酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

生物化學(xué)酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)化學(xué)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速率的影響酶的抑制作用溫度、pH及激活劑對(duì)酶反應(yīng)的影響目的與要求

重點(diǎn)掌握酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：米氏方程、溫度、pH、激活劑、抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響；掌握三種可逆抑制作用的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。化學(xué)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)各級(jí)反應(yīng)的特征1一級(jí)反應(yīng)t1/2≈0.693/k2二級(jí)反應(yīng)t1/2=1/ka3零級(jí)反應(yīng)t1/2=a/2k

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)速度及其影響因素的科學(xué)。酶促反應(yīng)的影響因素主要包括酶的濃度、底物的濃度、pH、溫度、抑制劑和激活劑等。

1902年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的實(shí)驗(yàn)中觀察到：在蔗糖酶酶的濃度一定的條件下測(cè)定底物（蔗糖）濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,它們之間的關(guān)系呈現(xiàn)矩形雙曲線(rectangularhyperbola)。如下圖所示：一、底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響（一）單底物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

在底物濃度很低時(shí)，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而急驟加快，兩者呈正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。隨著底物濃度的升高，反應(yīng)速度不再呈正比例加快，反應(yīng)速度增加的幅度不斷下降。如果繼續(xù)加大底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。此時(shí)，無(wú)論底物濃度增加多大，反應(yīng)速度也不再增加，說(shuō)明酶已被底物所飽和。所有的酶都有飽和現(xiàn)象，只是達(dá)到飽和時(shí)所需底物濃度各不相同而已。為解釋酶被底物飽和現(xiàn)象，Michaelis和Menten做了大量的定量研究，積累了足夠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，提出了酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程：1、米氏方程的推導(dǎo)根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)：E+SESE+P

k1k2k3k4米氏方程是在三個(gè)假設(shè)的基礎(chǔ)上建立的：1、反應(yīng)初期，產(chǎn)物的生成量極少，E+P→ES可忽略不計(jì)；2、〔S〕>>〔E〕,[S]-[ES]≈[S]3、反應(yīng)系統(tǒng)處于穩(wěn)態(tài)平衡狀態(tài)，即〔ES〕的形成速度等于〔ES〕的分解速度：d〔ES〕/dt＝－d〔ES〕/dtES的形成速度：d〔ES〕/dt＝k1〔E〕〔S〕ES的分解速度：－d〔ES〕/dt＝（k2＋k3）〔ES〕穩(wěn)態(tài)平衡下，k1〔E〕〔S〕＝（k2＋k3）〔ES〕即：〔E〕〔S〕/〔ES〕=（k2＋k3）/k1=Km而〔E〕=[E]t－〔ES〕代入得：

而酶促反應(yīng)的生成速度即是產(chǎn)物的生成速度：VO

＝k3〔ES〕=k3[E]t〔S〕/(Km＋〔S〕)＝Vmax〔S〕/(Km＋〔S〕)其中：Vmax＝k3[E]t即為酶促反應(yīng)可達(dá)到的最大反應(yīng)速度V=Vmax[S]Km+[S]Vmax指該酶促反應(yīng)的最大速度，[S]為底物濃度，Km是米氏常數(shù)，VO是在某一底物濃度時(shí)相應(yīng)的反應(yīng)速度。從米氏方程可知：

當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)[S]<<Km,則V≌Vmax[S]/Km，反應(yīng)速度與底物濃度呈正比;

當(dāng)?shù)孜餄舛群芨邥r(shí)，[S]>>Km，此時(shí)V≌Vmax，反應(yīng)速度達(dá)最大速度，底物濃度再增高也不影響反應(yīng)速度。2.米氏常數(shù)的意義（1）.物理意義：Km值等于酶反應(yīng)速度為最大速度一半時(shí)的底物濃度。（2）.Km值愈大，酶與底物的親和力愈??；Km值愈小，酶與底物親和力愈大。酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達(dá)到最大反應(yīng)速度。（3）.Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)，酶所催化的底物和酶促反應(yīng)條件(如溫度、pH、有無(wú)抑制劑等)有關(guān)，與酶的濃度無(wú)關(guān)。酶的種類不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時(shí)，Km值也不同。各種酶的Km值范圍很廣，大致在10-1～10-6M之間。3.Km在實(shí)際應(yīng)用中的重要意義（1）.鑒定酶：通過(guò)測(cè)定可以鑒別不同來(lái)源或相同來(lái)源但在不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否屬于同一種酶。（2）.判斷酶的最佳底物：如果一種酶可作用于多個(gè)底物,就有幾個(gè)Km值，其中Km最小對(duì)應(yīng)的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L),也可催化棉子糖水解(Km=350mmol/L),兩者相比，蔗糖為該酶的天然底物。（3）.計(jì)算一定速度下的底物濃度：如某一反應(yīng)要求的反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的99%，則[S]=99Km（4）.了解酶的底物在體內(nèi)具有的濃度水平：一般地，體內(nèi)酶的天然底物的[S]體內(nèi)≈Km，如果[S]體內(nèi)<<Km,那么VO

<<Vmax，細(xì)胞中的酶處于“浪費(fèi)”狀態(tài)，反之，[S]體內(nèi)>>Km，那么VO

≈Vmax，底物濃度失去生理意義，也不符合實(shí)際狀態(tài)。（5）.判斷反應(yīng)方向或趨勢(shì)：催化正逆反應(yīng)的酶，其正逆兩向的反應(yīng)的Km不同，可以根據(jù)底物和產(chǎn)物的濃度推測(cè)其反應(yīng)的方向，如果正逆反應(yīng)的底物濃度相當(dāng)，則反應(yīng)趨向于Km小對(duì)應(yīng)底物的反應(yīng)方向。4.Km求法：A。B.。稱為L(zhǎng)ineweaver-Buck方程（或雙倒數(shù)方程）(doublereciprocalplotorLineweaverBurkplot)方程：

用1/V0對(duì)1/[S]的作圖得一直線，其斜率是Km/Vmax,，在縱軸上的截距為1/Vmax,橫軸上的截距為-1/Km。此作圖除用來(lái)求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面還有重要價(jià)值。雙倒數(shù)作圖法（二）雙底物的反應(yīng)雙底物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)1乒乓反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2序列反應(yīng)動(dòng)力學(xué)二.酶濃度的影響在一定溫度和pH下，酶促反應(yīng)在底物濃度大大超過(guò)酶濃度時(shí)，速度與酶的濃度呈正比。酶濃度對(duì)速度的影響機(jī)理：酶濃度增加，[ES]也增加，而V0=k3[ES]，故反應(yīng)速度增加。三.溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響酶促反應(yīng)與其它化學(xué)反應(yīng)一樣，隨溫度的增加，反應(yīng)速度加快?；瘜W(xué)反應(yīng)中溫度每增加10℃反應(yīng)速度增加的倍數(shù)稱為溫度系數(shù)Q10。一般的化學(xué)反應(yīng)的Q10為2～3，而酶促反應(yīng)的Q10為1～2。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度稱為該酶促反應(yīng)的最適溫度（optimumtemperatureTm）.一般動(dòng)物組織中的酶其最適溫度為35～40℃，植物與微生物中的酶其最適溫度為30～60℃，少數(shù)酶可達(dá)60℃以上，如細(xì)菌淀粉水解酶的最適溫度90℃以上。溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響機(jī)理：1.溫度影響反應(yīng)體系中的活化分子數(shù)：溫度增加，活化分子數(shù)增加，反應(yīng)速度增加。2.溫度影響酶的活性：過(guò)高的溫度使酶變性失活，反應(yīng)速度下降。最適溫度不是酶的特征常數(shù)，因?yàn)橐环N酶的最適溫度不是一成不變的，它要受到酶的純度、底物、激活劑、抑制劑、酶反應(yīng)時(shí)間等因素的影響。因此，酶的最適溫度與其它反應(yīng)條件有關(guān)。四.pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響大多數(shù)酶的活性受pH影響顯著，在某一pH下表現(xiàn)最大活力，高于或低于此pH，酶活力顯著下降。酶表現(xiàn)最大活力的pH稱為酶的最適pH(optimumpHpHm)。典型的酶速度-pH曲線是較窄的鐘罩型曲線，但有的酶的速度-pH曲線并非一定呈鐘罩型。如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的速度-pH曲線。胃蛋白酶的速度-溫度曲線如下圖：胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH活性曲線：

pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響機(jī)理：1、pH影響酶和底物的解離:酶的活性基團(tuán)的解離受pH影響，底物有的也能解離，其解離狀態(tài)也受pH的影響，在某一反應(yīng)pH下，二者的解離狀態(tài)最有利于它們的結(jié)合，酶促反應(yīng)表現(xiàn)出最大活力，此pH稱為酶的最適pH；當(dāng)反應(yīng)pH偏離最適pH時(shí)，酶促反應(yīng)速度顯著下降。2、pH影響酶分子的構(gòu)象：過(guò)高或過(guò)低pH都會(huì)影響酶分子活性中心的構(gòu)象，或引起酶的變性失活。

動(dòng)物體內(nèi)多數(shù)酶的最適pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最適pH約1.8，肝精氨酸酶最適pH約為9.8(見(jiàn)下表)。一些酶的最適pH五.激活劑對(duì)酶反應(yīng)速度的影響能使酶活性提高的物質(zhì)，都稱為激活劑(activator)，其中大部分是離子或簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物。如Mg++是多種激酶和合成酶的激活劑，動(dòng)物唾液中的α-淀粉酶則受Cl-的激活。

通常，酶對(duì)激活劑有一定的選擇性，且有一定的濃度要求，一種酶的激活劑對(duì)另一種酶來(lái)說(shuō)可能是抑制劑，當(dāng)激活劑的濃度超過(guò)一定的范圍時(shí)，它就成為抑制劑。

六、抑制劑對(duì)反應(yīng)速度的影響凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑(inhibitor)。使酶變性失活(稱為酶的鈍化)的因素如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等，不屬于抑制劑。通常抑制作用分為可逆性抑制和不可逆性抑制兩類。

（一）不可逆性抑制作用

不可逆性抑制作用的抑制劑，通常以共價(jià)鍵方式與酶的必需基團(tuán)進(jìn)行不可逆結(jié)合而使酶喪失活性。常見(jiàn)的不可逆抑制劑如下圖所示。按其作用特點(diǎn)，又分專一性及非專一性兩種。

1.非專一性不可逆抑制抑制劑與酶分子中一類或幾類基團(tuán)作用，不論是必需基團(tuán)與否，皆可共價(jià)結(jié)合，由于其中必需基團(tuán)也被抑制劑結(jié)合，從而導(dǎo)致酶的抑制失活。某些重金屬(Pb++、Cu++、Hg++)及對(duì)氯汞苯甲酸等，能與酶分子的巰基進(jìn)行不可逆適合，許多以巰基作為必需基團(tuán)的酶(通稱巰基酶)，會(huì)因此而遭受抑制，屬于此種類型。用二巰基丙醇(britishantilewisite,BAL)或二巰基丁二酸鈉等含巰基的化合物可使酶復(fù)活。2.專一性不可逆抑制

此屬抑制劑專一地作用于酶的活性中心或其必需基團(tuán)，進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，從而抑制酶的活性。有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑能專一作用于膽堿酯酶活性中心的絲氨酸殘基，使其磷?；豢赡嬉种泼傅幕钚?。當(dāng)膽堿酯酶被有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑抑制后，乙酰膽堿不能及時(shí)分解成乙酸和膽堿，引起乙酰膽堿的積累，使一些以乙酰膽堿為傳導(dǎo)介質(zhì)的神經(jīng)系統(tǒng)處于過(guò)度興奮狀態(tài)，引起神經(jīng)中毒癥狀。解磷定等藥物可與有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑結(jié)合，使酶和有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑分離而復(fù)活。(二)可逆性抑制

抑制劑與酶以非共價(jià)鍵結(jié)合，在用透析等物理方法除去抑制劑后，酶的活性能恢復(fù)，即抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的。這類抑制劑大致可分為以下二類：

1.競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitiveinhibition)(1)含義和反應(yīng)式抑制劑I和底物S對(duì)游離酶E的結(jié)合有競(jìng)爭(zhēng)作用，互相排斥，已結(jié)合底物的ES復(fù)合體，不能再結(jié)合I。同樣已結(jié)合抑制劑的EI復(fù)合體，不能再結(jié)合S。（2）特點(diǎn)：①抑制劑I與底物S在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似，能與底物S競(jìng)爭(zhēng)酶E分子活性中心的結(jié)合基團(tuán).例如，丙二酸、蘋(píng)果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸的結(jié)構(gòu)相似，是琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。

②抑制程度取決于抑制劑與底物的濃度比、〔ES〕和〔EI〕的相對(duì)穩(wěn)定性；③加大底物濃度，可使抑制作用減弱甚至消除。（3）競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的動(dòng)力學(xué)方程

E+SESE+Pk1k2k3由米氏方程得：Km＝①Ki＝②〔E〕＝〔E〕t－〔ES〕－〔EI〕③〔Ef〕〔S〕〔ES〕〔Ef〕〔I〕〔EI〕EI+Iki1ki2Ki=ki2/ki1解方程①②③得：〔ES〕=〔E〕t

（1+）＋1Km〔S〕〔I〕Ki又因v＝k3〔ES〕,代入上式得：V＝

（1+）＋〔S〕Km〔I〕KiVmax〔S〕競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑雙倒數(shù)曲線，如下圖所示：有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在的曲線與無(wú)抑制劑的曲線相交于縱坐標(biāo)I/Vmax處，但橫坐標(biāo)的截距，因競(jìng)爭(zhēng)性抑制存在變小，說(shuō)明該抑制作用，并不影響酶促反應(yīng)的最大速度Vmax，而使Km值變大。1v＝（1+）KmVmax〔S〕1+Vmax1〔I〕Ki很多藥物都是酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。例如磺胺藥與對(duì)氨基苯甲酸具有類似的結(jié)構(gòu)，而對(duì)氨基苯甲酸、二氫喋呤及谷氨酸是某些細(xì)菌合成二氫葉酸的原料，后者能轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸，它是細(xì)菌合成核酸不可缺少的輔酶。由于磺胺藥是二氫葉酸合成酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，進(jìn)而減少細(xì)菌體內(nèi)四氫葉酸的合成，使核酸合成障礙，導(dǎo)致細(xì)菌死亡?？咕鲂?甲氧芐氨嘧啶(TMP)能特異地抑制細(xì)菌的二氫葉酸還原為四氫葉酸，故能增強(qiáng)磺胺藥的作用?；前匪幬锏囊志饔?.非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(non-competitiveinhibition)(1)含義和反應(yīng)式抑制劑I和底物S與酶E的結(jié)合完全互不相關(guān)，既不排斥，也不促進(jìn)結(jié)合，抑制劑I可以和酶E結(jié)合生成EI，也可以和ES復(fù)合物結(jié)合生成ESI。底物S和酶E結(jié)合成ES后，仍可與I結(jié)合生成ESI，但一旦形成ESI復(fù)合物，再不能釋放形成產(chǎn)物P。（2）特點(diǎn)：