青霉素的生產(chǎn)工藝流程教材

包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物制藥的生產(chǎn)工藝主講人：楊紫團(tuán)隊(duì)人員：張?chǎng)?、汪洋知識(shí)目標(biāo)：

掌握?-內(nèi)酰胺類抗生素的理化性質(zhì)掌握發(fā)酵生產(chǎn)青霉素的條件控制，及青霉素提取與精制的控制點(diǎn)。能力目標(biāo)：通過實(shí)訓(xùn)，熟悉工業(yè)生產(chǎn)青霉素的工藝流程并熟悉基本操作重點(diǎn):掌握發(fā)酵生產(chǎn)青霉素的工藝流程難點(diǎn):青霉素提取與精制的控制點(diǎn)青霉素青霉素又被稱為青霉素G、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀等。青霉素是抗菌素的一種，能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁（革蘭氏陽性菌）并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素。青霉素是β-內(nèi)酰胺類抗生素的典型代表。青霉素結(jié)構(gòu)?-內(nèi)酰胺類抗生素是分子中含有?-內(nèi)酰胺環(huán)的一類天然和半合成抗生素的總稱。作用機(jī)制細(xì)胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽類似物競(jìng)爭性與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯(lián)。生長中的細(xì)胞有效，靜止細(xì)胞無效高效、安全的抗細(xì)菌感染藥物臨床應(yīng)用（1）臨床抗感染治療：大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體等。毒性小，但需要皮試。（2）各種半合成抗生素的原料：氨芐青霉素，磺芐青霉素，乙氧萘青霉素，頭孢菌素母核。青霉素的性質(zhì)1、穩(wěn)定性固體青霉素鹽的穩(wěn)定性與其含水量和純度有很大的關(guān)系；2、溶解度青霉素游離酸在水中溶解度很小，易溶于有機(jī)溶劑如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和乙醚中，而其鉀鹽、鈉鹽易溶于水和甲醇，可溶于乙醇3、降解反應(yīng)：

青霉素是很不穩(wěn)定的化合物，遇酸堿或加熱易分解而失去活性，并發(fā)生分子重排。4、紫外吸收5、過敏反應(yīng)青霉素生產(chǎn)菌的生物特性：產(chǎn)黃青霉：Penicilliumchrosogenum孢子:綠色和黃色菌落：平坦或皺褶，圓形青霉穗:分生孢子鏈狀深層培養(yǎng)菌絲：球狀和絲狀兩種。青霉素發(fā)酵酵工藝1.發(fā)酵工工藝流程（a）最早早發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)產(chǎn)生青霉素素的原始菌種是是點(diǎn)青霉菌菌，生產(chǎn)能能力很低，不能能滿足工業(yè)業(yè)生產(chǎn)要求求，所以被淘汰汰?，F(xiàn)在主主要采用的的的產(chǎn)黃青霉菌菌。（b）為了了提高產(chǎn)黃黃青霉的青青霉素產(chǎn)量量使用的誘變變劑如：二二環(huán)氧丁烷烷、甲磺酸乙酯酯、乙烯亞亞胺、亞硝硝酸、X射線等。。（1）菌種種：（2）孢子子制備將沙土孢子子先在用甘甘油、葡萄萄糖、蛋白白胨組成的的培養(yǎng)基進(jìn)進(jìn)行斜面培培養(yǎng)，經(jīng)傳傳代活化。。最適生長長溫度25~26oC，培養(yǎng)養(yǎng)6~8天天，得單菌菌落，再傳傳斜面，培培養(yǎng)7天，，制得斜面面孢子。再再移植到優(yōu)優(yōu)質(zhì)小米或或大米固體體培養(yǎng)基上上，25ooC，相對(duì)對(duì)濕度45%-50%，生長長7天，制制得小米孢孢子。孢子子成熟后進(jìn)進(jìn)行真空干干燥，低溫溫保存?zhèn)溆糜?。種子罐培養(yǎng)養(yǎng)工藝一級(jí)種子發(fā)發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢孢子萌發(fā)，，形成菌絲絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉玉米漿，碳碳酸鈣，玉玉米油消沫劑等；；接種量:>200億孢孢子/t培培養(yǎng)基空氣流量:1：3（m3/m3··min））；攪拌轉(zhuǎn)速:300-350r/min；；pH:自然；溫度：25±0.5℃；時(shí)間:68h。二級(jí)種子罐罐：繁殖罐，大大量繁殖。。培養(yǎng)基：葡萄糖、玉玉米漿，玉玉米油，消消沫劑等；；接種量：10％；空氣流量：：1:1-1.5（（m3/m3··min）；攪拌轉(zhuǎn)速：：250-280r/min；；pH：自然；溫度：25±1℃℃；時(shí)間：180-193h；生產(chǎn)罐培養(yǎng)養(yǎng)工藝三級(jí)罐：生產(chǎn)罐；培養(yǎng)基：花生餅粉，，葡萄糖，，硫酸銨，硫硫代硫硫酸鈉，苯苯乙酰胺，，CaCO3,玉玉米油.溫度控制適宜菌絲生生長溫度一般為25oC，分泌青霉素素20℃20℃青霉霉素破壞少少，周期很很長。變溫控制，，不同階段段不同溫度度。生長階段:較高溫度度，縮短生生長時(shí)間；；生產(chǎn)階段段適當(dāng)降低低溫度，以以利于青霉霉素合成。。前期期控控制制25℃左左右右，，后后期期降降溫溫控控制制22℃pH控控制制合成成適適宜宜pH6.4－－6.6左左右右，，避避免免超超過過7.0直接接加加酸酸或或堿堿：：自自動(dòng)動(dòng)控控制制流加加葡葡萄萄糖糖：：恒恒速速；；變變速速，，依依賴賴pH變變化化快快慢慢。。pH下下降降：：補(bǔ)補(bǔ)加加CaCO3、、通通氨氨、、尿尿素素或或提提高高通通氣量量pH上上升升：：補(bǔ)加加糖糖、生生理理酸酸性性物物質(zhì)質(zhì)（（硫硫酸酸銨銨、、油油脂脂））恒速速補(bǔ)補(bǔ)糖糖，，用用酸酸或或堿堿控控制制方式式根據(jù)據(jù)pH補(bǔ)補(bǔ)糖糖溶氧氧控控制制＜30％％飽飽和和度度，，產(chǎn)產(chǎn)率率急急劇劇下下降降；；＜10％％，，造造成成不不可可逆逆的的損損害害。。臨界界溶溶氧氧濃濃度度：：30％％。。通氣氣比比：：1：：0.8－－1.5。。適宜宜的的攪攪拌拌速速度度:保保證證氣氣液液混混合合，，提提高高溶溶氧氧各階階段段的的供供氧氧比比較較菌絲絲生生長長速速度度與與形形態(tài)態(tài)、、濃濃度度發(fā)酵酵穩(wěn)穩(wěn)定定期期，，濕濕菌菌濃濃度度可可達(dá)達(dá)15%~20%，，絲絲狀狀菌菌干干重重約約3%，，球球狀狀菌菌干干重重在在5%左左右右。。在在發(fā)發(fā)酵酵中中后后期期一一般般每每天天放放一一次次，，每每次次放放掉掉總總發(fā)發(fā)酵酵液液的的10%左左右右。。消沫沫天然然油油脂脂：：玉玉米米油油前期期:主主間間歇歇攪攪拌拌,少少加加油油中期期:攪攪拌拌、、加加油油、、稍稍微微降降低低通通氣氣量量（（必必要要時(shí)時(shí)））策略略：：少少量量多多次次。。后期期:盡盡量量少少加加消消沫沫劑劑青霉霉素素的的發(fā)發(fā)酵酵過過程程控控制制十十分分精精密密，，一一般般2小小時(shí)時(shí)取取樣樣一一次次，，測(cè)測(cè)定定發(fā)發(fā)酵酵液液的的ＰＰＨＨ、、菌菌濃濃、、殘殘?zhí)翘?、、青青霉霉素素效效價(jià)價(jià)等等指指標(biāo)標(biāo)，，同同樣樣取取樣樣做做無無菌菌檢檢查查，，發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)染染菌菌立立即即結(jié)結(jié)束束發(fā)發(fā)酵酵，，視視情情況況過過濾濾提提取取，，因因?yàn)闉槿救揪蠛螅校校龋炔ú▌?dòng)動(dòng)大大，，青青霉霉素素在在幾幾個(gè)個(gè)小小時(shí)時(shí)內(nèi)內(nèi)就就會(huì)會(huì)被被全全部部破破壞壞。。提煉煉工工藝藝過過程程１．．青霉霉素素不不穩(wěn)穩(wěn)定定，，遇遇酸酸、、堿堿、、熱熱分分解解失失活活２．．水溶溶液液中中不不穩(wěn)穩(wěn)定定，，非非極極性性溶溶劑劑中中穩(wěn)穩(wěn)定定３．．易溶溶于于有有機(jī)機(jī)溶溶劑劑，，水水中中溶溶解解度度很很小?。矗嗝姑顾厮佧}鹽很很穩(wěn)穩(wěn)定定；；降降解解產(chǎn)產(chǎn)物物具具有有致致敏敏性性５．．防止止降降解解，，條條件件溫溫和和、、快快速速。。預(yù)處處理理青霉素素的存存在部部位：：發(fā)酵酵液濃度較較低：：10－30Kg/M3含有大大量雜雜質(zhì)：：菌體體細(xì)胞胞、核核酸、、雜蛋蛋白質(zhì)質(zhì)、細(xì)細(xì)胞壁壁多糖糖等、、殘留留的培培養(yǎng)基基、色色素、、鹽離離子、、代謝謝產(chǎn)物物等目的：：濃縮縮目的的產(chǎn)物物，去去除大大部分分雜質(zhì)質(zhì)，改改變發(fā)發(fā)酵液液的流流變學(xué)學(xué)特征征，利利于后后續(xù)的的分離離純化化過程程。預(yù)處理理:發(fā)發(fā)酵液液加少少量絮絮凝劑劑沉淀淀蛋白白過濾鼓式真真空過過濾機(jī)機(jī)過濾濾：一次濾濾液：：pH6.2-7.2，，略渾渾，棕棕黃或或綠色色，蛋蛋白質(zhì)質(zhì)含量量0.5-2.0%。。板框式式過濾濾機(jī)過過濾：：硫酸調(diào)調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加加入0.07%溴代代十五五烷吡吡啶，，0.07%硅硅藻土土為助助慮劑劑。二次濾濾液：：澄清清透明明，用用于提提取（（收率率90％））溶劑萃萃取原理：：青霉霉素游游離酸酸易溶溶于有有機(jī)溶溶劑，，而霉霉素鹽鹽易溶溶于水水。萃取劑劑：青青霉素素分配配系數(shù)數(shù)高的的有機(jī)機(jī)溶劑劑。工業(yè)上上通常常用：：醋酸酸丁酯酯和醋醋酸戊戊酯。。除去蛋蛋白質(zhì)質(zhì)：加加0.05-0.1%乳乳化劑劑PPB。。萃?。海?－－3次次。逆流萃萃取過過程正相萃萃?。海核峄痯H1.8-2.0，，濾液液：醋醋酸丁丁酯＝＝1：：0.3，，碟片片式離離心機(jī)機(jī)分離離（濃濃縮1.5-2.1）反相萃萃?。海簆H6.8-7.4（（磷酸酸鹽、、碳酸酸鹽緩緩沖液液）。。把青青霉素素從丁丁酯中中提取取到緩緩沖液液中。。反復(fù)萃萃取2－3次，，達(dá)到到結(jié)晶晶要求求。萃取條條件：：10℃下下。萃萃取罐罐冷凍凍鹽水水冷卻卻。脫色1.萃取液液中添添加活活性炭炭，除除去色色素。2.過濾，，除去去活性性炭。結(jié)晶———直直接結(jié)結(jié)晶加醋酸酸鈉－－乙醇醇溶液液反應(yīng)應(yīng)：得得到結(jié)結(jié)晶鈉鈉鹽。。加醋酸酸鉀－－乙醇醇溶液液：得得到青青霉素素鉀鹽鹽。薄膜蒸蒸發(fā)工工藝圖圖結(jié)晶———共共沸蒸蒸餾結(jié)結(jié)晶萃取液液，再再用0.5MNaOH萃萃取pH6.4-6.8下得得到鈉鈉鹽水水濃縮縮液。。加3-4倍體體積丁丁醇，，16-26℃℃，真真空0.67-1.3KPa）下下蒸餾餾。水和丁丁醇形形成共共沸物物而蒸蒸出。。鈉鹽鹽結(jié)晶晶析出出。結(jié)結(jié)晶經(jīng)經(jīng)過洗洗滌、、干燥燥（60℃℃真空空16h）），磨磨粉