第三章培養(yǎng)基

第三章培養(yǎng)基第一節(jié)培養(yǎng)基的類型1、按培養(yǎng)基成分1）合成培養(yǎng)基所用原料的化學成分明確、穩(wěn)定如葡萄糖、硫酸銨適于研究菌種基本代謝和過程的物質變化等科研工作；在生產某些疫苗的過程中，為了防止異性蛋白質等雜質摻入，也常用合成培養(yǎng)基；營養(yǎng)單一、價格較高，不適于大規(guī)模生產2）天然培養(yǎng)基原料是一些天然動、植物產品如花生餅粉、蛋白胨等來源廣泛（大多為農副產品）、營養(yǎng)豐富、價格低廉、適于工業(yè)化生產一般不需要另加微量元素、維生素等物質由于成分復雜，不易重復，如對原料質量等方面不加控制會影響生產穩(wěn)定性2、按物理狀態(tài)分1）固體適于菌種和孢子的培養(yǎng)與保存，也廣泛應用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產；近年來由于機械化程度的提高，在發(fā)酵工業(yè)上又開始應用固體培養(yǎng)基進行大規(guī)模生產，其組分常用麩皮、大米、小米、木屑、禾殼等。2）半固體瓊脂0.5%-0.8%主用于鑒定細菌、觀察細菌運動特征及噬菌體的效價測定等3）液體發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基3、按用途分基礎培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基供菌種繁殖孢子的培養(yǎng)基，常用固體培養(yǎng)基。1）孢子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基基本要求：配制時需注意：A）營養(yǎng)不要太豐富（特別是有機氮源），否則不易產孢子。如灰色鏈霉菌在葡萄糖-硝酸鹽-其他鹽的培養(yǎng)基上都能很好地生長和產生孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只長菌體而不產孢子B）所用無機鹽的濃度要適量，否則會影響孢子量和孢子顏色。C）注意pH和培養(yǎng)基的濕度?；疽笫悄苁咕w迅速生長，產生較多優(yōu)質孢子，且不易引起菌種發(fā)生變異。常用孢子培養(yǎng)基：◆麩皮培養(yǎng)基◆小米培養(yǎng)基◆大米培養(yǎng)基◆玉米碎屑培養(yǎng)基◆用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食鹽等配制的瓊脂斜面培養(yǎng)基大米和小米常用作霉菌孢子培養(yǎng)基，因為它們含氮量少、疏松、表面積大，是良好的孢子培養(yǎng)基。2）種子培養(yǎng)基供孢子發(fā)芽、生長和菌體繁殖的培養(yǎng)基。營養(yǎng)要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達較高的溶解氧，供大量菌體生長和繁殖。種子培養(yǎng)基的成分要考慮在代謝過程中能維持穩(wěn)定的pH，其成分還要根據不同菌種的主要特征而定。一般種子培養(yǎng)基都用營養(yǎng)豐富而完全的天然有機氮源，因為有些氨基酸能刺激孢子發(fā)芽。但無機氮源容易利用，有利菌體的迅速生長，所以在種子培養(yǎng)基中常包括有機氮源和無機氮源。最后一級的種子培養(yǎng)基的成分最好能較接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這樣可使種子進入發(fā)酵培養(yǎng)基后能迅速適應，快速生長。3）發(fā)酵培養(yǎng)基既要使種子接入后能迅速生長，達到一定的菌體濃度，又要使長好的菌體能迅速合成所需產物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有合成產物所需的特定元素、前體和促進劑等。供菌體生長、繁殖和合成大量代謝產物用的培養(yǎng)基。但若因生長和合成產物所需的總的碳源、氮源和其他營養(yǎng)物質總的濃度太高，或生長和合成產物兩個階段各需的最佳條件有求不同時，則可考慮培養(yǎng)基用分批補料工藝來加以滿足。第二節(jié)培養(yǎng)基的成分及來源一、碳源主要功能：1）為菌體的生長繁殖提供能源和合成菌體所必需的成分；2）為合成目的產物提供所需的碳素成分常用的碳源:特殊情況下（如碳源貧乏時），蛋白質水解物或氨基酸等也可被微生物作為碳源使用。糖類油脂有機酸低碳醇等1、糖類發(fā)酵培養(yǎng)基中使用最廣泛的碳源;主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等糖類來源葡萄糖乳糖淀粉蔗糖純葡萄糖、水解淀粉純乳糖、乳清粉大麥、花生粉、燕麥粉、黑麥粉等甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗紅糖、精白糖等工業(yè)上常用的糖類及來源淀粉水解糖的制備是發(fā)酵生產的一項重要工藝。葡萄糖最易利用，幾乎所有微生物都能利用葡萄糖常作為培養(yǎng)基的一種主要成分，并且作為加速微生物生長的一種有效糖。但過多的葡萄糖會過分加速菌體的呼吸，以至培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中間代謝物（如丙酮酸、乳酸、乙酸等）不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基中，導致pH下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長和產物的合成。糖蜜制糖的結晶母液，它是制糖工業(yè)的副產物;含有豐富的糖、氮類化合物、無機鹽和維生素等，是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基價廉物美的碳源;糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達50%-75%。糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，二者在糖的含量和無機鹽的含量上有所不同，即使同一種糖蜜由于加工方法不同其成分也存在差異，因此使用時要注意。淀粉糊精多糖，也是常用的碳源;需經胞外酶水解成單糖后再被吸收利用;使用淀粉可克服葡萄糖代謝過快的弊病，價格也比較低廉，在發(fā)酵工業(yè)中被普遍使用。常用的淀粉為玉米、甘薯、馬鈴薯、木薯淀粉。油和脂肪也能被許多微生物作為碳源和能源這些微生物都具有比較活躍的脂肪酶，在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解為甘油和脂肪酸，在溶解氧的參與下，進一步氧化成CO2和H2O，并釋放出大量的能量。當微生物利用脂肪作為碳源時，要供給比糖代謝更多的氧，不然大量的脂肪酸和代謝中的有機酸會積累，從而引起pH的下降，并影響微生物酶系統(tǒng)的作用。常用豆油、菜油、葵花籽油、豬油、魚油、棉籽油等2、油和脂肪一些微生物對多種有機酸（如乳酸、檸檬酸、乙酸等）有很強的氧化能力，可以有機酸或有機酸鹽作為碳源。有機酸的利用常會使pH上升，尤其是有機酸鹽氧化時，常伴隨著堿性物質的產生，使pH進一步上升。如以醋酸鹽為碳源時，反應如下：CH3COONa+2O22CO2+H2O+NaOH3、有機酸隨著石油工業(yè)的發(fā)展，微生物工業(yè)的碳源也有所擴大。正烷烴（一般指從石油裂解中得到的14-18碳的直鏈烷烴混合物）已用于有機酸、氨基酸、維生素、抗生素和酶制劑的工業(yè)發(fā)酵中。

石油工業(yè)的發(fā)展促使乙醇產量的增加，乙醇代糧發(fā)酵的工藝發(fā)展也十分迅速，自然界中能同化乙醇的微生物和能同化糖質的微生物一樣普遍，種類也相當多，乙醇作碳源其菌體得率比葡萄糖作碳源還高，因而乙醇已成功地應用于發(fā)酵工業(yè)的許多領域中，如利用乙醇生產單細胞蛋白4、烴和醇類二、氮源有機氮源豆餅（粕）粉、花生餅粉、魚粉、蠶蛹粉、酵母粉、玉米漿、尿素等無機氮源銨鹽、硝酸鹽等（由于細胞內的含氮物質都以氨基或亞氨基的形式存在，故銨態(tài)氮可以直接用于合成細胞物質；而硝態(tài)氮需還原成氨后才能被利用）成分黃豆餅粉棉籽餅粉花生餅粉玉米漿魚粉米糠酵母膏蛋白質/%碳水化合物/%脂肪/%纖維/%灰分/%干物/%核黃素/（mg/kg）硫胺素/（mg/kg）泛酸/（mg/kg）尼克酸/（mg/kg）吡哆醇/（mg/kg）生物素/（mg/kg）膽堿/（mg/kg）精氨酸/%胱氨酸/%甘氨酸/%異亮氨酸/%亮氨酸/%賴氨酸/%甲硫氨酸/%苯丙氨酸/%51.0-135.7923.062.414.521--27503.20.62.41.12.53.42.90.641281.5136.5904.414.344---24403.31.02.40.91.52.21.60.545235125.590.55.37.348.4167--16704.60.73123.11.30.6245.8118.8505.730.8874.683.619.40.886290.40.51.10.30.90.10.20.5725.01.5218.193.610.11.1931.414.7-35604.90.83.52.04.56.86.82.51345131416912.642223.2297--12500.50.10.90.20.40.60.50.450-031095-------3.31.4-1.65.56.26.52.1無機氮源和尿素、玉米漿等可被迅速利用，為速效氮；蛋白質氮則需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用，屬遲效氮氮源物質常對培養(yǎng)液pH產生影響(NH4)SO4

2NH3+H2SO4NaNO3+4H2NH3+2H2O+NaOH反應中所產生的NH3被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質。在常用的無機氮中，硫酸銨被菌體利用后會使培養(yǎng)液的pH下降，為生理酸性物質；硝酸鈉被同化時則引起培養(yǎng)液pH上升，為生理堿性物質三、無機鹽和微量元素◆磷酸鹽磷是某些蛋白質和核酸的組成成分磷酸鹽在培養(yǎng)基中還具有緩沖作用微生物對磷的需要量一般為0.005～0.01mol/L常用K3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4◆硫酸鎂Mg2+是許多重要酶（如己糖磷酸化酶、異檸檬酸脫氫酶、羧化酶等）的激活劑鎂離子能提高一些氨基糖苷類抗生素產生菌對自身所產的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、鏈霉素、新生霉素等產生菌。

硫存在于細胞的蛋白質中，是含硫氨基酸的組成成分硫是構成一些酶的活性基硫酸鎂加入培養(yǎng)基中，在堿性條件下會形成氫氧化鎂沉淀，配料時要注意?！翕淃}鉀不參與細胞結構物質的組成是許多酶的激活劑菌體生長所需鉀量約為0.1g/L(以K2SO4計)◆微量元素需量微少，但又不可缺少一般作為碳、氮源的農副產物天然原料中，本身含有，不必另加某些金屬離子，特別是汞離子和銅離子，具有明顯的毒性四、生長因子概念：微生物生長不可缺少的微量有機物質。類別：維生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍生物不是所有微生物都必需的，只是對于某些自己不能合成這些成分的微生物才是必不可少的營養(yǎng)物質。如以糖質原料為碳源的谷氨酸生產菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長因子。又如目前所使用的賴氨酸產生菌幾乎都是谷氨酸產生菌的各種突變株，均為生物素缺陷型，同時也是某些氨基酸如高絲氨酸的缺陷型，需要生物素和某些氨基酸作為生長因子。提供生長因子的農副產品原料1）玉米漿（cornsteepliquor,CSL）

用亞硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的濃縮液，也是玉米淀粉生產的副產品

雖然主要用作氮源，但它含有豐富的氨基酸、核酸、維生素、無機鹽等，常用作為提供生長因子的物質。2）麩皮水解液可代替玉米漿，蛋白質、氨基酸等營養(yǎng)成分比玉米漿少。用量一般為1%（以干麩皮計）左右水解條件：以干麩皮：水：HCl=4.6:26:1配比混合，裝入水解鍋中以0.07～0.08MPa表壓加熱水解70～80min。以干麩皮：水=1：20，用鹽酸調pH值1.0，以0.25MPa表壓加熱水解20min。然后過濾取濾液。3）糖蜜（molasses）

甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米漿，但氨基酸等有機氮含量較低

甘蔗糖蜜用量為0.1%～0.4%4)酵母酵母膏、酵母浸出液、酵母粉5）其他牛肉膏、蛋白胨、動物心、肝等組織浸液等都含有豐富的生長因子五、水生理功能：1）是微生物機體的重要組成部分2）進行代謝反應的介質3）營養(yǎng)物、代謝物、氧氣等必須溶解于水后才能通過細胞表面進行正常的活動；4）水的比熱高，能有效吸收代謝過程中放出的熱，使細胞內溫度不致驟然上升；同時水又是熱的良導體，有利于散熱，可調節(jié)細胞溫度。對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大，特別是水中的礦物質組成對釀酒工業(yè)和淀粉糖化影響甚大。水源質量的主要參數包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質組成和含量。六、前體(precursor)概念：——指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結合到產物分子中去，而其自身的結構并沒有多大變化，但是產物的產量卻因加入前體而又較大的提高。發(fā)現：最早是從青霉素的生產中被發(fā)現的。加入玉米漿后，青霉素單位可從20U/ml增加到100U/ml；玉米漿中含有苯乙胺，它能被優(yōu)先合成到青霉素分子中，從而提高青霉素G的產量。

大多數前體，如苯乙酸對微生物的生長有毒性，以及菌體具有將前體氧化分解的能力，因此在生產中為了減少毒性和增加前體的利用率，常采用少量多次的流加工藝。產品前體青霉素G青霉素V金霉素灰黃霉素紅霉素核黃素類胡蘿卜素L-異亮氨酸L-色氨酸L-絲氨酸苯乙酸及其衍生物苯氧乙酸氯化物氯化物正丙醇丙酸鹽-紫羅酮-氨基丁酸鄰氨基苯甲酸甘氨酸七、促進劑和抑制劑1、促進劑：促進劑是指那些非細胞生長所必需的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產量的添加劑。促進劑不是前體或營養(yǎng)物可影響正常代謝，或促進中間代謝產物的積累，或提高次級代謝產物的產量例如

巴比妥可增加鏈霉素產生菌的抗自溶能力，推遲自溶時間，增加鏈霉素積累。

谷氨酸棒桿菌生