雙重或多重免疫組化標(biāo)記課件

第六章雙重或多重免疫組化標(biāo)記(p111)一、基本原理

雙重或多重標(biāo)記是利用免疫學(xué)和細(xì)胞化學(xué)原理，在同一張切片上同時(shí)采用或先后采用不同顏色的熒光色素或酶促產(chǎn)物，或采用不同直徑大小顆粒膠體金來原位示蹤組織或細(xì)胞內(nèi)不同抗原大分子物質(zhì)的一項(xiàng)標(biāo)記染色技術(shù)。由于此項(xiàng)技術(shù)可在同一張切片上同時(shí)顯示兩種或兩種以上不同抗原成分(定性、定位、定量)，因而使組織內(nèi)不同抗原成分相互間功能關(guān)系的觀察更加直觀，操作需遵循的原則和要求基本上與單標(biāo)免疫組化方法雷同，但差異是流程長，脫片機(jī)率更高，前后重染色試劑間有交叉干擾等。二、技術(shù)類型（一）雙重或多重免疫熒光標(biāo)記染色采用呈現(xiàn)不同顏色的熒光色素配伍，分別標(biāo)記不同的抗體，再通過各自與同一切片上的相應(yīng)抗原特異性結(jié)合而加以區(qū)別顯示所建立起來的雙重或多重免疫組化染色技術(shù)。

熒光素配伍：異硫氰酸熒光素(FITC）——翠綠色，常與羅丹明(RB200)或異硫氰酸四甲基羅丹明（TRITC）配伍，后者呈紅色。

方法敏感、特異，需選用各自特定的激發(fā)濾光片分別觀察或二次曝光顯影，樣本不能長期保存，組織結(jié)構(gòu)背景不清晰。同種動物抗體多分別應(yīng)用，操作步驟加倍，脫片機(jī)率相對較高，前后重免疫熒光標(biāo)記交叉重疊機(jī)會多，需用酸性洗脫或多聚甲醛蒸氣處理。

操作舉例：垂體腺瘤----ACTH與GH雙重免疫熒光標(biāo)記染色（間接法）(1)石蠟切片，厚5μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4,0.01mol/L)。(2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min（亦可用10％正常羊血清代之），不洗。(3)抗ACTH血清（McAb）1:200，孵育30min37℃，濕盒。(4)0.05mol/LTBS(pH7.4,內(nèi)含1％Triten×100,下同)洗，10min×3。(7)切片逐級酒精脫水，二甲苯透明，空氣干燥后，置于裝有多聚甲醛粉末的密閉容器內(nèi)，放在80℃烤箱或溫箱內(nèi)以甲醛蒸氣固定2～4h，使第一重染色中二抗的抗原結(jié)合部位失活。(8)切片以TBS洗，5min×4(9)1％HSA（或10％正羊血清）孵育30min，室溫，濕盒，不洗。(10)抗GH血清(McAb)1:400，孵育30min，37℃，濕盒。(11)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×3(12)羊抗鼠IgG-FITC1:100,濕盒，室溫避光反應(yīng)1h。(13)0.05mol/LTBS(pH7.4)洗，10min×3(第二重GH-FITC標(biāo)記染色完成)。(14)緩沖甘油封片。(16)用彩色底片對切片同一部位用546nm及490nm波長激發(fā)光分別作兩次曝光，即可在同一張照片上顯示不同顏色標(biāo)示的ACTH與GH兩種抗原。TRITC-GAMIgG鼠抗人ACTH（IgG）TITC-GAMIgG鼠抗人GH（IgG）T游離FabTTTFGH抗原ACTH抗原FFab被滅活圖1同種動物抗體間接法（分步固定）雙重免疫熒光熒色原理（二）雙重或多重免疫酶標(biāo)記染色以酶催化不同底物呈現(xiàn)不同顏色產(chǎn)物標(biāo)示同一切片內(nèi)兩種或兩種以上抗原為理論基礎(chǔ)所建立起來的多重免疫標(biāo)記染色方法。特點(diǎn)是光鏡下可以同時(shí)觀察和對比，樣品保存時(shí)間相對較長，一次曝光即可成像，故較雙重免疫熒光染色法更為常用。雙酶雙底物--HRP(DAB):AP(萘酚AS.MX-堅(jiān)固藍(lán))HRP(4CN):AP(萘酚AS.MX-堅(jiān)固紅)（直接法、間接法、橋法均可使用，靈敏度以橋法中的復(fù)合物法最高，特異性則以直接法最佳）操作方法類同單酶標(biāo)記，有直接法、間接法、復(fù)合物法之分。間接法與復(fù)合物法較常采用?！锊僮髋e例淋巴瘤輕鏈κ、λ的雙重酶標(biāo)記（雙酶雙底物）(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟進(jìn)水（若用含汞固定液固定的組織則需用0.5%碘的乙醇溶液脫汞5min，乙醇濃度為70％，經(jīng)自來水洗后，以2.5%硫代硫到鈉浸洗1min，水洗)；(2)0.3%H2O2甲醇液浸泡切片30min,自來水洗，蒸餾水洗,入PBS(0.01mol/LpH7.2);(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，溫盒，37℃，30min；(7)PBS洗，5min×3;(8)加酶抗酶抗體復(fù)合物(兔PAP＋鼠APAAP混合液1:100)，濕盒，37℃，30min；(9)PBS洗，5min×3；(10)過氧化物酶顯色反應(yīng)：以DAB-H2O2液顯色7～10min(鏡下控制顯色程度)，PBS洗，5min×3；(11)鹼性磷酸酶顯色反應(yīng)：以萘酚AS.MX及堅(jiān)固藍(lán)(fastblue)顯色10～15min(鏡下控制顯色程度)，PBS洗、自來水洗；(12)緩沖甘油封片，光鏡下觀察PPPAAAκλ圖2雙酶雙底物(復(fù)合物法)雙重酶標(biāo)染色原理兔PAPGARIgG兔抗KAg鼠APAAPGAM.IgG鼠抗人（三）雙重及多重免疫金標(biāo)記(電鏡）電鏡下的雙重免疫標(biāo)記染色不是靠顏色區(qū)分，而是靠標(biāo)記物的不同電子密度或顆粒的不同大小來區(qū)別不同抗原，有別于光鏡下的雙重免疫標(biāo)記方法。常用的方法多為雙重免疫金標(biāo)記

優(yōu)點(diǎn)：高電子密度，分辨率高，抗原定位精確，顆粒大小可人工控制，標(biāo)記試劑易制備。

缺點(diǎn)：試劑質(zhì)量要求高，非特異吸附干擾大(背景)類型有直接法、間接法（異種動物抗體或同種動物抗體）----雙面染色，分步固定。標(biāo)記用的膠體金顆粒，直徑多采用5nm,15nm組合，標(biāo)記不同類別抗體(特異性一抗---直接法，間接抗體---間接法)。應(yīng)用直接法進(jìn)行多標(biāo)，簡便、快速、準(zhǔn)確、效果佳，尤多用于細(xì)胞表面抗原的雙重或多重標(biāo)記。缺點(diǎn)：敏感性較低，金標(biāo)抗體純度要求高。金標(biāo)抗體雙重抗原標(biāo)記常用間接法顯示，且多采用異種動物抗體混合同步操作。優(yōu)點(diǎn)：敏感性提高，操作步驟減少缺點(diǎn)：標(biāo)記二抗質(zhì)量要求高，背景染色深?？赏ㄟ^采用固相吸附或過量二抗封閉，或用多聚甲醛蒸氣處理，使二抗的游離抗原結(jié)合部位（Fab段）滅活加以克服。

*舉例：垂體組織生長激素(GH)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)雙重免疫電鏡染色(間接法)----分步固定。(1)取新鮮垂體腺瘤組織1mm3，蒸餾水洗，不經(jīng)餓酸固定，常規(guī)酒精脫水，用Lowicrylk4M包埋，超薄切片厚40nm，置無支持膜的鎳網(wǎng)上；(2)以0.05mol/LTBS(pH7.4含1％TritonX-100，下同)，浸洗5min；(3)加入1％HSA5min；不洗；(4)以兔抗ACTH血清(1:200)孵育，4℃，20h，室溫下2h，TBS洗，用上述一抗重復(fù)孵育1次，TBS噴射沖洗，然后浸洗10min，3次，TBS(pH8.2)浸洗5min；(5)0.02mol/LTBS(pH8.2)浸洗5min；(6)1％HSA孵育5min，不洗；再以5nm膠體金標(biāo)記的羊抗兔，IgG孵育10min；0.02mol/LTBS(pH8.2)噴射沖洗，0.05mol/LTBS(pH7.4)沖洗及浸洗，時(shí)間同前；(7)蒸餾水浸洗后，空氣中干燥；(8)置盛有多聚甲醛粉末的密閉容器內(nèi)，80℃溫箱中以多聚甲醛蒸氣處理1h，冷卻取出，入蒸餾水，換洗2次。(9)再按(4)----(8)步驟作第二重抗原染色，這次一抗用鼠抗GH單克隆抗體(1:400)；二抗用15nm膠體金標(biāo)記的羊抗鼠IgG，在二抗孵育并清洗后，入2％的戊二醛及3％多聚甲醛的TBS(pH7.4)溶液中固定30min，經(jīng)蒸餾水換洗3次，再以1％醋酸鈾和構(gòu)櫞酸鉛作常規(guī)電子密度的染色。(10)電鏡觀察結(jié)果：見ACTH細(xì)胞和GH細(xì)胞的分泌顆粒分別被5nm和15nm的膠體金顆粒所顯示，除很少量背景染色外，標(biāo)記位置精確，無交叉重疊與彌散現(xiàn)象。（四）其它雙重標(biāo)記法

1.免疫熒光法與免疫酶法聯(lián)合應(yīng)用(先酶標(biāo)

后熒光)；

2.免疫熒光法與免疫金銀法聯(lián)合應(yīng)用(先免疫金銀標(biāo)記后熒光標(biāo)記)；

3.免疫酶法與免疫金法聯(lián)合應(yīng)用(20nm,紅

色），此法忌用銀液放大，易吸附干擾；

4.免疫金銀法與免疫酶法聯(lián)合應(yīng)用(對比明

顯)。

三、注意事項(xiàng)

1.標(biāo)記染色的順序確定需視組織標(biāo)記抗原的性質(zhì)，量少、脆弱先標(biāo)記，量多、耐受后標(biāo)記。

2.結(jié)構(gòu)保存與抗原保護(hù)并重，電鏡樣品一般忌用餓酸后固定，PG固定液