酶的作用機理及實例

§2.7酶的作用機理及實例1.底物和酶的靠近(proximity)與定向(orientation)

在化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)速度與反應(yīng)物的濃度成正比，若在酶促反應(yīng)系統(tǒng)中的催化場所—酶的活性中心，增加底物濃度，反應(yīng)速度也會隨之增加。

酶促反應(yīng)加速的原因之一，就是使底物分子集中于酶的活性中心，大大提高這個區(qū)域底物的有效濃度，從而加速酶促反應(yīng)速度。曾測過某酶促反應(yīng)中，溶液中的底物濃度為0.001mol/L,而在活性中心的底物濃度竟達到10mol/L，比溶液中高出一萬倍！因此在酶活性中心區(qū)域的高底物濃度決定了高的反應(yīng)速度。

一.決定酶高效率催化的機制

僅僅是靠近還不夠，還需要酶和底物的反應(yīng)基團在反應(yīng)中彼此相互嚴格地定向，即酶活性中心的催化基團(氨基酸殘基上的基團)定向于底物的反應(yīng)基團。只有既靠近又定向，底物分子才能迅速的形成過渡態(tài)，加速反應(yīng)的進行。

靠近與定向A.酶的催化基團和底物的反應(yīng)基團既不靠近，也不定向。B.兩個基團靠近，但不定向，不利于反應(yīng)進行。C.兩個基團既靠近，又定向，有利于反應(yīng)進行。

2.底物變形(distortion)與電子張力(electronstrain)

酶與底物結(jié)合后，底物發(fā)生變形，底物由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，降低了活化能，使酶促反應(yīng)加速。

酶與底物結(jié)合后，底物發(fā)生形變。酶與底物結(jié)合后，酶分子中的某些基團或離子可以使底物敏感鍵中的某些基團的電子云密度增加或降低，從而產(chǎn)生電子張力，使敏感鍵的一端更加敏感，更易于發(fā)生反應(yīng)。3.共價催化(covalentcatalysis)

共價催化的一般形式是酶活性中心上的親核基團對底物的親電子基團進行攻擊，二者形成共價鍵，這個共價中間物很容易變成過渡態(tài)，反應(yīng)的活化能大大降低，反應(yīng)速度加快。酶分子上的親核基團有Ser-OH、Cys-SH、His-咪唑基等，這些富含電子的基團(有孤對電子)，攻擊底物分子中電子云密度較小的親電子基團，并供出電子，二者形成共價鍵，酶和底物形成一個不穩(wěn)定的中間物，進而轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。蛋白質(zhì)中三種主要的親核基團4.酸堿催化

(acid-basecatalysis)共價催化也可以是酶的親電基團對底物的親核基團進行攻擊，酶分子上帶正電的基團有H+、Mg2+、Fe3+—NH3+等，它們攻擊底物分子上帶負電的親核基團，與底物形成共價鍵,進行催化。酶活性中心的一些基團作為質(zhì)子的供體或質(zhì)子的受體對底物進行廣義的酸堿催化。

組氨酸的咪唑基是酶催化反應(yīng)中的最有效、最活潑的催化功能基團。咪唑基的pk=6.0,在生理pH條件下，有一半以酸性形式存在，另一半以堿性形式存在，因此既可以作質(zhì)子的供體又可以作質(zhì)子的受體，在酶促反應(yīng)中發(fā)揮作用。廣義酸基團（質(zhì)子供體）廣義堿基團（質(zhì)子受體）COOHCOO-NH3+NH2¨OHO-SHS-CCHNHN+HCHCCHNHN∶

CH蛋白質(zhì)中作為廣義酸堿催化的功能基團5.微環(huán)境效應(yīng)

酶的活性中心周圍的環(huán)境是一個非極性環(huán)境，即低介電環(huán)境，在低的介電環(huán)境中排斥水分子，酶的催化基團和底物分子的敏感鍵之間有很大的反應(yīng)力，有助于加速酶促反應(yīng)。

如果酶的活性中心周圍是一個高介電環(huán)境中，活性中心就會有水分子存在，水分子對帶電離子有屏蔽作用，削弱帶電離子之間的靜電作用，不利于酶促反應(yīng)的進行。例如：

酶活性中心的羧基與水形成氫鍵，導(dǎo)致酶活性中心羧基表面有一層水化層，水分子的屏蔽作用，大大削弱了酶分子與底物離子間的靜電相互引力，不利于酶促反應(yīng)。二.溶菌酶（lysozyme)

溶菌酶存在于雞蛋清和動物的眼淚中，其生物學(xué)功能是催化某些細菌細胞壁的多糖水解，從而溶解細菌的細胞壁。溶菌酶是第一個用X-射線法闡明其全部結(jié)構(gòu)和功能的酶。是1922年倫敦細菌學(xué)家弗萊明(Fleming)首次發(fā)現(xiàn)的。1.底物、溶菌酶及酶和底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)溶菌酶的底物溶菌酶通過水解某些細菌細胞壁的多糖組份來溶解細胞壁，細胞壁的多糖由兩種糖組成:

N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(NAM)溶菌酶的最適小分子底物

NAG和NAM交替排列形成多聚物，它們之間通過β-1,4糖苷鍵相連。溶菌酶的最適小分子底物為NAG-NAM交替形成的六糖。6個糖環(huán)分別用A、B、C、D、E、F表示。溶菌酶水解D糖環(huán)和E糖環(huán)之間的糖苷鍵。溶菌酶的結(jié)構(gòu)

溶菌酶由129個氨基酸殘基構(gòu)成，是一個單鏈蛋白，分子內(nèi)含有四對二硫鍵?；钚灾行牡陌被釟埢荊lu35和Asp52

。

雞蛋蛋清溶菌酶的氨基酸序列溶菌酶和底物結(jié)合的空間構(gòu)象

從表面構(gòu)象看，酶的結(jié)構(gòu)不很緊密，大多數(shù)極性氨基酸殘基分布在分子的表面，非極性氨基酸殘基分布在分子的內(nèi)部。整個酶分子中有一狹長的凹穴。最適底物正好與酶分子的凹穴相結(jié)合，凹穴中的Glu35和Asp52

是活性中心的氨基酸殘基。溶菌酶----底物復(fù)合物2.催化作用機理溶菌酶底物與酶活性中心的關(guān)系

溶菌酶活性中心上的Asp52氧原子距離底物敏感鍵(C-O鍵)中碳原子（D糖環(huán)氧原子）只有0.3nm，活性中心上另一個氨基酸Glu35的羧基距離底物敏感鍵(C-O鍵)中氧原子也只有0.3nm，溶菌酶的活性中心的氨基酸殘基與底物敏感鍵既靠近又定向。底物D糖環(huán)構(gòu)象發(fā)生變化

溶菌酶底物D糖環(huán)變形模型圖椅式：C5、C1、C2

和O不在同一平面

C5向前移動，

O原子向后移動半椅式：C5、C1、C2

和O在同一平面上

酶與底物結(jié)合后，D糖環(huán)構(gòu)象發(fā)生變形，從正常的能量較低的椅式構(gòu)象變?yōu)槟芰枯^高的半椅式構(gòu)象。酸堿催化

酶活性中心的Glu35處于非極性區(qū)，其羧基呈不解離狀態(tài)，而Asp52處于極性區(qū)，羧基呈解離狀態(tài)。Glu

35COC1C4HOEOH(NAG)NAGOOHOCO-Asp

52Asp

52-COOONAGDHOEOHC4C1OCGlu

35-HOH-+H2O+H非極性區(qū)極性區(qū)(NAG)O33

Glu35的羧基起廣義酸堿催化，向底物D糖環(huán)和E糖環(huán)之間的糖苷鍵上的氧原子提供一個質(zhì)子，氧原子與D糖環(huán)C1的糖苷鍵斷開，D糖環(huán)的C1

帶上正電荷成為正碳離子。Asp52上的-COO-起著協(xié)調(diào)糖苷鍵斷裂和穩(wěn)定正碳離子的作用。DGlu

35COOHOC1HOHD(NAG)3OCO-Asp

52最后，來自環(huán)境中的水分子上的H+與Glu35的-COO-結(jié)合，水分子上的HO-與正碳離子結(jié)合，至此，一次反應(yīng)完成，細胞壁打開一個缺口。經(jīng)多次重復(fù)作用，細菌的細胞壁溶解。3.溶菌酶催化特點小結(jié)

靠近與定向底物形變酸堿催化（二）胰凝乳蛋白酶

（chymotrypsin)

胰凝乳蛋白酶是由241個氨基酸組成，分子量為25000，分子呈橢圓狀，含α-螺旋較少?；钚圆课挥蒘er195、His57、Asp102三個氨基酸殘基構(gòu)成，這三個氨基酸殘基形成催化三聯(lián)體。

催化三聯(lián)體：催化機理：

酶活性中心的三個氨基酸底物

His57作為質(zhì)子的受體從Ser195吸取一個質(zhì)子，形成共價鍵，使Ser195-O-成為很強的親核試劑，攻擊底物羰基碳原子，二者形成共價鍵。電子云向底物羰基氧原子轉(zhuǎn)移第一步第二步底物-NH上的電子云向酶分子的His57-N+H轉(zhuǎn)移，His57作為酸向底物提供質(zhì)子。底物的C-N鍵斷裂第三步底物C-N鍵氮端產(chǎn)物釋放第四步第五步水分子的-OH親核攻擊底物羰基碳原子,形成共價鍵。His57作為質(zhì)子的受體從水分子上接受質(zhì)子。第六步底物C-O-的電子云向His57-N+H轉(zhuǎn)移,Ser195的氧與底物的碳之間的共價鍵斷開。Ser195作為質(zhì)子的受體從His57接受質(zhì)子，酶恢復(fù)原狀。第七步第八步胰凝乳蛋白酶催化機制的特點：

廣義的酸堿催化共價催化

絲氨酸蛋白酶（serineproteases）

絲氨酸蛋白酶是一類最有特色的酶家族，它包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶、枯草桿菌蛋白酶等。

胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶為消化酶，在胰腺中合成，以非活性的酶原形式分泌到消化道，在消化道中轉(zhuǎn)化成有活性的酶。這三種酶在一級結(jié)構(gòu)上有40%的氨基酸順序是相同的，三維結(jié)構(gòu)也很相似，都有Ser195、His57、Asp102三個氨基酸殘基構(gòu)成的催化三聯(lián)體，它們的催化作用機理也相似，但它們的專一性是完全不同的。這三種酶的活性部位位于分子表面的凹陷區(qū)域，這個凹陷結(jié)構(gòu)區(qū)域稱為口袋。由于三種蛋白酶的口袋的差異造成它們的專一性不同。胰凝乳蛋白酶的口袋底部有一個小的Ser，口袋上方有兩個小的Gly殘基，有利于較大的芳香族氨基酸側(cè)鏈進入，因此胰凝乳蛋白酶催化芳香族氨基酸形成的肽鍵。胰蛋白酶口袋底部有一個帶負電荷的Asp，有利于結(jié)合帶正電荷的Arg、Lys殘基，決定了胰蛋白酶可以催化精氨酸和賴氨酸羧基形成的肽鍵。彈性蛋白酶有一個淺的口袋，口袋上方有大的Thr和Val殘基，只允許小分子的氨基酸像甘氨酸、丙氨酸進入，因此彈性蛋白酶可催化甘氨酸和丙氨酸羧基形成的肽鍵?！?.8酶原激活

有些酶在體內(nèi)合成出來即可自發(fā)的折疊成一定的三級結(jié)構(gòu)，酶就立刻表現(xiàn)出酶活性，如溶菌酶。有些酶在體內(nèi)合成出來的只是它的無活性的前體，經(jīng)過蛋白酶的催化作用，構(gòu)象發(fā)生變化，才能變成有活性的酶。該活化過程，是生物體內(nèi)的一種調(diào)控機制。這種調(diào)控機制的特點：由無活性的酶原轉(zhuǎn)變成有活性的酶是不可逆轉(zhuǎn)的。

一.胰蛋白酶原的激活二.胰凝乳蛋白酶原的激活

三、幾種蛋白酶的激活及它們之間的相互作用

彈性蛋白酶胰蛋白酶原六肽＋胰蛋白酶自身催化腸激酶羧肽酶原羧肽酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶彈性蛋白酶原§2.7寡聚酶、同功酶、誘導(dǎo)酶、固定化酶

一、寡聚酶寡聚酶是由兩個或多個亞基組成的酶。二、同功酶同功酶是指能催化同一化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成都有所不同的一組酶，它們的Km和Vm各不相同。如：哺乳動物中有五中乳酸脫氫酶，它們催化同一反應(yīng)，分子量相近，但氨基酸組成及順序不同，可用電泳法得到。

三、誘導(dǎo)酶根據(jù)誘導(dǎo)酶合成與代謝物的關(guān)系。人們把酶相對地區(qū)分為結(jié)構(gòu)酶和誘導(dǎo)酶。結(jié)構(gòu)酶是指細胞內(nèi)天然存在的酶，它的含量穩(wěn)定，受外界的影響小。誘導(dǎo)酶是指當(dāng)細胞中加入特定誘導(dǎo)物后誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶。它的含量在誘導(dǎo)物存在下顯著增高。這種誘導(dǎo)物往往是該酶底物的類似物或底物本身。誘導(dǎo)酶或許是細胞中本身就存在，但含量低，當(dāng)加入誘導(dǎo)物后顯著增高；或許是細胞中不存在這種酶，當(dāng)加入