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細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（實驗篇）安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室2007年12月3日合肥實驗四Hep-2細(xì)胞的傳代培養(yǎng)一、原理體外培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于細(xì)胞密度過大,生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將影響細(xì)胞的繼續(xù)生長，此時需將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)可獲得大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù),同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實驗的必經(jīng)過程。細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中，細(xì)胞倍增3～6次。二、材料和試劑1、細(xì)胞：Hep-2細(xì)胞2、試劑：PBS、VTP、DMEM營養(yǎng)液（含10％小牛血清）3、儀器和器材：倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等

三、操作方法將長成單層的Hep-2細(xì)胞棄去原來的培養(yǎng)液，PBS洗2次。在瓶中加入少許消化液(以液面蓋住細(xì)胞為宜)，靜置3～5分鐘。肉眼觀察當(dāng)見到瓶底出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時終止消化。倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞相互之間不再連接成片，表明此時細(xì)胞消化適度。這時應(yīng)立即將消化液倒掉，加入適量新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細(xì)胞懸液。以1：2或1：3進(jìn)行分裝，標(biāo)記，置37℃培養(yǎng)。四、結(jié)果置于37℃培養(yǎng)的細(xì)胞，次日開始需逐日進(jìn)行觀察，主要觀察：（1）培養(yǎng)物是否被污染（2）細(xì)胞生長狀況（3）如細(xì)胞已生長，則要觀察細(xì)胞的形態(tài)特征Hep-2細(xì)胞×100五、注意事項嚴(yán)格的無菌操作適度消化每天觀察細(xì)胞形態(tài)，生長致

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