色氨酸(trp)操縱子

色氨酸（trp）操縱子

lac

和ara操縱子是編碼分解代謝途徑酶系的操縱子，負(fù)責(zé)碳源（例如乳糖和阿拉伯糖等）的分解利用，這些操縱子的表達(dá)受相應(yīng)碳源的誘導(dǎo)。在細(xì)菌中還有負(fù)責(zé)一些物質(zhì)合成代謝的操縱子，例如色氨酸操縱子（tryptophanoperon,trpoperon）就是負(fù)責(zé)色氨酸合成的操縱子。trp操縱子是由一個啟動子和一個操縱基因區(qū)組成，該操縱基因區(qū)控制一個編碼色氨酸生物合成需要的5種蛋白的多順反子mRNA的表達(dá)。

由于trp體系參與生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的調(diào)控。色氨酸的合成主要分5步完成，有7個基因參與整個合成過程。trpE和trpG編碼鄰氨基苯甲酸合酶，trpD編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，trpF編碼異構(gòu)酶，trpC編碼吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB則分別編碼色氨酸合酶的α和β亞基。

trpE基因是第一個被翻譯的基因，和trpE緊鄰的是啟動子區(qū)和操縱區(qū)。另外，前導(dǎo)區(qū)和弱化子區(qū)分別定名為trpL和trpa（不是trpA）。

trp操縱子中產(chǎn)生阻遏物的基因是trpR，該基因距trp基因簇很遠(yuǎn)。后者位于大腸桿菌染色體圖上25分鐘處，而前者則位于90分鐘處。在位于65分鐘處還有一個trpS（色氨酸t(yī)RNA合成酶），它與攜帶有色氨酸的tRNATrp共同參與trp操縱子的調(diào)控作用。弱化子

在trpmRNA5'端trpE基因的起始密碼前有一個長162bp的mRNA片段被稱為前導(dǎo)區(qū)，其中123～150位堿基序列如果缺失，trp基因表達(dá)可提高6-10倍，而且無論是在阻遏細(xì)胞內(nèi)還是在永久性突變的細(xì)胞內(nèi)都是這樣。當(dāng)mRNA合成起始以后，除非培養(yǎng)基中完全沒有色氨酸，轉(zhuǎn)錄總是在這個區(qū)域終止，產(chǎn)生一個僅有140個核苷酸的RNA分子，終止trp基因轉(zhuǎn)錄，這就是123～150區(qū)序列缺失會提高trp基因表達(dá)的原因。因?yàn)檗D(zhuǎn)錄終止發(fā)生在這一區(qū)域，并且這種終止是被調(diào)節(jié)的，這個區(qū)域就被稱為弱化子。

研究引起終止的mRNA堿基序列，發(fā)現(xiàn)該區(qū)mRNA通過自我配對可以形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，有典型的終止子特點(diǎn)。前導(dǎo)肽實(shí)驗(yàn)表明衰減作用需要負(fù)載tRNATrp參與，這意味著前導(dǎo)序列的某些部分被翻譯了。分析前導(dǎo)序列發(fā)現(xiàn)，它包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA；如果翻譯起始于AUG，應(yīng)該產(chǎn)生一個含有14個氨基酸的多肽。這個假設(shè)的多肽（還未實(shí)際觀察到）被稱為前導(dǎo)肽。

前導(dǎo)序列具有一個非常有意義的特點(diǎn)，在其第10和第11位上有相鄰的兩個色氨酸密碼子。這一點(diǎn)很重要，因?yàn)榻M氨酸操縱子中，也具有弱化子，也具有一個類似的能編碼前導(dǎo)肽的堿基序列，此序列中含有7個相鄰的組氨酸密碼子。苯丙氨酸操縱子中同樣存在弱化子結(jié)構(gòu)，其前導(dǎo)序列中也有7個苯丙氨酸密碼子。這些密碼子參與了trp及其他操縱子中的轉(zhuǎn)錄弱化機(jī)制。mRNA前導(dǎo)區(qū)的序列分析

trp前導(dǎo)區(qū)的堿基序列已經(jīng)全部測定，引人注目的是其中4個分別以1、2、3和4表示的片段能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對（圖6-22），有時以1-2和3-4配對，有時只以2-3方式互補(bǔ)配對。RNaseT1降解實(shí)驗(yàn)（此酶不能水解配對的RNA）表明，純化的trp前導(dǎo)序列中確有1-2和3-4的配對方式，由此定位的3-4配對區(qū)正好位于終止密碼子的識別區(qū)，當(dāng)這個區(qū)域發(fā)生破壞自我配對的堿基突變時有利于轉(zhuǎn)錄的繼續(xù)進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄弱化作用

轉(zhuǎn)錄的弱化理論認(rèn)為mRNA轉(zhuǎn)錄的終止是通過前導(dǎo)肽基因的翻譯來調(diào)節(jié)的。因?yàn)樵谇皩?dǎo)肽基因中有兩個相鄰的色氨酸密碼子，所以這個前導(dǎo)肽的翻譯必定對tRNATrp的濃度敏感。當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸的濃度很低時，負(fù)載有色氨酸的tRNATrp也就少，這樣翻譯通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度就會很慢，當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時，核糖體才進(jìn)行到1區(qū)（或停留在兩個相鄰的trp密碼子處），這時的前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是2-3配對，不形成3-4配對的終止結(jié)構(gòu)，所以轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進(jìn)行，直到將trp操縱子中的結(jié)構(gòu)基因全部轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸濃度高時，核糖體可順利通過兩個相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前，核糖體就到達(dá)2區(qū)，這樣使2-3不能配對，3-4區(qū)可以自由配對形成莖-環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止，trp操縱子中的結(jié)構(gòu)基因被關(guān)閉而不再合成色氨酸（圖6-24）。所以，弱化子對RNA聚合酶的影響依賴于前導(dǎo)肽翻譯中核糖體所處的位置。ThetrpoperonisnegativelyregulatedbytheTrprepressorTrprepressorbindsitstargetDNAsequenceonlywhenititselfisboundbyitsco-repressor,tryptophan.Thetrpoperatorisapalindromic

DNAsequencetrp操縱子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是通過Trp阻遏物實(shí)現(xiàn)的，它結(jié)合于trp操縱基因序列，但Trp阻遏物的DNA結(jié)合活性直接受色氨酸調(diào)控，色氨酸結(jié)合Trp阻遏物，并起著一個效應(yīng)分子的作用（也稱之輔阻遏物）。在有高濃度色氨酸存在時，Trp阻遏物-色氨酸復(fù)合物形成一個同源二聚體，并且緊密結(jié)合于trp操縱基因序列，因此可以阻止轉(zhuǎn)錄。然而當(dāng)色氨酸水平低時，缺少色氨酸的Trp阻遏物以一種非活性形式存在，不能結(jié)合DNA。在這樣的條件下，trp操縱子被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，同時色氨酸生物合成途徑被激活。

trp操縱子的另一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控是稱之衰減作用（attenuation）的調(diào)控機(jī)制，這是一種將翻譯與轉(zhuǎn)錄聯(lián)系在一起的新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控形式。細(xì)胞內(nèi)Trp-tRNATrp濃度決定核糖體是否停留在trpmRNA中的前導(dǎo)序列內(nèi)的兩個連續(xù)的色氨酸密碼子處。當(dāng)色氨酸水平高和Trp-tRNATrp可利用時，起轉(zhuǎn)錄終止作用的發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)（由區(qū)3和區(qū)4之間）形成，RNA聚合酶剛好在一個聚尿嘧啶的下游處脫離DNA模板，轉(zhuǎn)錄終止。當(dāng)由于細(xì)胞內(nèi)色氨酸有限，Trp-tRNATrp水平低時，核糖體就停留在RNA中連續(xù)的一對色氨酸密碼子處。核糖體這一瞬間的停留給出時間使得一種替換的發(fā)卡結(jié)構(gòu)在新的RNA中（由區(qū)2和區(qū)3之間）形成，是一種抗終止的RNA結(jié)構(gòu)，它破壞了轉(zhuǎn)錄終止信號，使得RNA聚合酶能夠繼續(xù)沿著DNA模板滑動完成轉(zhuǎn)錄。

Thetrp

operonP=promoterT=terminatorO=operatortrpRtrpAPOPTTPolycistronic

mRNA(encodes5proteins)mRNATrpR(repressor)5separateproteinsthatweresynthesizedfromonemRNAtrpBtrpCtrpDtrpEAttenuatorTrpRAttenuationinthetrp

operonEffectivelyaddsafinetuningtotheregulationofthetrp

operon.Severalkeypoints:Transcription&translationaretightlycoupledinbacteria(attenuationrequiresthis).SynthesisofaleadersequencerichinTrpinfluenceswhethertranscriptionofthetrp

operoniscomplete.If[Trp]isadequatetranscriptionisterminatedbeforethetrp

operon.If[Trp]isinadequatetranscriptioniscompleted.TerminationoftranscriptionisdeterminedbyleadermRNAsequence.Attenuation–atranscriptionalformofcontrol

mRNAleadersequenceAttenuator110140trpELeaderpolypeptide14aawith2Trp

aa1162TypicalstemloopofTerminationsiteAttenuation12344231mRNATrp

codonsmRNAsectionsbasepairswith2basepairswith4ONLY3+4generatetheterminationsiteAttenuation–Inadequate[Trp]1234mRNATrp

codons2314Ribosomestalls

duetolow[Trp]Thislargestemloopof2+3doesNOTactasaterminator.Transcriptioncontinues!!RNApolymeraseAttenuation–Adequate[Trp]1234431RibosomemovesRapidlyalongmRNAmRNAsectionsbasepairswith4toformaterminationsite,suchthatRNApolymeraseprematurelyfallsoffthemRNAandabortsfurthertranscription.mRNAAttenuationworksbyhavetheRNApolymerasestop(terminate)beforethetranscriptionofthestructuralgenes,butAFTERithasalreadystartedtomakeanRNA.ThekeyistheregionoftheoperoncalledtrpL(seethefiguresabove).Thetrp

operonofE.coliIntryptophan-poormediumIntryptophan-richmediumOperonSummary

Wehaveconsideredindetailthreeoperons:thelacoperon,thearaoperon,andthetrpoperon.Thefirsttwoareoperonsconcernedwiththecontrolofcatabolicprocesses(utilizationofenergysubstrates)whilethethirdisconcernedwithanabolicprocesses(synthesisofamoleculethecellneeds).Allthreesharenegativecontrolfeatures,usingrepressorproteinsbindingtooperatorstoplacetheoperoninthe"off"state.Thefirsttwohavepositivecontrolfeaturesthatincreasetranscriptioninresponsetolowglucose(CAP-cAMPbindingtotheCAPsite).Thisisnotthecaseforthetryptophanoperon.Thetryptophanoperon,however,hastheadditionalnegativecontrolfeatureofattenuation.Thesefeaturesaresummarizedinthefollowingtable:consensusTATA(Pribnow)boxE.coliPromotersAllostericEffectorsBindingcanalsoberequiredforbindingofrepressor(e.g.Trp)orcanblockanactivator.GenomicOrganizationoftheTrpOperon

TheTrpOperon

Notethattheorderofthegenesfollowstheorderofthebiosyntheticpathway!!ControlofGeneExpressionintheTrpOperonTheenzymecatalyzingthefirststepinthepathwayisinhibitedbyTrp(feedbackcontrol).InthepresenceofTrp,arepressorproteinbindstoanoperatorupstreamoftheTrpoperonandshutsofftranscriptionAttenuation.Thereisa160basepairregionintheTrp

mRNAthatcausestranscriptiontoterminateprematurelyifTrpispresent.FeedbackControl

TranscriptionalControlAttenuationControlAttenuationControlHighTrpLevels

Ribosomeproceeds

Loop3/4forms

TranscriptionterminatesLowTrpLevels

Ribosomestalls

Loop2/3forms

TranscriptioncontinuesTrpOperonControlledbyAttenuationtrpRP

O

1234

trpEtrpDtrpCtrpBtrpAattenuatorLeaderattenuationcanformundercertainconditionsbase-pairingcanoccurbetween1-22-33-4Attenuation58HighlevelsofTryptophaninCelltranscription&translationoccursimultaneouslyinProkaryotesleadertranscript(1)has2trp

codons(UGGUGG)ribosomesmovesfastalongtranscriptstem-loop3-4forms,polyUsafterearlyterminationoftranscription,

translationstops

(onlyleaderpeptideforms

-hasnofunction)59LowLevelsofTryptophaninCellribosomestallsatUGGUGGinleadertranscript(1)stem-loop2-3forms,nopolyUaftertranscriptioncontinues60LowLevelsofotherAminoAcidsribosomestallswayearlystem-loops1-2&3-4form,polyUafterearlyterminationoftranscription61TheTrpOperon:

WhenTryptophanIsPresentSTOPRighttherePolymeraseTrpTrpRepressorRepressorRepressorPromo.trpDtrpBLead.OperatortrpAtrpCtrpEAten.RNAPol.FoiledAgain!Repressor

mRNAHeyman,I’mconstitutive3’5’5’3’TranscriptionAndTran