-藥用植物原生質(zhì)體培養(yǎng)

第五章原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交教學內(nèi)容1.掌握原生質(zhì)體的概念，了解原生質(zhì)體培養(yǎng)的開展史2.掌握原生質(zhì)體的別離途徑和純化方法；掌握原生質(zhì)體活力測定方法；3.掌握原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法、原生質(zhì)體融合方法、雜種細胞篩選及雜種植株鑒定方法。原生質(zhì)體〔Protoplast〕概述原生質(zhì)體概念：去掉細胞壁的由質(zhì)膜包裹、具有生活力的裸露細胞。

1880年，Hanstein首次起用原生質(zhì)體(protoplast)一詞。

1960年，Cocking首次應(yīng)用酶法制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功。

1971年，Takebeetal.首次得到煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株。

1985年，F(xiàn)ujimuraetal.第一例禾谷類作物－水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。

1986年，Spangenbergetal.單個原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株在甘藍型油菜上獲得成功。原生質(zhì)體培養(yǎng)開展簡史據(jù)統(tǒng)計，目前全世界已有49個科，160個屬的367種植物經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到了再生植株。其中成功報道最多的是茄科，其次是豆科、禾本科、菊科、十字花科、傘形科等。我國的開展概況：原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株:煙草、胡蘿卜、矮牽牛原生質(zhì)體融合：小麥×蠶豆、小麥×玉米、水稻×豌豆第一節(jié)、原生質(zhì)體別離及純化1.原生質(zhì)體別離雙子葉外植體愈傷組織多數(shù)植物別離原生質(zhì)體的經(jīng)典材料－葉肉細胞溫室生長的植物，葉片干凈幼嫩，是較好的材料來源。無菌苗的葉片更具優(yōu)勢。上胚軸和子葉1.1材料來源禾本科植物：

愈傷組織或懸浮細胞。材料預處理用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。

☆龍膽試管苗的葉片用4oC處理較好。

☆甘蔗植株必須先在黑暗下培養(yǎng)12h后別離的原生質(zhì)體才能分裂。

☆馬鈴薯試管苗葉片需在黑暗下處理48h后別離原生質(zhì)體，才能獲得高產(chǎn)量。別離方法機械別離法酶法別離法機械別離法〔Mechanicalisolation〕機械別離法：先將細胞放在高滲糖溶液中預處理，待細胞發(fā)生輕微質(zhì)壁別離，原生質(zhì)體收縮成球形后，再用機械法磨碎組織，從傷口處可釋放出完整的原生質(zhì)體。機械別離法的優(yōu)缺點優(yōu)點：能排除酶對原生質(zhì)體的破壞作用缺點：局限性大，只限于能夠廣泛發(fā)生質(zhì)壁別離的組織，不能從成熟的和分生細胞別離原生質(zhì)體；原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；得到的原生質(zhì)體有限；方法繁瑣費力。酶法別離〔Enzymaticisolation〕酶法別離：指將材料放入能降解細胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時間，在酶液的作用下，細胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。酶別離法使用的酶種類：纖維素酶類、果膠酶類、半纖維素酶類、崩潰酶、蝸牛酶果膠酶：是從根霉、黑曲霉中提取的,使細胞間的果膠質(zhì)降解,把細胞從組織內(nèi)別離出來。纖維素酶：是從綠色木霉中提取的，降解細胞壁中纖維素的酶。酶來源生產(chǎn)廠家果膠酶類MacerozymeR-10根霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo.PectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纖維素酶RhozymeHP-150黑曲霉RohmandHassCo.,Rhiladelphia,UAS酶來源生產(chǎn)廠家纖維素酶類OnozukaR-10綠色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin綠色木霉Calbiochem.,San

Diego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan酶液的配制滲透壓穩(wěn)定劑酶的配比及濃度酶解液的組成及濃度酶的混合液纖維素酶〔1%-2%濃度〕、果膠酶〔%-0.5%濃度〕等。滲透穩(wěn)定劑促進酶解，保持原生質(zhì)體的完整性。甘露醇、山梨醇、葡萄糖等，適宜的濃度為450-800mmol/L。鹽類增加膜的透性〔氯化鈣、氯化鎂〕。酶組合、濃度材料纖維素酶半纖維素酶崩潰酶果膠酶離析酶蝸牛酶研究者煙草葉片禾谷類葉片油菜花粉馬鈴薯子葉馬鈴薯花粉1.02.01.01.01.00.51.00.1~0.20.50.51.0UchimiyaScott李仕瓊戴朝曦王蒂幾種草本植物原生質(zhì)體別離使用的酶種類及濃度(%)材料纖維素酶半纖維素酶崩潰酶果膠酶離析酶研究者枸杞愈傷組織檀香幼葉檀香愈傷組織榆幼葉山毛櫸幼葉胡楊懸浮細胞0.52.01.00.1~0.21.00.50.50.50.20.50.050.50.50.01~0.030.11.00.20.50.5孫勇如等LakshmiLakshmiDorinAhuja諸葛強幾種木本植物原生質(zhì)體別離使用的酶種類及濃度(%)酶解法別離原生質(zhì)體兩步別離法用果膠酶離析植物組織，收集細胞，經(jīng)洗滌后用纖維素酶解離細胞壁，然后獲得原生質(zhì)體。酶解法別離原生質(zhì)體一步別離法一定量的纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對材料進行一次性處理。原生質(zhì)體別離(一步別離)過程圖示〔以葉片為例〕過濾、離心加果膠酶和纖維素酶原生質(zhì)體的別離步驟〔一〕取材〔葉肉細胞〕充分展開的嫩葉。洗滌、消毒、無菌水沖洗。對禾本科植物葉片消毒時，使用芐烷銨〔Zephiran〕〔0.1%〕-酒精〔10%〕溶液漂洗5分鐘效果最好?！捕趁附獠牧稀旱粝卤砥ぁ?修剪成2cm見方小塊→置于6cm直徑培養(yǎng)皿中(下外表朝下0.5g)→加2ml酶解液→置于25-27℃下保持3-4小時左右→輕輕震蕩→原生質(zhì)體釋出。酶解法的優(yōu)點〔1〕能夠容易地大量地得到原生質(zhì)體〔2〕條件溫和，完整性好，有活力?！?〕幾乎可以從任何組織〔只要細胞還沒有木質(zhì)化〕別離出原生質(zhì)體。現(xiàn)為最常用的進行原生質(zhì)體別離的方法。影響酶活性和酶解效果的因素PH值：之間溫度：植物所需溫度為25-30℃時間：30分鐘-20小時用量：1g鮮組織用10ml酶解液的效果很好。2.原生質(zhì)體純化與活力測定原生質(zhì)體純化酶解后的混合物中將含有完整的原生質(zhì)體、亞細胞碎屑〔葉綠體、維管成分〕、未被消化的細胞等，因而必須將這些雜質(zhì)除去。初步篩選：利用50-70μm孔徑的鎳絲網(wǎng)過濾混合物，收集濾出液，做進一步的純化。原生質(zhì)體純化方法

離心沉淀法

漂浮法

離心沉淀法原理：原生質(zhì)體的比重大于溶液，離心后原生質(zhì)體沉于底部。步驟：原生質(zhì)體溶液用400目網(wǎng)篩過濾。離心〔500-1000r/min，離心5-6min〕。吸去上清液，洗滌液重新懸浮，再離心沉淀。如此2-3次。用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗1次，收集原生質(zhì)體。離心沉淀法優(yōu)點：純化原生質(zhì)體操作比較簡單。缺點：由于原生質(zhì)體沉積于試管底部，造成相互擠壓，常引起原生質(zhì)體的破碎。漂浮法原理：應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液〔如蔗糖濃度21%〕使原生質(zhì)體漂浮在液體的外表。步驟：400目網(wǎng)篩過濾。離心。吸取上層液，洗滌液重懸，離心沉淀。重復2－3次。收集溶液外表原生質(zhì)體，用培養(yǎng)液洗1次。葉肉原生質(zhì)體別離純化〔漂浮法〕優(yōu)點：可以減少別離的原生質(zhì)體因離心被組織碎片撞擊而破損情況的發(fā)生。所用藥品簡單，本錢低。缺點及補救措施： 對離心力要求比較嚴格，掌握不好，原生質(zhì)體那么不易漂浮?？刹捎貌煌瑵舛群筒煌x心速度分次漂浮的方法。漂浮法的優(yōu)缺點純化后的葉肉原生質(zhì)體原生質(zhì)體活力測定形態(tài)識別法形態(tài)上完整，呈圓形，含有飽滿的細胞質(zhì)，顏色鮮艷的即為存活的原生質(zhì)體。染色識別法0.1%酚番紅或伊凡藍染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。雙醋酸鹽熒光素〔FDA，0.01%〕染色法：在熒光顯微鏡下有熒光的即為有活性的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體活力測定第二節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)1.培養(yǎng)基

碳源：葡萄糖氮源：谷氨酰胺生長物質(zhì)：生長素與細胞分裂素鈣源：CaCl2可增強穩(wěn)定性，提高分裂頻率，明顯改變細胞質(zhì)內(nèi)外的離子交換。滲透壓：高滲溶液，通常的滲透劑是甘露醇和山梨醇，調(diào)節(jié)滲透壓。

pH：～KM-8p培養(yǎng)基2.培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)原生質(zhì)體懸浮液1mm厚液體培養(yǎng)基105個/ml液體淺層培養(yǎng)的優(yōu)缺點：優(yōu)點：吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力強，表現(xiàn)出較強的細胞分裂能力；且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。缺點：分布不均勻，發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響生長和發(fā)育；難以跟蹤觀察某一個細胞的發(fā)育情況。平板培養(yǎng)原生質(zhì)體純化、離心、稀釋后，再與1.4%瓊脂或瓊脂糖〔37C左右〕等體積混合成0.7%，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。優(yōu)點：原生質(zhì)體處于固定位置，有利于對單個原生質(zhì)體的細胞壁再生及細胞團形成的全過程進行定點觀察缺點：通氣狀況不良，第一次細胞分裂時間會推遲2d左右。平板培養(yǎng)的優(yōu)缺點：雙層培養(yǎng)法〔固、液培養(yǎng)〕

培養(yǎng)皿底部鋪一層0.7%瓊脂糖的固體培養(yǎng)基，在其上進行原生質(zhì)體淺層培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基優(yōu)點：固相培養(yǎng)基可以補充液相培養(yǎng)基的營養(yǎng)；固相中如果參加活性炭，可吸收培養(yǎng)物釋放的有毒物質(zhì)。缺點：不易觀察細胞的發(fā)育過程。雙層培養(yǎng)法〔固、液培養(yǎng)〕的優(yōu)缺點X-射線殺死某種植物細胞中的核，但細胞可正常代謝，與0.7%瓊脂混合，在培養(yǎng)皿中鋪成平板，作為飼養(yǎng)層〔固體〕，再將要培養(yǎng)的生活力正常的原生質(zhì)體與0.7%瓊脂混合〔液體〕，培養(yǎng)于飼養(yǎng)層上。飼養(yǎng)層培養(yǎng)〔看護培養(yǎng)〕微懸滴法培養(yǎng)

方法：吸取原生質(zhì)體的懸浮液，滴于6cm直徑的培養(yǎng)皿的蓋上，液滴大小20-50μl左右，懸滴培養(yǎng)。原生質(zhì)體在液滴的中央生長。為了防止培養(yǎng)基迅速蒸發(fā)，可以在培養(yǎng)基的底皿里加液體培養(yǎng)基保濕。3.培養(yǎng)條件KM-8p培養(yǎng)基，25℃－27℃，最初兩周暗培養(yǎng)〔壁的形成和細胞再生〕；分化時補充光照培養(yǎng)〔光照16h/d，注意KM-8p在強光下對植物有毒〕最初幾天經(jīng)常搖動，以助透氣。原生質(zhì)體再生過程原生質(zhì)體完整細胞〔有細胞壁〕細胞分裂和愈傷組織或胚狀體形成植株再生第一次分裂第二次分裂第三次分裂多細胞團原生質(zhì)體再生細胞壁后的分裂肉眼可見細胞團愈傷組織器官發(fā)生途徑胚胎發(fā)生途徑植株植株再生途徑原生質(zhì)體融合：也叫做體細胞雜交，即用別離出來的不同親本的原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互融合成一體，形成雜種細胞，并進一步發(fā)育成雜種植株的技術(shù)。第三節(jié)原生質(zhì)體融合1.原生質(zhì)體融合的意義克服雜交不親合克服生殖器官敗育對品種的改進，培育新品種番茄+馬鈴薯白菜—甘藍原生質(zhì)體融合甘薯原生質(zhì)體融合植株去掉細胞壁原生質(zhì)體融合2.原生質(zhì)體融合方法

無機鹽誘導融合電融合技術(shù)無機鹽誘導融合：NaNO3法

1972年：Carlson用此方法誘導原生質(zhì)體融合獲得首例雜種植株－－粉藍煙草和朗氏煙草體細胞雜種。

NaNO3的作用：中和原生質(zhì)膜的負電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起。此方法誘導頻率不高。電融合技術(shù)Senda1979年首先用此方法實現(xiàn)原生質(zhì)體融合細胞融合儀

電融合法原理交流電場使原生質(zhì)體外表電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠。+-負極正極+-+-+-+-+-+-+-+-

施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-3.雜種細胞篩選與鑒定

融合后的混合產(chǎn)物中有同核體、異核體，應(yīng)加以選擇，篩選出雜種細胞。胞質(zhì)雜種體細胞雜種AB射線照射B射線照射A異核體3.雜種細胞篩選與鑒定互補選擇法

雙熒光標記選擇法雜種細胞的篩選方法

互補法篩選

利用2個親本對培養(yǎng)基成分、抗代謝物、或溫度等的敏感性存在著天然的互補性進行選擇叫互補法選擇?！?〕激素自養(yǎng)型篩選粉藍煙草和郎氏煙草的野生型葉肉細胞原生質(zhì)體是激素異養(yǎng)型細胞，且原生質(zhì)體不分裂；雜種細胞是激素自養(yǎng)型細胞，且在沒有激素的培養(yǎng)基上可以旺盛分裂。使融合產(chǎn)物在不含激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能夠產(chǎn)生細胞團的就是融合的原生質(zhì)體。兩步法激素自養(yǎng)型篩選〔2〕營養(yǎng)缺陷型互補篩選硝酸復原酶的蛋白突變體和輔因子突變體，突變體不能利用硝態(tài)氮，只能利用銨態(tài)氮。兩者的突變位點不同，原