(adapter)連接法adapter:一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter61Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-

GGCC--CCGG

-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-

GGCC-CCGG

GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接頭自我連接62631972年，斯坦福大學(xué)的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾

法

2.人工加尾形成“粘性末端”

DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。②加尾—堿基互補(bǔ)64④缺點(diǎn)：③優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。非酶切位點(diǎn)65用T4DNA連接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。（2）銜接物(linker)連接①

linker用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②

linker的作用66

67

68④缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點(diǎn)：69（3）DNA接頭

(adapter)連接法1978年康奈爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為人工粘性末端。①

adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。②

adapter的作用70Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接頭自我連接7172接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。③優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。④缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我連接735‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P

P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！

5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP處理-OHHO-743.組裝突變基因文庫突變文庫的組裝是將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞或包裝成有感染活性的重組噬菌體的過程。對于重組質(zhì)粒載體可以通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化等方法將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，形成突變基因文庫對于重組噬菌體DNA載體，需要用噬菌體外殼蛋白將重組DNA進(jìn)行包裝，成為有感染活性的重組噬菌體，而形成基因文庫。75大腸桿菌轉(zhuǎn)化（transformation)E.coli感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)制備0℃，0.1MCaCl2加入質(zhì)粒42℃熱激90s，立即冰浴富裕培養(yǎng)抗性篩選LB-抗生素76invitropackagingoflambdaphage77重組λ噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)78重組λ噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)79二、突變基因的篩選根據(jù)定向進(jìn)化的目的要求，在一定的環(huán)境條件下進(jìn)行篩選，從突變基因文庫中選取得到所需的突變基因。突變基因文庫質(zhì)粒載體噬菌體載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因篩選80（一）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定根據(jù)定向進(jìn)化的設(shè)定選擇環(huán)境在每一次“突變——篩選”的循環(huán)中加以調(diào)整選擇環(huán)境（1）提高酶的熱穩(wěn)定性：較高溫度下培養(yǎng)重組細(xì)胞，每次循環(huán)提高溫度。（2）提高β-內(nèi)酰胺酶的催化效率：一定濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素中培養(yǎng)，每次提高濃度81細(xì)菌誘發(fā)突變的因素50

0C培養(yǎng)突變體庫選擇壓力耐受型突變體一定濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素82（二）高通量篩選技術(shù)高通量篩選技術(shù)要求：通量大、效率高，在較短時(shí)間內(nèi)簡便的判斷出正突變基因，并易于排出那些無效的突變基因。常用高通量篩選方法平板篩選法熒光篩選法噬菌體表面展示法細(xì)胞表面展示法核糖體表面展示法83841、平板篩選法平板篩選方法是將含有隨機(jī)突變基因的重組細(xì)胞，涂布在平板培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)，依據(jù)重組菌細(xì)胞的表型鑒定出有效突變基因的篩選方法。特點(diǎn)：簡便、快速、直觀、容易控制和調(diào)整環(huán)境條件依據(jù)：重組細(xì)胞的表型細(xì)胞生長情況顏色變化情況透明圈情況85（1）依據(jù)細(xì)胞生長情況篩選突變基因熱穩(wěn)定性：溫度梯度和高溫環(huán)境抗生素耐受性：抗生素濃度梯度pH穩(wěn)定性：pH梯度極端環(huán)境：高鹽、低溫、高濃毒物質(zhì)86（2）依據(jù)顏色變化篩選突變基因反應(yīng)產(chǎn)物顯色藍(lán)白斑篩選（Bluewhitescreening）：lacZ’AmN2H片段COOH片段87（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因C端序列LacZ酶-galactosidaseBlue/whitescreeningorLacselection誘導(dǎo)物：IPTG底物：X-gal8889磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黃色硝基酚；90Homogenizedactivatedsludgesampleculturedon1/10-strengthLBplatesamendedwithCPQPandviewedwith(A)whitelightand(B)fluorescentlightrevealingcolonywithhalo(arrow1)andnohalo(arrow2).

91（3）根據(jù)透明圈情況篩選突變基因StarchagarAmylaseSpiritblueagarLipaseMethylenebluetributyrin

Lipase

Skimmilkagar

Caseinase

Nutrientgelatindeep

Gelatinase

DNaseagarmethylgreenDNase

92豆豉纖溶酶（douchi

fiberolyticenzyme，DFE）血纖維蛋白平板（bloodagar）豆豉纖溶酶安全性能好，溶栓能力強(qiáng)，而且無毒副作用，不引起內(nèi)出血，半衰期長。

932、熒光篩選法熒光篩選法是通過熒光產(chǎn)生與否以及熒光的強(qiáng)度情況進(jìn)行突變基因篩選的方法。熒光篩選法通常將具有熒光激發(fā)特性物質(zhì)的基因作為報(bào)告基因，與突變基因一起克隆到載體中，形成重組細(xì)胞，在突變基因表達(dá)的同時(shí)報(bào)告基因也進(jìn)行表達(dá)，由于報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物可以激發(fā)熒光，所以通過檢測熒光的產(chǎn)生情況，就可以或得能夠在重組細(xì)胞中表達(dá)的突變基因，而將不能表達(dá)的無效基因排除。94常見的報(bào)告基因綠色熒光蛋白(GFP)β-半乳糖苷酶(lacZ)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)熒光素酶(luc)堿性磷酸酪酶(SEAP)β-葡糖醛酸酶(GUS)等。95巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子熒光素酶熒光素酶(luc)96綠色熒光蛋白(GFP)該蛋白質(zhì)在藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出綠色螢光97Afusionof

greenfluorescentprotein

(GFP),

calmodulin,andM13

Upperpart:StructureofCa2+-saturatedGCaMP2monomer

Lowerpart:Structureofcalcium-freeGCaMP2.

98β-半乳糖甘酶基因（lacZ）ONPG：鄰硝基苯基-β-D-半乳糖苷，無色底物替代乳糖，ONP：鄰硝基酚，亮黃色的亮黃色無色無色420nm檢測99100珊瑚蟲熒光蛋白Anthozoanfluorescentproteins一種珊瑚蟲Dendronephthya

的雙色熒光蛋白，當(dāng)可見光中的藍(lán)光照射時(shí)，發(fā)出的光芒由綠色轉(zhuǎn)為紅色。101辣根過氧化物酶（HRP）基因與單加氧酶基因融合在一起作為報(bào)告基因，在有萘存在的條件下可以激發(fā)出熒光。1023、噬菌體表面展示法Phagesurfacedisplay噬菌體表面展示法是利用絲狀噬菌體的外膜結(jié)構(gòu)蛋白與某些特定的外源蛋白或多肽分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使目標(biāo)外源蛋白或多肽富集在噬菌體表面的一種分子展示技術(shù)。103(a)SchematicofM13phagewithphageDNAmodifiedtodisplayaproteinorpeptideasafusiontothecoatproteinpIII.(b)

RepresentationofM13phagewithnanoparticles(blackspheres)nucleatedontopIII(darkblue).(c)

Schematicofametal-orsemiconductor-bindingpeptideisdisplayedoncoatproteinpVIII104噬菌體展示庫建立過程重組：不同基因分別被插入噬菌體基因組中分離純化：純化噬菌體只是展示一個(gè)蛋白，多肽或者抗體。文庫建成：收集所有的噬菌體就構(gòu)成一個(gè)文庫將噬菌體文庫與靶蛋白相互作用，篩選能與靶蛋白相互作用的噬菌體105外源蛋白與噬菌體外膜結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)合方法一種是在構(gòu)建突變基因文庫時(shí)，通過基因重組技術(shù)，構(gòu)建外源基因與噬菌體外膜蛋白基因的融合基因，融合基因表達(dá)生成外源蛋白與噬菌體外膜蛋白的融合蛋白，再通過噬菌體外膜蛋白的錨定作用而展示在噬菌體表面。另一種方法是外源基因與噬菌體外膜蛋白基因分別與可以相互作用的介導(dǎo)蛋白的基因形成融合基因，表達(dá)出來的兩種融合蛋白可以通過介導(dǎo)蛋白的相互作用結(jié)合在一起，通過噬菌體外膜蛋白的錨定作用而展示在噬菌體表面。106pIIIForeignDNAMediatingproteingene107108109淘洗方法：（親和→洗脫→擴(kuò)增→親和）循環(huán)淘選（Panning)非篩選（Screening)Panning110111Typicalmoleculardisplayselectionprocessingasdemonstratedwiththephagedisplaymethod.1124、細(xì)胞表面展示法細(xì)胞表面展示法是通過可以錨定在細(xì)胞表面的特定蛋白質(zhì)與某些外源蛋白質(zhì)或多肽形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使這些外源蛋白或多肽富集在細(xì)胞表面的一種分子展示技術(shù)。酵母細(xì)胞表面展示法細(xì)菌表面展示法113（1）酵母表面展示法YeastSurfaceDisplay酵母細(xì)胞表面展示法是通過錨定在酵母細(xì)胞表面的特定蛋白質(zhì)（凝集素蛋白、絮凝素蛋白等）與某些外源蛋白或多肽形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使這些外源蛋白或多肽富集在酵母細(xì)胞表面的一種分子展示技術(shù)。目前已報(bào)道的酵母表面展示系統(tǒng)有三種,即目的蛋白分別與α凝集素、a凝集素或絮凝素融合后，展示于酵母細(xì)胞表面。114agα1Agα1酵母凝集素的作用aga2aga1Aga1Aga2SSMATα細(xì)胞中agα1基因編碼α-凝集素（α-agglutinin）Agα1。MATa細(xì)胞中aga1和aga2基因分別a-凝集素的兩個(gè)亞基Aga1、Aga2，二者通過2對二硫鍵連接。MATα細(xì)胞和MATa可以通過Agα1和Aga2的相互作用發(fā)生凝集作用（agglutination），在細(xì)胞交配中起到重要作用。α-cella-cell115酵母細(xì)胞表面展示表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)成A.載體（1）具有信號肽序列，使已經(jīng)表達(dá)的融合蛋白能夠被分泌至細(xì)胞外；（2）具有較強(qiáng)的定位結(jié)構(gòu)使融合蛋白固定于細(xì)胞表面而不能脫落；（3）與外源蛋白融合后，載體蛋白的定位特性和外源蛋白的生物活性不會改變；（4）在宿主菌株中能穩(wěn)定存在，不會被細(xì)胞壁膜之間和培養(yǎng)基中的蛋白酶水解。116B.外源表達(dá)蛋白異源靶蛋白根據(jù)特定的應(yīng)用來選擇，其性質(zhì)會影響表達(dá)效果，靶蛋白序列中帶有許多帶電氨基酸殘基或者是疏水性殘基時(shí)將會抑制融合蛋白的分泌，其活性域的空間結(jié)構(gòu)也會影響表達(dá)效果。117C.宿主菌株一個(gè)好的宿主細(xì)胞應(yīng)該無毒、容易培養(yǎng)，能和被展示的蛋白兼容共處且易于篩選。釀酒酵母一直被公認(rèn)為是安全的模式生物(GRAS)，由于細(xì)胞足夠大，可以用流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選和分離，非常適合作為展示表達(dá)的宿主。118①目的蛋白-α凝集素表面展示系統(tǒng)目的蛋白作為N端與α凝集素蛋白的C末端部分融合形成融合蛋白。α凝集素由Agα1基因編碼，在加工前具有650個(gè)氨基酸。

α凝集素Ｃ端有320個(gè)氨基酸殘基，含有糖基磷酸酰肌醇（GPI）錨定信號序列。119120②目的蛋白-a凝集素表面展示系統(tǒng)目的蛋白以C端與a凝集素Aga2p亞基的N端融合進(jìn)行表面展示。725個(gè)氨基酸殘基的Aga1p亞基通過β葡聚糖的共價(jià)連接而錨定在細(xì)胞壁上。69個(gè)氨基酸殘基的Aga2p亞基通過兩對二硫鍵與Aga1p亞基相連,外源蛋白結(jié)果結(jié)合在a凝集素Aga2p的C端活性部位而展示在酵母表面。121122123③目的蛋白-絮凝素表面展示系統(tǒng)目的蛋白作為N端與絮凝素蛋白的C末端部分融合形成融合蛋白。絮凝素（flocculin）是絮凝酵母表面的一種細(xì)胞壁蛋白，其C端含有GPI錨定附著信號系列，可以與細(xì)胞壁中的葡萄糖結(jié)合。124125FlolpC端GPI錨定系統(tǒng)FlolpN端絮凝結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)126（2）細(xì)菌細(xì)胞表面展示法BacterialCellSurfaceDispla把外源基因與細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)蛋白基因融合，使目的蛋白錨定于細(xì)胞表面并獲得活性表達(dá)的一種技術(shù)。革蘭氏陰性菌表面展示技術(shù)革蘭氏陽性菌表面展示技術(shù)127革蘭氏陰性菌表面展示技術(shù)革蘭氏陰性菌的外膜蛋白可以與細(xì)胞外膜結(jié)合外源基因與革蘭氏陰性菌外膜蛋白（LamB、OmpA、PhoE等）基因融合，融合基因表達(dá)的融合蛋白可以與細(xì)菌外膜結(jié)合，展示在細(xì)胞表面。128Gram(-)celldisplaysystems:S-layerprotein

OmpC

PhoA

OprF

OmpA

lipoprotein

IgAprotease

Pilin

Lpp–OmpA

INPFlagella129IceNucleationProtein(INP)outermembraneproteinC（OmpC）130periplasmextracellularoutermembraneLpp-OmpAsur