建立PCR實(shí)驗(yàn)室的基本條件

建立PCR實(shí)驗(yàn)室的基本條件臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室采用PCRPCR技術(shù)對(duì)所檢測(cè)的核酸模板進(jìn)行大量擴(kuò)增，容易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室污染導(dǎo)致臨床檢測(cè)標(biāo)本假陽(yáng)性結(jié)果；另外由于PCR技術(shù)要求高、影響因素多（特別是RNA標(biāo)本PCRPCR實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收準(zhǔn)備工作（一）硬件準(zhǔn)備——實(shí)驗(yàn)室基本建設(shè)封閉分析儀器檢測(cè)，此區(qū)域可不設(shè)。各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一流向進(jìn)行反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（不同的顏色將工作服帶出。工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)2～8（覆蓋1～1000μ；移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心用品等。標(biāo)本制備區(qū)2～8℃冰箱，-20℃或-80℃冰箱；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器（覆蓋～100；可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面心管和加樣器吸頭（帶濾心；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)核酸擴(kuò)增儀；微量加樣器（覆蓋1～100μ；可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心等。擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)視檢測(cè)方法不同而定?；緝x器設(shè)備如下：微量加樣器（覆蓋1～200μ；可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心專用辦公用品等。（二（相關(guān)知識(shí)學(xué)習(xí)）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量手冊(cè)編寫(xiě)質(zhì)量手冊(cè)是闡明臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室提綱應(yīng)包括三部分：質(zhì)量方針和宗旨；工作制度；標(biāo)準(zhǔn)操作文件（SOP）結(jié)構(gòu)體系和總方針。工作制度一般應(yīng)包括以下文件：實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置、布局及組織結(jié)構(gòu)；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)務(wù)管怨的內(nèi)部處理制度；負(fù)責(zé)人及質(zhì)檢員職責(zé)；崗位設(shè)置和責(zé)任制等……標(biāo)準(zhǔn)操作程序）儀使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；PCR儀維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序；高速低溫離心機(jī)使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序；移液器使用標(biāo)擴(kuò)增拒收標(biāo)本記錄表；室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果記錄表；室間質(zhì)控記錄表；消耗性材料驗(yàn)收記錄表；試劑驗(yàn)收記錄表；故障處理表；臺(tái)階為了對(duì)以個(gè)特定序列進(jìn)行PCR1、樣品準(zhǔn)備區(qū)這個(gè)區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)該采取預(yù)防措施：PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作。DNA或RNA用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。DNA溶膠遺留。大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無(wú)菌一次性移液管吸取。生氣溶膠。間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCRRNA-PCR免這一問(wèn)題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報(bào)道。3、前PCR區(qū)PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。4、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作所用的所有溶液都應(yīng)該沒(méi)有核酸和（或）核酸酶和RNase）污染。所有PCR在20℃到250.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。用的量進(jìn)行貯存。所有試劑和樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存。5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物℃或4℃，涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。PCR緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對(duì)照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。當(dāng)做陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，有兩個(gè)理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。由于必須有對(duì)照反應(yīng)，對(duì)照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮。6、控制污染的方法已設(shè)計(jì)出很有力的酶學(xué)方法用來(lái)消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問(wèn)題，但可以將污染降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。7、PCR儀的位置8、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個(gè)專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)室所需儀器設(shè)備清單（衛(wèi)生部推薦）序號(hào)儀器設(shè)備、輔助材料名稱放置地點(diǎn)1冰箱試劑準(zhǔn)備區(qū)4可調(diào)式移液器1-10，(5-40u(20-200u套三把試劑準(zhǔn)備區(qū)生物安全柜B2冷凍高速離心機(jī)（丙肝專用）13(5-40u(20-200ul，(200-1000u套樣品準(zhǔn)備區(qū)PCR擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可調(diào)式移液器1-10，(5-40u(20-200u套PCR擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)PCR擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)熒光定量PCR檢測(cè)儀PCR擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)所有四區(qū)均需準(zhǔn)備的儀器設(shè)備為：專用工作服和工作鞋專用辦公用品一次性手套、一次性吸水紙可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面微量加樣器一套（覆蓋1~1000ul）以上物品各一套。試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)2~8℃和耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）天平高壓鍋標(biāo)本制備區(qū)2~8℃冰箱和-20℃或-80℃冰箱高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)混勻器水浴箱或PCR儀耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）生物安全柜B2級(jí)超凈工作臺(tái)超聲波水浴儀（處