細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)

細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)南醫(yī)大三附院檢驗(yàn)科江培濤最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)常用試驗(yàn)碳水化合物的代謝試驗(yàn)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)碳源和氮源利用試驗(yàn)各種酶類試驗(yàn)抑菌試驗(yàn)最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)一碳水化合物的代謝試驗(yàn)

1糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)原理：細(xì)菌含有發(fā)酵糖（醇、苷）的酶分解糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、或僅產(chǎn)酸

培養(yǎng)基：含有0.5%~1%的糖（醇、苷）的液體、半固體、固體、或微量生化管方法：純菌種接種培養(yǎng)基，要求的溫度，數(shù)小時(shí)至兩周，微量管注意保持濕潤(rùn)，以免干燥結(jié)果：能分解糖（醇、苷）類產(chǎn)酸時(shí)，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)若能產(chǎn)氣時(shí)，培養(yǎng)基可出現(xiàn)開裂氣泡等現(xiàn)象意義：腸桿菌科尤為重要最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)2氧化-發(fā)酵試驗(yàn)（O/F）原理：細(xì)菌分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；可以進(jìn)行無氧降解的，稱為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的稱為產(chǎn)堿型培養(yǎng)基：HL二氏培養(yǎng)基方法；待測(cè)菌同時(shí)接種兩只HL培養(yǎng)基，其中一只滴加無菌的液體石蠟，高度不少于1cm，35℃培養(yǎng)48h或更長(zhǎng)結(jié)果：兩只均無變化為產(chǎn)堿型；兩只均產(chǎn)酸為發(fā)酵型；僅不加石蠟的產(chǎn)酸為氧化型意義：腸桿菌科與非發(fā)酵菌的鑒別；葡萄球菌與微球菌的鑒別，前者為發(fā)酵型，后者為氧化型最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)3ONPG（β半乳糖苷酶試驗(yàn)）原理：有的細(xì)菌可以產(chǎn)生β半乳糖苷酶，分解鄰-硝基酚-β半乳糖苷生成黃色的鄰-硝基酚方法：從KIA上取菌，于0.25ML無菌生理鹽水中制菌懸液，加甲苯一滴，使酶釋放。37℃水浴5min,加0.25mlONPG試劑，水浴20min-3h觀察結(jié)果結(jié)果：呈現(xiàn)黃色為陽(yáng)性，一般20-30min內(nèi)顯色意義：迅速及遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陽(yáng)性，不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本試驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌的快速鑒定注意：該試驗(yàn)不一定與分解乳糖相一致，決定于細(xì)菌產(chǎn)生的酶及其活性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)七葉苷水解試驗(yàn)原理：有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素，后者與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離子反應(yīng)生成黑色化合物，使培養(yǎng)基呈黑色方法：將待測(cè)菌接種于七葉苷培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察結(jié)果結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮砸饬x：D群鏈球菌與其他鏈球菌的區(qū)別，前者為陽(yáng)性；肺炎克雷伯、陰溝腸桿菌多陽(yáng)性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)V-P試驗(yàn)原理：細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，后者脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中被氧化為二乙酰，進(jìn)而與培養(yǎng)基中蛋白胨內(nèi)精氨酸中的胍基作用，生成紅色化合物，即為V-P試驗(yàn)陽(yáng)性。α奈酚可加速此反應(yīng)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水方法：待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基，35℃48h，加入甲液（6%α奈酚酒精溶液）和乙液（40%KOH溶液）結(jié)果：20min內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，如無紅色，且于35℃4h后仍如故即為陰性意義：本試驗(yàn)常與甲基紅一起試驗(yàn)，前者陽(yáng)性則后者多陰性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)甲基紅試驗(yàn)原理：細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，后者進(jìn)一步生成甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的PH降至4.5以下，加入甲基紅試劑后顯紅色即陽(yáng)性。若產(chǎn)酸量少，或進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，則培養(yǎng)基的PH仍在6.2以上，加入甲基紅試劑后顯黃色，為陰性培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水方法：待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基，2-4天后，加入甲基紅試劑，觀察結(jié)果結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，橘紅色為弱陽(yáng)性，黃色為陰性意義：大腸、沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌、等為陽(yáng)性；腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬為陰性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)7葡萄糖酸鹽試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌能氧化葡萄糖酸鹽作為唯一碳源，生成2-酮基葡萄糖酸鹽。加入班氏試劑，于沸水煮沸10分鐘，出現(xiàn)磚紅色沉淀，表明有葡萄糖酸鹽的存在培養(yǎng)基：2-酮基葡萄糖酸鹽肉湯方法：待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18-24h，于其中加入0.3ml濃縮班氏試劑，然后沸水中煮沸10分鐘，出現(xiàn)磚紅色沉淀表明有葡萄糖酸鹽的存在意義：用于腸桿菌科分類最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)二蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)1明膠液化試驗(yàn)原理：細(xì)菌產(chǎn)生明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體變?yōu)橐后w方法：待測(cè)菌接種于明膠培養(yǎng)基，22℃培養(yǎng)7天。若用35℃孵育，因明膠在此溫度下自行液化，故在觀察前先置4℃冰箱30min再觀察結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽(yáng)性意義：多數(shù)假單胞菌能液化明膠，腸桿菌科細(xì)菌如：沙雷菌、變形桿菌、陰溝桿菌等可液化明膠最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)2吲哚（?；|(zhì)）試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，當(dāng)加入吲哚試劑-柯氏試劑（對(duì)二氨基苯甲醛）后則形成紅色的玫瑰吲哚培養(yǎng)基：蛋白胨水方法：待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，沿試管壁緩慢加入吲哚試劑結(jié)果：于兩者接觸面出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，無色為陰性意義：腸桿菌科細(xì)菌的鑒定；大腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯為陽(yáng)性試劑：柯氏試劑（對(duì)二氨基苯甲醛）與歐氏試劑的區(qū)別：前者含戊醇，后者含酒精，都含濃鹽酸，前者主要成分為后者10倍，后者靈敏度更高最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)硫化氫試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸，產(chǎn)生硫化氫，后者遇亞鐵離子或鉛則形成黑褐色的沉淀。培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基方法：待測(cè)菌接種于醋酸鉛培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24-48小時(shí)觀察結(jié)果結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮砸饬x：沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、腐敗假單胞菌為陽(yáng)性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)4尿素分解試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基方法：待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)觀察結(jié)果結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮砸饬x：變形桿菌、摩根氏、雷氏普羅維登氏、克雷伯氏為陽(yáng)性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)5苯丙氨酸脫氨酶（TDA）試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基形成苯丙酮酸，加入三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基方法：待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，加10%三氯化鐵試劑3-4滴，觀察結(jié)果結(jié)果：腸桿菌科變形桿菌、普羅維登氏菌、摩根氏菌陽(yáng)性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)6氨基酸脫羧酶試驗(yàn)原理：具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿，使指示劑顯色培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對(duì)照培養(yǎng)基方法：待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基，并加入無菌液體石蠟，35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)觀察結(jié)果結(jié)果：對(duì)照管應(yīng)呈黃色，測(cè)定管呈紫色，（指示劑為溴甲酚紫）測(cè)定管呈黃色為陰性；若對(duì)照管呈紫色則試驗(yàn)無意義意義：腸桿菌科細(xì)菌的鑒定最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)三碳源和氮源利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌能以枸櫞酸鹽為唯一碳源，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，分解枸櫞酸鹽，使培養(yǎng)基變堿培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基方法：待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，觀察結(jié)果結(jié)果：培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽(yáng)性，不變色為陰性意義：克雷伯菌屬、沙門菌屬常為陽(yáng)性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)丙二酸鹽利用試驗(yàn)原理：有的細(xì)菌可利用丙二酸鹽為唯一碳源，將其分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基方法：待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，觀察結(jié)果結(jié)果：培養(yǎng)基由淡綠變?yōu)樯钏{(lán)為陽(yáng)性，無變化則為陰性意義：腸桿菌科屬間鑒別最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)四各種酶類試驗(yàn)1氧化酶試驗(yàn)原理：細(xì)胞色素氧化酶是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶，。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對(duì)苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物試劑：1%鹽酸四甲基對(duì)苯二胺或1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺方法：菌落法、濾紙法、試劑紙片法。前二者浪費(fèi)試劑，后者節(jié)省結(jié)果：10秒內(nèi)呈深紫紅色為陽(yáng)性應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的區(qū)別，前者陰性，后者多陽(yáng)性奈瑟菌屬、莫拉菌屬也為陽(yáng)性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)2觸酶試驗(yàn)原理：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和氧，出現(xiàn)氣泡試劑：3%過氧化氫溶液方法：取菌置于潔凈的試管或玻片上，然后滴加3%過氧化氫數(shù)滴，觀察結(jié)果結(jié)果：出現(xiàn)大量氣泡的為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡的為陰性意義：用于革蘭氏陽(yáng)性球菌的鑒別，葡萄球菌和微球菌為陽(yáng)性，鏈球菌和腸球菌為陰性，腸球菌多假陽(yáng)性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)硝酸鹽還原試驗(yàn)原理：硝酸鹽還原成亞硝酸鹽和氨，氨再轉(zhuǎn)化為氨基酸和其他含氮化合物；硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸系統(tǒng)中的終末受氫體。有的細(xì)菌能使硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，有的能使其還原為亞硝酸鹽和離子銨，有的能使其還原為氮培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基試劑：甲（對(duì)氨基苯磺酸），乙（α奈胺）方法：待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，將甲乙液分別加入培養(yǎng)基，立即觀察結(jié)果結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性注意：若加入試劑后無反應(yīng)，可能是①硝酸鹽沒有被還原，試驗(yàn)陰性②硝酸鹽被還原為氨和氮等其他產(chǎn)物而致假陰性，此時(shí)要加入少許鋅粉，若出現(xiàn)紅色則為陰性，不產(chǎn)生紅色則為假陰性，實(shí)際為陽(yáng)性意義：腸桿菌科為陽(yáng)性；銅綠、嗜麥芽能產(chǎn)生氮?dú)?；鏈球菌腸球菌陰性，葡萄球菌陽(yáng)性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)4DNA酶試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌產(chǎn)生DNA酶，可使長(zhǎng)鏈DNA水解，后者可被酸沉淀，長(zhǎng)鏈DNA水解后形成的寡核苷酸鏈則溶于酸，所以在平板上加入酸后會(huì)在菌落周圍形成透明環(huán)培養(yǎng)基：0.2%DNA瓊脂平板方法：點(diǎn)種被測(cè)菌于上述平板，35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)；用1mol/L鹽酸覆蓋平板，觀察結(jié)果結(jié)果：菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)為陽(yáng)性意義：金黃色葡萄球菌、沙雷氏菌、變形桿菌陽(yáng)性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)凝固酶試驗(yàn)原理：致病性葡萄球菌；結(jié)合凝固酶、游離凝固酶；纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白使血漿凝固方法：1玻片法檢測(cè)結(jié)合凝固酶兔血漿2試管法檢測(cè)游離凝固酶0.5ml兔血漿37℃水浴3-4結(jié)果：玻片法中有明顯顆粒樣凝集而鹽水對(duì)照無凝集為陽(yáng)性

試管法以血漿凝固為陽(yáng)性意義：致病性葡萄球菌；金黃色葡萄球菌多陽(yáng)性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)6CAMP試驗(yàn)原理：B群鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，可促進(jìn)葡萄球菌的β溶血毒素的活性，在兩菌的交界處溶血力加強(qiáng)，出現(xiàn)矢形溶血區(qū)培養(yǎng)基；BAP方法：先以產(chǎn)β溶血毒素的金葡菌劃一橫線接種于BAP，再將被測(cè)菌與前一劃線作垂直劃線接種，兩線不能相交，0.5-1cm，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)觀察結(jié)果，設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果：在兩劃線交界處出現(xiàn)箭頭樣溶血區(qū)為陽(yáng)性意義：B群鏈球菌陽(yáng)性，馬紅球菌出現(xiàn)反CAMP現(xiàn)象最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)膽汁溶菌酶試驗(yàn)原理：膽汁或膽鹽可溶解肺炎鏈球菌，使細(xì)菌發(fā)生自溶試劑：10%去氧膽酸鈉或純牛膽汁方法：平板法：滴加10%去氧膽酸鈉一環(huán)于被測(cè)菌落上35

℃30min觀察結(jié)果試管法：0.9ml被測(cè)菌培養(yǎng)物加入10%去氧膽酸鈉0.1ml后置35℃水浴10-30min觀察結(jié)果結(jié)果：菌落消失，或培養(yǎng)物變透明為陽(yáng)性意義：肺炎鏈球菌陽(yáng)性最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)8脂酶、卵磷脂酶、鹼性磷酸酶主要用于厭氧菌的鑒定產(chǎn)氣夾膜梭菌卵磷脂酶陽(yáng)性中間類桿菌脂酶陽(yáng)性致病性葡萄球菌鹼性磷酸酶陽(yáng)性，如金葡等最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)五抑菌試驗(yàn)1O/129試驗(yàn)原理：O/129（二氨基喋啶）對(duì)弧菌屬有抑制作用，而對(duì)氣單胞菌屬無抑制作用培養(yǎng)基；堿性瓊脂培養(yǎng)基方法：紙片法藥敏40ug/片結(jié)果：有抑菌環(huán)為敏感，無抑菌環(huán)為耐藥意義：弧菌、鄰單胞菌敏感；氣單胞菌屬耐藥最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)桿菌肽試驗(yàn)原理：A群鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎全敏感，而其他鏈球菌則耐藥培養(yǎng)基：BAP方法：同紙片法藥敏0.04U/片結(jié)果：＞10mm敏感；＜10mm耐藥意義：A群鏈球菌敏感最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)3奧普托欣Optochin試驗(yàn)原理：肺炎鏈球菌對(duì)Optochin敏感，其他鏈球菌無抑制作用培養(yǎng)基：BAP方法：同紙片法藥敏5ug/片結(jié)果：抑菌環(huán)直徑＞14mm敏感；≤14mm耐藥此時(shí)加做膽汁溶菌試驗(yàn)證實(shí)意義：肺炎鏈球菌對(duì)Optochin敏感最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)4新生霉素敏感試驗(yàn)原理：表皮葡萄球菌對(duì)新生霉素敏感；腐生葡萄球菌對(duì)新生霉素耐藥培養(yǎng)基：MH瓊脂方法：同紙片法藥敏5ug/片結(jié)果：抑菌環(huán)直徑＞16mm敏感；≤16mm耐藥意義：區(qū)別表皮葡萄球菌與腐生葡萄球菌最新細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)氫氧化鉀拉絲試驗(yàn)

(1)原理：革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁在稀堿溶液中易于破裂，釋放出未斷裂的DNA螺旋，使氫氧化鉀菌懸液呈現(xiàn)粘性，可用接種環(huán)攪拌后拉出粘絲來，而革蘭陽(yáng)性細(xì)菌在稀堿溶液中沒有上述變化。(2)方法：取1滴40g/L氫氧化鉀