基因組測(cè)序基本原理

基因組測(cè)序生物信息系列講座之二第一頁(yè)，共54頁(yè)。大綱I.核酸DNA的發(fā)現(xiàn)以及測(cè)序歷史簡(jiǎn)介II.雙脫氧化(Sangerdideoxymethod)測(cè)序III.大片段的DNA測(cè)序與基因組測(cè)序的大開(kāi)展VI.人類基因組V.1000美元個(gè)體化基因組測(cè)序方案(The“$1,000dollargenome)OnWebCT--“The$1000genome〞--reviewofnewsequencingtechniquesbyGeorgeChurch第二頁(yè)，共54頁(yè)。第三頁(yè)，共54頁(yè)。核酸發(fā)現(xiàn)與測(cè)序簡(jiǎn)史第四頁(yè)，共54頁(yè)。MCchapter12DNA測(cè)序的簡(jiǎn)史第五頁(yè)，共54頁(yè)。DNA測(cè)序的方法雙脫氧法(Sangerdideoxy)(primerextension/chain-termination)method:最流行也是最廣為承受的方法。Maxam-Gilbert化學(xué)剪切法(chemicalcleavagemethod):DNAislabelledandthenchemicallycleavedinasequence-dependentmanner.Thismethodisnoteasilyscaledandisrathertedious焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing):measuringchainextensionbypyrophosphatemonitoring。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無(wú)須進(jìn)展電泳，DNA片段也無(wú)須熒光標(biāo)記，操作極為簡(jiǎn)便，可以快速、準(zhǔn)確地確定DNA序列。第六頁(yè)，共54頁(yè)。SinglestrandedDNA5’3’5’3’Sanger雙脫氧測(cè)序原理a)常規(guī)的PCR，粘附(Anneal)第七頁(yè)，共54頁(yè)。Sanger雙脫氧測(cè)序原理b)在延伸的時(shí)候?qū)NA聚合酶與參加正常的dNTP，同時(shí)摻入少量的雙脫氧的ddNTP5’3’DNA聚合酶延伸方向第八頁(yè)，共54頁(yè)。Sanger雙脫氧測(cè)序原理5’3’5’3’TTTTddAddAddAddA以ddATP為例，可以看到在反響中帶有T的模板被摻入的互補(bǔ)的ddATP隨機(jī)停頓。因?yàn)閐dATP不可以再使其主鏈延伸。第九頁(yè)，共54頁(yè)。如何讀取這些DNA片段？同位素標(biāo)記同位素標(biāo)記的引物(如

32P)同位素標(biāo)記的dNTPs(如35S或者

32P)熒光標(biāo)記化學(xué)合成時(shí)帶有熒光素標(biāo)記的ddNTPs被摻入到反響中。每一種ddNTP都帶有自身特定的熒光波長(zhǎng)以便于觀測(cè)第十頁(yè)，共54頁(yè)。測(cè)序結(jié)果分析目前一般采用凝膠電泳法分析-可以比較好的將每一條dNTP產(chǎn)生的DNA條帶別分開(kāi)。第十一頁(yè)，共54頁(yè)。DNA測(cè)序膠:老方法利用電泳或者放射自顯影的方法來(lái)分析DNA序列在反響中參加不同的ddNTP得到結(jié)果帶有同位素標(biāo)記的引物或者ddNTP被摻入到反響中，以便于觀測(cè)第十二頁(yè)，共54頁(yè)。第十三頁(yè)，共54頁(yè)。自動(dòng)測(cè)序儀輸出第十四頁(yè)，共54頁(yè)。DNA測(cè)序的實(shí)例樣本一個(gè)帶有28個(gè)DNA樣品的膠圖:綠帶：堿基A，,藍(lán)帶C,黃帶G，紅帶T.越小的片段跑得越快第十五頁(yè)，共54頁(yè)。自動(dòng)測(cè)序儀第十六頁(yè)，共54頁(yè)。測(cè)序的趨勢(shì)相對(duì)而言一般很少實(shí)驗(yàn)室會(huì)自己做測(cè)序，一那么自身測(cè)序費(fèi)用比較高，而且熒光試劑容易粹滅，同時(shí)也比較消耗時(shí)間，另外可能出現(xiàn)一些其它問(wèn)題引起結(jié)果不成功。所以大部分的測(cè)序都是送到相關(guān)的測(cè)序中心或者公司完成:--下面這個(gè)序列就是一個(gè)自動(dòng)測(cè)序儀記錄的一段DNA片段第十七頁(yè)，共54頁(yè)。PartII.

大片段DNA測(cè)序與基因組測(cè)序的大開(kāi)展第十八頁(yè)，共54頁(yè)。19第十九頁(yè)，共54頁(yè)。蜜蜂基因組是如何獲得的？第二十頁(yè)，共54頁(yè)。基因組文庫(kù)的建立目前基將基因組片段打碎建立文庫(kù)。基因組文庫(kù)含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體。第二十一頁(yè)，共54頁(yè)。酵母人工染色體(YACs)200-1000kbBacteriophageP190kbCosmids40kbBacteriophagel

9-23kb質(zhì)粒(2-6kb)第二十二頁(yè)，共54頁(yè)。大片段載體Lambdaphage插入大小:20–30kbCosmids插入大小:35–45kbBACsandPACs(bacterialandP1artificialchromosomes(Viral)respectively)插入大小:100–300kbYACs(yeastartificialchromosomes)插入大小:200–1,000kb第二十三頁(yè)，共54頁(yè)。大片段插入載體Lambda噬菌體以及cosmids插入穩(wěn)定但插入片段的容量可能缺乏以做大規(guī)模的測(cè)序YACs可以插入大片段但不太穩(wěn)定，比較難實(shí)際操作第二十四頁(yè)，共54頁(yè)。BACsandPACsBACsandPACs大規(guī)模測(cè)序通用質(zhì)粒對(duì)插入片段大小比較適宜，而且容易使用與其它正常質(zhì)粒一樣可以擴(kuò)增和別離第二十五頁(yè)，共54頁(yè)。全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序但是片段比較大時(shí)，如在基因組測(cè)序時(shí)，僅僅由Sanger方法并不適宜，因此Shotgun測(cè)序，將基因大片段打碎后測(cè)序。鳥(niǎo)槍法戰(zhàn)略〔ShotgunStrategy〕又稱隨機(jī)測(cè)序戰(zhàn)略，是由美國(guó)塞萊拉遺傳公司創(chuàng)始人克雷格?文特爾創(chuàng)造，主要針對(duì)大片段的全長(zhǎng)測(cè)序。因?yàn)檎麄€(gè)基因組太長(zhǎng)而每次只能測(cè)得一個(gè)500的小片斷(read)。第二十六頁(yè)，共54頁(yè)。鳥(niǎo)槍法測(cè)序步驟第一，建立高度隨機(jī)、插入片段大小為2kb左右的基因組文庫(kù)。克隆數(shù)要到達(dá)一定數(shù)量，即經(jīng)末端測(cè)序的克隆片段的堿基總數(shù)應(yīng)到達(dá)基因組5倍以上。第二，高效、大規(guī)模的末端測(cè)序。第三，序列集合。第四，填補(bǔ)缺口。第二十七頁(yè)，共54頁(yè)。鳥(niǎo)槍法測(cè)序簡(jiǎn)要第二十八頁(yè)，共54頁(yè)。SIZESELECTe.g.,10Kbp±8%std.dev.SHEAR鳥(niǎo)槍法測(cè)序技術(shù)DNAtargetsampleVectorLIGATE&CLONEPrimerEndReads(Mates)SEQUENCE550bp第二十九頁(yè)，共54頁(yè)。重疊群Contigs重疊群是指一組互相重疊的染色體DNA序列如何建立重疊群基因克隆？Forsequencingonewantstocreate“minimumtilingpath〞Contigofsmallestnumberofinsertsthatcoversaregionofthechromosome基因組genomicDNA重疊群contig最小路徑minimumtilingpath第三十頁(yè)，共54頁(yè)。限制性酶切產(chǎn)生不同的重疊群Contigs通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切將重疊片段序列排列直到建立一個(gè)完好的contig第三十一頁(yè)，共54頁(yè)。兩種不同的全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序第三十二頁(yè)，共54頁(yè)。序列拼接與組裝獨(dú)立的測(cè)序片段(read)通過(guò)逐步把它們拼接起來(lái)形成序列更長(zhǎng)的重疊群(Contig)，直至得到完好序列的過(guò)程稱為重疊群裝配(Scaffold)。目前DNA序列拼接應(yīng)用的主要軟件是由美國(guó)華盛頓大學(xué)PhilGreen實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的PhredPhrapConsed系統(tǒng)。目前36個(gè)國(guó)家900多個(gè)實(shí)驗(yàn)室都在使用上述系統(tǒng)。非贏利研究機(jī)構(gòu)或個(gè)人可申請(qǐng)免費(fèi)利用該系統(tǒng)。此外還有一序列的商業(yè)軟件，如主流的基因組拼接軟件〔GenomeAssembly〕，華大基因開(kāi)發(fā)的SOAPdenovo都可以做基因組的拼接，然后可以用補(bǔ)漏軟件進(jìn)展補(bǔ)漏，得到完好的基因組序列。第三十三頁(yè)，共54頁(yè)?；蚪Mdenovo測(cè)序基因組denovo測(cè)序也叫做基因組從頭測(cè)序，是指不依賴于任何基因組序列信息對(duì)某個(gè)物種的基因組進(jìn)展測(cè)序，然后應(yīng)用生物信息學(xué)手段對(duì)測(cè)序序列進(jìn)展拼接和組裝，最終獲得該物種基因組序列圖譜。第三十四頁(yè)，共54頁(yè)。Denovo基因原理淺解假設(shè)有原始序列：Ididnotknowwhatiswritteninthispaper.那么通過(guò)denovo分段重復(fù)測(cè)序得到了3次不同的結(jié)果。測(cè)序結(jié)果1：ididnotknowwhatiswritteninthispaper測(cè)序結(jié)果2:ididnotknowwhatiswrriteninthispaper測(cè)序結(jié)果3:ididnotknowwhatiswritteninthispaper將3次重疊(overlap)部分進(jìn)展拼接組成contig(重疊群)idnotknowwhididnotknowwhadnotknowwididnotknowwha(Contig)第三十五頁(yè)，共54頁(yè)。Denovo測(cè)序原理第三十六頁(yè)，共54頁(yè)。mapping測(cè)序通過(guò)現(xiàn)有的同源主鏈序列，將同源測(cè)序片段組裝拼裝，建立新序列。該序列與的主鏈類似，但不一定一樣。第三十七頁(yè)，共54頁(yè)。測(cè)序?qū)嶒?yàn)室第三十八頁(yè)，共54頁(yè)。39組裝缺口測(cè)序缺口-我們假如已經(jīng)知道重疊群的順序和方向，那么可以通過(guò)跨越式測(cè)序得到缺口的序列信息。物理缺口-沒(méi)有重疊群覆蓋，同時(shí)也沒(méi)有DNA測(cè)序結(jié)果

測(cè)序缺口物理缺口第三十九頁(yè)，共54頁(yè)。重復(fù)序列干擾鳥(niǎo)槍法測(cè)序拼接第四十頁(yè)，共54頁(yè)。41重復(fù)序列REPEATS第四十一頁(yè)，共54頁(yè)。重復(fù)序列真核生物染色體基因組中重復(fù)出現(xiàn)的核苷酸序列。這些序列一般不編碼多肽，在基因組內(nèi)可成簇排布，也可分布于基因組。第四十二頁(yè)，共54頁(yè)。重復(fù)序列的屏蔽軟件CENSOR是一個(gè)通過(guò)參考序列挑選查詢序列中的重復(fù)序列并屏蔽同源重復(fù)序列的軟件工具，其可以將所有找到的重復(fù)生成報(bào)告以及分類第四十三頁(yè)，共54頁(yè)。CENSOR也可提供離線軟件包第四十四頁(yè)，共54頁(yè)。Repeat

maskerRepeatMasker通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)中的重復(fù)元素挑選FASTA格式的查詢序列，并返回一個(gè)屏蔽之后的可以用于準(zhǔn)備數(shù)據(jù)庫(kù)檢索查詢序列的DNA序列。第四十五頁(yè)，共54頁(yè)。Repeatmasker的離線軟件包第四十六頁(yè)，共54頁(yè)。兩種屏蔽方法的差異Repeatmasker用法類似于CENSOR，但這兩個(gè)工具各自有自身的優(yōu)點(diǎn)，在于他們的數(shù)據(jù)庫(kù)選取中有差異，假如要確保數(shù)據(jù)更加可信。所以同時(shí)用兩個(gè)工具或者與與其他類似的工具組合使用。第四十七頁(yè)，共54頁(yè)。48一些錯(cuò)配的重復(fù)序列collapsedtandemexcisionrearrangement第四十八頁(yè)，共54頁(yè)。人類基因組方案人類基因組方案(英語(yǔ)：HumanGenomeProject,HGP〕是一項(xiàng)規(guī)模宏大，跨國(guó)跨學(xué)科的科學(xué)探究工程。其宗旨在于測(cè)定組成人類染色體〔指單倍體〕中所包含的30億個(gè)堿基對(duì)組成的核苷酸序列，從而繪制人類基因組圖譜，并且辨識(shí)其載有的基因及其序列，到達(dá)破譯人類遺傳信息的最終目的。第四十九頁(yè)，共54頁(yè)。人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)第五十頁(yè)，共54頁(yè)。個(gè)體化基因組測(cè)序方案已有的研究說(shuō)明，基因或基因組變異是腫瘤發(fā)生的根本原因，利用單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)獲取的腫瘤細(xì)胞進(jìn)展更為準(zhǔn)確和深化的分析，理解癌細(xì)胞的基因如何突變，以及腫瘤的來(lái)源、屬于哪種基因型等，為早期檢測(cè)和診斷腫瘤和腫瘤的個(gè)體化治療提供指導(dǎo)。而基因分析是個(gè)體化醫(yī)療的前提，因此個(gè)體化的基因測(cè)序技術(shù)的開(kāi)展可以驅(qū)動(dòng)著個(gè)體化醫(yī)療的進(jìn)程。第五十一頁(yè)，共54頁(yè)。乳腺癌患者全基因組測(cè)序年歐洲內(nèi)科腫瘤學(xué)會(huì)〔ESMO〕研究者首次完成了對(duì)個(gè)體的乳腺癌患者全基因組測(cè)序以期制定個(gè)體化治療的大型臨床試驗(yàn)。截至年9月23日，共有402名乳腺癌患者已經(jīng)完成了這項(xiàng)檢測(cè)，還有26名患者分析正在進(jìn)展中。276名患者得到了基因組檢測(cè)結(jié)果，其中248例進(jìn)展了完好的全基因組分析。André博士說(shuō)，在172例患者中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能作為抗腫瘤藥物靶點(diǎn)的基因組改變。有趣的是，20%的患者表現(xiàn)出一個(gè)罕見(jiàn)和意料之外的基因組改變，這就更加突顯了全基因組測(cè)序的重要性。第五十二頁(yè)，