細(xì)胞生物學(xué) 線粒體

第六章線粒體與葉綠體生物能量的轉(zhuǎn)化葉綠體線粒體第一節(jié)線粒體與氧化磷酸化Altmann(1890)、Meves(1904)分別首次在動(dòng)植物細(xì)胞中觀察到線粒體；Michaelis(1900)用JanusgreenB(氧化態(tài)呈淡藍(lán)綠色)對(duì)其進(jìn)行活體染色，證實(shí)其可發(fā)生氧化還原反應(yīng)；Kennedy&Lehninger(1943-1950)證實(shí)其為檸檬酸循環(huán)、氧化磷酸化和脂肪酸氧化的場(chǎng)所；(細(xì)胞組分分離技術(shù))Palade&Sjostrand(1952~1953)觀察到其電鏡下精細(xì)結(jié)構(gòu)；(電鏡技術(shù)）隨后發(fā)現(xiàn)其中存在DNA及轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)。線粒體（mitochondrion）的認(rèn)識(shí)歷程：一線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)

隨細(xì)胞種類(lèi)和生理狀態(tài)變化而變化；外形：線狀、顆粒狀、啞鈴狀、環(huán)形、圓柱形等。大小：直徑為0.5~1μm，長(zhǎng)約2～3μm。顯微鏡下一個(gè)線粒體的變形（一）線粒體的形態(tài)、大小、數(shù)量和分布數(shù)目：動(dòng)物細(xì)胞較植物細(xì)胞多；代謝旺盛的細(xì)胞中較多，人成熟紅細(xì)胞中無(wú)線粒體；分布：集中在細(xì)胞功能旺盛區(qū)域；?遷移時(shí)以微管為導(dǎo)軌、由馬達(dá)蛋白提供動(dòng)力。心肌細(xì)胞精子尾部鞭毛髓部線粒體

（二）線粒體的超微結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)分為4個(gè)部分：外膜(outermembrane)

膜間腔（intermembranespace）內(nèi)膜（innermembrane）基質(zhì)/內(nèi)室（matrix/innerchamber）

電鏡下是由兩層單位膜圍成的封閉囊狀結(jié)構(gòu)1外膜一層厚約6nm的單位膜，包圍在線粒體最外面；脂類(lèi)組成與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相似；含大量孔蛋白(Porin)，允許<10KDa分子通過(guò)，具高通透性，使得膜間隙環(huán)境幾乎與胞質(zhì)溶膠相似。含一些特殊的酶（單胺氧化酶monoamineoxidase)外膜2內(nèi)膜外膜內(nèi)側(cè)的一層單位膜心磷脂（一個(gè)分子含4個(gè)非極性鏈）含量高（達(dá)20%）通透性很低，僅允許不帶電荷的小分子透過(guò),利于ATP形成；含轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸；向內(nèi)折疊形成嵴（cristae），嵴上有基粒。線粒體內(nèi)膜向基質(zhì)側(cè)折疊形成的突起；擴(kuò)大內(nèi)膜表面積（達(dá)5～10倍）,成板層狀或管狀；形態(tài)、數(shù)量因細(xì)胞類(lèi)型而異?；?elementaryparticle)內(nèi)膜和嵴的基質(zhì)面上帶柄的顆粒；由頭部（F1）和基部（F0）構(gòu)成。嵴（cristae）：(F1-F0ATP酶)長(zhǎng)軸垂直板層狀嵴管狀嵴心肌細(xì)胞排列緊密的板層狀嵴縱行排列板層狀嵴

3膜間腔外膜與內(nèi)膜間的空腔，由于外膜通透性很強(qiáng)，而內(nèi)膜的通透性又很低，所以膜間隙中的化學(xué)成分幾乎接近細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，功能是建立和維持H＋梯度。4基質(zhì)（matrix)充斥在內(nèi)膜包圍的嵴外空間（又稱(chēng)內(nèi)室innerchamber）中，內(nèi)有：酶：參與三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化及蛋白合成;基質(zhì)顆粒：內(nèi)含Ca2+、Mg2+、Zn2+等離子；線粒體DNA、RNA及核糖體。二線粒體的化學(xué)組成及酶定位◆蛋白質(zhì)(干重的65～70％)◆脂類(lèi)(干重的25～30％)：·磷脂占3/4以上，外膜主要是卵磷脂，內(nèi)膜主要是心磷脂。

·脂類(lèi)/蛋白質(zhì):◆核酸：DNA、RNA和tRNA

內(nèi)膜：0.3:1；外膜：1:1

線粒體組分的分離技術(shù)低滲處理一定轉(zhuǎn)速下離心，上清液為膜間腔組分膜間腔組分轉(zhuǎn)入高滲溶液使其回縮密度梯度離心，分離外膜去垢劑（Lubrol）裂解內(nèi)膜并離心內(nèi)膜基質(zhì)外膜線粒體主要酶的分布（第一個(gè)為各部分標(biāo)志酶）三線粒體的功能氧化磷酸化:糖、脂和氨基酸徹底氧化放能；參與氧自由基ROS的生成；參與細(xì)胞程序性死亡(通過(guò)開(kāi)啟內(nèi)膜上非特異性通道而改變線粒體通透性實(shí)現(xiàn))；胞內(nèi)Ca++調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等；線粒體的存在狀況反映了細(xì)胞對(duì)能量的需求生物氧化的分區(qū)和定位多糖、蛋白和脂肪最初的分解（細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)）TCA循環(huán)(線粒體基質(zhì))電子傳遞、氧化磷酸化

(線粒體內(nèi)膜)氧化磷酸化過(guò)程是能量轉(zhuǎn)換過(guò)程，即有機(jī)分子中的能量高能電子質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)ATP（一）氧化磷酸化作用的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)氧化(電子傳遞、消耗氧,放能)與磷酸化(ADP+Pi，儲(chǔ)能)同時(shí)進(jìn)行，密切偶連，分別由兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)體系執(zhí)行。尿素或胰蛋白酶超聲波光滑線粒體小泡電子傳遞＋ATP合成－ATP酶活性－F1顆粒電子傳遞－ATP合成－ATP酶活性＋重組顆粒電子傳遞＋ATP合成＋ATP酶活性－亞線粒體顆粒電子傳遞＋ATP合成＋ATP酶活性－分離顆粒電子傳遞＋ATP合成－ATP酶活性＋完整線粒體電子傳遞＋ATP合成＋電子傳遞鏈(electron-transportchain):由供體到受體進(jìn)行電子傳遞的一組電子載體，鏈上每一步都伴隨能量釋放。1）呼吸鏈的氧化還原酶系：煙酰胺脫氫酶；黃素相關(guān)的脫氫酶/黃素蛋白；鐵硫蛋白(iron-sulfurprotein);泛醌/輔酶Q(ubiquinone/CoQ):Q,QH2,QH細(xì)胞色素(cytochrome，Cyt)：以鐵卟啉為輔基。1電子傳遞鏈(呼吸鏈)的組成2）電子傳遞鏈的四種復(fù)合物(哺乳類(lèi))◆復(fù)合物Ⅰ：NADH-CoQ還原酶復(fù)合物（電子傳遞體和H+移位體）組成：含42個(gè)亞基，至少6Fe-S中心和1黃素蛋白。作用：氧化NADH，將2e-CoQ；泵出4H+◆復(fù)合物Ⅱ：琥珀酸脫氫酶復(fù)合物（電子傳遞體而非H+移位體）組成：含F(xiàn)AD輔基，2Fe-S中心，1Cytb作用：氧化琥珀酸，2e-FADFe-SCoQ◆復(fù)合物Ⅲ：細(xì)胞色素bc1復(fù)合物（電子傳遞體和H+移位體）

組成：二聚體，單體含1cytc1、2cytb、1Fe-S蛋白

作用：催化CoQ氧化,2e-cytc；泵出4H+(2個(gè)來(lái)自UQ，2個(gè)來(lái)自基質(zhì)）◆復(fù)合物Ⅳ：Cytc氧化酶（電子傳遞體和H+移位體）組成：二聚體，單體含1cyta,1cyta3和2Cu

作用：氧化cytc,2e-O2,泵出2H+，3）呼吸鏈的電子傳遞及其抑制劑和作用部位魚(yú)藤酮×抗霉素A××氰化物疊氮鈉CO氧化還原電勢(shì)琥珀酸脫氫酶通過(guò)電子傳遞鏈實(shí)現(xiàn)了跨膜的H＋濃度差的多亞基蛋白復(fù)合物，由水溶性F1頭部和疏水性F0基部所組成，也叫F1F0ATPase。線粒體基質(zhì)膜間腔2ATP合成酶(ATPsynthase)F0F1：親水性頭部，易分離，催化ATP水解,含3α、3β、γ、δ和ε；

β:催化ATP合成/水解；

ε:抑制ATP水解,堵塞H＋通道；F0：疏水性基部，傳送H＋到F1,含1a,2b,10-14c。

a:H＋通道；“轉(zhuǎn)子”：γ，ε“定子”：

a，b，δ

γ亞單位包含一個(gè)彎曲的螺旋環(huán)，由其組成“軸”插入由α和

β組成的環(huán)中.F1ATPase的晶體結(jié)構(gòu)α,β,γ,δ,ε

ATP合成酶是一個(gè)可逆的偶聯(lián)裝置，它可利用質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)合成ATP，又可利用ATP水解的能量將質(zhì)子由基質(zhì)中泵出內(nèi)膜

（二）氧化磷酸化偶聯(lián)機(jī)制

氧化電子傳遞鏈磷酸化ATP合成酶

1953年由SlaterE.C.提出“化學(xué)偶聯(lián)學(xué)說(shuō)”。1961年MitchellP.提出“化學(xué)滲透假說(shuō)”。1964年BoyerP.D.提出“構(gòu)象假說(shuō)”。至20世紀(jì)70年代，化學(xué)滲透假說(shuō)在取得大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)的基礎(chǔ)上，成為氧化磷酸化作用中較為流行的一種假說(shuō)。

化學(xué)滲透假說(shuō)主要內(nèi)容

在呼吸鏈電子傳遞過(guò)程中，通過(guò)線粒體內(nèi)膜上呼吸鏈組分間氫與電子的交替?zhèn)鬟f，使H+從內(nèi)膜內(nèi)側(cè)向外側(cè)定向轉(zhuǎn)移。由于線粒體內(nèi)膜對(duì)H+高度不通透，造成內(nèi)膜兩側(cè)跨膜質(zhì)子梯度，形成質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)

(H+濃度差&膜電位)。其中蘊(yùn)藏的能量驅(qū)使H+穿過(guò)ATP合酶，驅(qū)動(dòng)ADP與Pi形成ATP。

電子傳遞鏈可作為質(zhì)子泵，將線粒體基質(zhì)中的H+泵至膜間腔膜內(nèi)外質(zhì)子濃度差和電勢(shì)差構(gòu)成質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)，驅(qū)動(dòng)質(zhì)子穿過(guò)ＡＴＰ酶，促使ＡＴＰ合成；化學(xué)滲透假說(shuō)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)：細(xì)菌視紫紅質(zhì)質(zhì)子泵·ATP合成動(dòng)力為質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)·完整性膜是維持質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)的前提；

·電子傳遞和ATP合成是相關(guān)但又不同的事件。?去垢劑ATP酶加入磷脂并去除去垢劑脂質(zhì)體（三）ATP合成酶作用機(jī)制以PDBoyer為代表，提出了通過(guò)ATP合酶合成ATP的“結(jié)合變化”(bindingchangemechanism)和“旋轉(zhuǎn)模型”(rotationalmodel)。內(nèi)容：ATP合酶3個(gè)β亞基各具一定構(gòu)象，不同構(gòu)象與核苷酸親和力不同。H+流驅(qū)動(dòng)γ和ε旋轉(zhuǎn)1200的情況下，3β亞基構(gòu)象發(fā)生相互轉(zhuǎn)變，引起β亞基對(duì)ATP、ADP和Pi親和力的改變，使ATP合成和釋放。P．D．Boyer和J．E．Walker榮獲1997年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)(各1/4，另1/2由Na+-K+泵學(xué)說(shuō)提出者獲得)。a和c產(chǎn)生/失去瞬間鹽橋

c的Asp結(jié)合/解離H+c極性環(huán)和轉(zhuǎn)子結(jié)合/分離產(chǎn)生扭力距使轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)H+

通過(guò)a和c亞基形成的通道，推動(dòng)轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)推動(dòng)H+沿膜間腔Ic-AspII流動(dòng)，驅(qū)動(dòng)c和γ旋轉(zhuǎn)；象水輪發(fā)電機(jī)一樣工作。ArgH+通IIH+通道I結(jié)合變化機(jī)制：β三種狀態(tài):O空置狀態(tài)T緊密結(jié)合態(tài)L松散結(jié)合態(tài)γ和ε的轉(zhuǎn)動(dòng)引起β構(gòu)象變化，催化ATP生成ATPADP＋Pi在嗜熱菌的F1ATPaseβ的N端添加10個(gè)His，固定在Ni-NTA膜上；將γN端的一個(gè)Ser換為Cys，以連上肌動(dòng)蛋白絲(熒光標(biāo)記)；加ATP后可觀察到肌動(dòng)蛋白絲旋轉(zhuǎn)；NojiHetal.1997,Nature轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)的試驗(yàn)學(xué)證據(jù)：四半自主性的細(xì)胞器—線粒體線粒體是一個(gè)含有DNA并能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的細(xì)胞器。線粒體中含有DNA、mRNA、tRNA、核糖體、氨基酸活化酶等。1966年Slonimski證明了線粒體DNA具有遺傳功能，被認(rèn)為是真核細(xì)胞的第二遺傳系統(tǒng)。1線粒體DNA的結(jié)構(gòu)

線粒體DNA(簡(jiǎn)稱(chēng)mtDNA)較小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，位于線粒體基質(zhì)中和線粒體內(nèi)膜上。不含組蛋白，呈環(huán)形，與細(xì)菌基因組相似。哺乳動(dòng)物線粒體基因組大小為16500堿基對(duì)(bp)。2線粒體基因組編碼的RNA和蛋白質(zhì)線粒體DNA轉(zhuǎn)錄的rRNA、tRNA均通過(guò)線粒體核糖體用于合成線粒體蛋白質(zhì)（數(shù)目有限）。真核生物線粒體核糖體的RNA組分和蛋白質(zhì)的構(gòu)成、大小及對(duì)抗生素敏感性方面均不同于細(xì)胞質(zhì)核糖體，但某些方面類(lèi)似原核生物核糖體。線粒體中的多數(shù)蛋白由核基因編碼、在細(xì)胞質(zhì)核糖體中合成。故線粒體基因在轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯過(guò)程中受核基因控制，對(duì)核基因具很大依賴(lài)性。

3線粒體蛋白的跨膜分選在游離核糖體合成，以包含“成熟”蛋白和N端導(dǎo)肽

(1eaderpeptide)的前體

(precursor)存在。導(dǎo)肽引導(dǎo)蛋白通過(guò)內(nèi)外膜的接觸點(diǎn)進(jìn)入線粒體，指導(dǎo)蛋白進(jìn)入線粒體特定部位后被切除。蛋白前體跨膜時(shí)需解折疊(unfolding)；跨膜后需重新折疊(refolding)，需“分子伴侶”參與。導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)特點(diǎn)常疏水,由非電負(fù)性氨基酸構(gòu)成，中間有堿性氨基酸，但無(wú)酸性氨基酸;(線粒體基質(zhì)帶負(fù)電荷)羥基氨基酸含量高（特別是Ser），易形成雙親螺旋;不同導(dǎo)肽缺乏同源性，和識(shí)別有關(guān)的信號(hào)不是一級(jí)結(jié)構(gòu)，而是二、三級(jí)結(jié)構(gòu);導(dǎo)肽運(yùn)送蛋白質(zhì)時(shí)具有以下特點(diǎn):①需受體;②消耗ATP;③需分子伴侶;④由電化學(xué)梯度驅(qū)動(dòng);⑤導(dǎo)肽被切除;⑥通過(guò)接觸點(diǎn)進(jìn)入;⑦解折疊形式運(yùn)輸。

線粒體內(nèi)外膜的接觸點(diǎn)

位于N端，富含帶正電荷和疏水的氨基酸，形成兩性α螺旋，完成轉(zhuǎn)運(yùn)后被切除。

不被切除，含疏水性停止轉(zhuǎn)移序列，被安插到外膜。被切除，含疏水性的停止轉(zhuǎn)移序列，被安插到內(nèi)膜。

含兩個(gè)信號(hào)序列，先到基質(zhì)，第一個(gè)信號(hào)被切除，第二個(gè)信號(hào)引導(dǎo)入內(nèi)膜或膜間隙。結(jié)構(gòu)類(lèi)似于N端信號(hào)序列，但位于蛋白質(zhì)內(nèi)部。

膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具多個(gè)內(nèi)部信號(hào)序列和停止轉(zhuǎn)移序列，形成多次跨膜蛋白。基質(zhì)外膜內(nèi)膜內(nèi)膜膜間隙內(nèi)膜內(nèi)膜信號(hào)序列

定位線粒體蛋白分選信號(hào)

進(jìn)入線粒體不同部位的蛋白具有不同的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑：

1）外膜蛋白：具不被切除的N端信號(hào)序列和疏水的停止轉(zhuǎn)移序列，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體安裝到外膜上(孔蛋白)；

2）基質(zhì)蛋白：通過(guò)線粒體內(nèi)外膜之間的接觸點(diǎn)，由質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)提供的能量跨越內(nèi)膜進(jìn)行運(yùn)送。3）進(jìn)入線粒體內(nèi)膜和膜間腔的蛋白①N端具2個(gè)信號(hào)，先被運(yùn)到基質(zhì)后導(dǎo)肽被切除，暴露出第2個(gè)信號(hào)序列，指導(dǎo)其插入內(nèi)膜。②具導(dǎo)肽和可結(jié)合膜上的通道復(fù)合體的停止轉(zhuǎn)移序列，前者被切除，后者脫離通道復(fù)合體進(jìn)入內(nèi)膜(B)，若其被切除，則