南華大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)與放射衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心

南華大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)與放射衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心彗星實(shí)驗(yàn)

教學(xué)對象：高等醫(yī)學(xué)院校預(yù)防醫(yī)學(xué)、衛(wèi)生檢驗(yàn)專業(yè)學(xué)生實(shí)驗(yàn)課時(shí)：7學(xué)時(shí)課程類型：專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課課程要求：必修每組人數(shù)：4人

通過本次實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)和掌握單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)測定方法。(一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求(二)原理

采用堿性凝膠電泳技術(shù)，可顯示堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)和明顯斷裂，用溴化乙錠(EB)染色，在熒光顯微鏡下即可觀察。受損細(xì)胞在電泳時(shí)，其DNA從核中向陽極伸展形成一個(gè)亮的熒光頭部和后部，形似彗星，又名彗星試驗(yàn)。

DNA受損越嚴(yán)重，含斷裂片段越多，在彗星尾中出現(xiàn)的DNA就越多。尾中DNA的百分含量和尾長是DNA斷裂的重要定量參數(shù)。(三)器材與試劑1．器材

熒光顯微鏡電泳儀與電泳槽2．試劑

正常熔點(diǎn)瓊脂糖(MNA)、低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA)、二甲亞砜、NaCI、NaOH、Na2-EDTA、Tris、溴化乙錠(EB)、TritonX-100、肌氨酸鈉等3.溶液配制3.1細(xì)胞消化液(每1000ml)：貯備液：2.5mol／LNaCl146．1g，100mmol／LEDTA37.2g，10mmol／LTris1.2g(用約12gNaOH調(diào)至pH為10)，1％肌氨酸鈉10g，用去離子水定容至890ml。過濾除菌，室溫保存。應(yīng)用液：加新配1％TritonX—100和10％DMSO。在應(yīng)用前冷藏30～60min。3.2電泳緩沖液3.2.1貯備液:①10mol/LNaOH(200g／500ml去離子水)(2周內(nèi)用)；②200mmol／LEDTA(14.89g/200ml去離子水，pH=10)室溫保存。3.2.2電泳緩沖液應(yīng)用液

10mol/LNaOH30.0ml，200mmol/LEDTA5.0ml，定容至1000ml，混勻。電泳前新鮮配制。3.3中和緩沖液(0.4mol/LTris)：

Tris48.5g，去離子水定容至1000ml，>10mol/LHCl調(diào)pH至7.5。室溫貯存。3.4溴化乙錠(EB)染色液10貯備液（20g/ml)：溴化乙錠lmg，去離子水50ml，室溫貯存。臨用時(shí)將貯備液稀釋10倍。EB為誘變劑，小心操作。(四)操作步驟試驗(yàn)流程：受試物處理細(xì)胞→制片→裂解細(xì)胞→DNA解旋→電泳→中和、染色→EB染色→鏡檢、圖像分析。1.單細(xì)胞懸液的制備

(1)全血將5l全血與75lLMA相混合。按后述步驟進(jìn)行試驗(yàn)。

(2)骨髓

用lml含20mmol／LEDTA的冷HBSS沖洗小鼠股骨骨髓于微量離心管中。取沖洗液5l與75ILMA混合，按后述步驟進(jìn)行試驗(yàn)。(3)分離淋巴細(xì)胞在微量離心管中，將20l全血與lmlRPMl1640混合。在血／培養(yǎng)基混合物下加1001Ficol，在2000g離心3min。棄去100l介質(zhì)底層和Ficol頂層。加1ml培養(yǎng)基混合，離心3min以使淋巴細(xì)胞沉積。棄去上清液，重新加入75mlLMA混懸沉積的淋巴細(xì)胞，按后述步驟進(jìn)行試驗(yàn)。

(4)固體組織取一小塊組織，放入1～2ml含20mmol／LEDTA的冷HBSS中。切碎，靜置數(shù)分鐘。取5～10／l細(xì)胞懸液與75lLMA混合，按后述步驟進(jìn)行試驗(yàn)。與75lLMA混合的細(xì)胞懸液的量應(yīng)小于10l，而每玻片最適細(xì)胞數(shù)約為10000個(gè)細(xì)胞。(5)體外組織培養(yǎng)單層培養(yǎng)：用特孚隆刮片刮(scrape)少許細(xì)胞到細(xì)胞培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基中，使之含有大約110６細(xì)胞／ml。取5l細(xì)胞懸液加入75lLMA中。按后述步驟進(jìn)行試驗(yàn)。懸浮培養(yǎng)：取約10000個(gè)細(xì)胞(應(yīng)少于10l)到75lLMA中混合。按后述步驟進(jìn)行試驗(yàn)。2．試驗(yàn)分組與染毒體內(nèi)試驗(yàn)，至少應(yīng)設(shè)3個(gè)劑量組、1個(gè)陽性對照組和1個(gè)陰性對照組，每組至少4只動(dòng)物，人體取樣應(yīng)設(shè)2個(gè)平行樣。體外試驗(yàn)，至少應(yīng)設(shè)3個(gè)劑量組、1個(gè)陽性對照組和1個(gè)陰性對照組，每組至少2個(gè)平行皿。

3．制片

(1)分別取125mgLMA和NMA溶于25mlPBS，可稍加熱使其充分溶解，制備成0.5％LMA和0.5％NMA。

(2)取10l保存在45oC的0.5％NMA澆注到全磨砂Dakin載玻片上，迅速蓋上1號蓋玻片，當(dāng)心勿使產(chǎn)生小氣泡，置室溫1～2min使瓊脂糖凝固。

(3)將約10000個(gè)懸于5-10lPBS中的處理組或?qū)φ战M細(xì)胞與75l0.5％LMA(37oC)相混合。(4)輕輕地將蓋玻片移開，迅速將細(xì)胞混懸液加到第一層瓊脂糖上，蓋上新蓋玻片讓其均勻鋪開，將玻片置冰盒上的玻片托盤中3～5min使瓊脂糖固化。(5)輕輕移開蓋玻片，將75l0.5％LMA(37oC)作為第三層加上，放回玻片托盤中待瓊脂糖凝固。(6)移開蓋玻片，將載玻片緩慢浸人新配制的冰涼的細(xì)胞消化液中，置4oC冷藏至少1h。以上3～6步應(yīng)在黃、紅色燈光下或暗處進(jìn)行，以免DNA受到額外損傷。4．電泳(1)將載玻片從細(xì)胞消化液中輕輕取出，并列置于水平凝膠電泳槽中陽極端附近，玻片間不留空隙。(2)向電泳槽中加入新配制的電泳緩沖液應(yīng)用液，使液面完全覆蓋載玻片。(3)解旋：玻片在堿性緩沖液中放置20~60min(4)電泳：25V300mA，電泳10～40min。(5)中和：切斷電源，將玻片置染缸，用中性緩沖液浸洗，每次5min。晾干，重復(fù)兩次。(6)染色：將玻片用50lEB應(yīng)用液染色，蓋上新蓋玻片。以上1～4步應(yīng)在黃、紅色燈光下或暗處進(jìn)行，以免額外DNA損傷。玻片可在潮濕環(huán)境中保存72h，但最好在24h內(nèi)讀片。5．鏡檢及結(jié)果評價(jià)

EB染色后的DNA樣品應(yīng)盡快在熒光顯微鏡下觀察。未受損細(xì)胞表現(xiàn)為一圓形熒光核心，沒有尾巴。受損細(xì)胞則有彗星尾從核中伸向陽極，形成一個(gè)亮的熒光頭部和尾部。淋巴細(xì)胞對照組淋巴細(xì)胞損傷組

如果要得到劑量—反應(yīng)關(guān)系，不宜用彗星長度，而最好用面積或局部熒光強(qiáng)度作判斷?？山柚詣?dòng)數(shù)字圖像處理系統(tǒng)作大規(guī)模分析。有多種圖像分析儀可進(jìn)行SCGE數(shù)據(jù)定量。

COMET自動(dòng)分析系統(tǒng)(五)SCGE檢測技術(shù)評價(jià)單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)是一