干細胞來源微囊泡在再生醫(yī)學中的應(yīng)用進展,人體解剖學論文

干細胞來源微囊泡在再生醫(yī)學中的應(yīng)用進展,人體解剖學論文微囊泡〔microvesicles,MVs〕是指直徑范圍為20~1000nm不同類型的膜包裹構(gòu)造，可從多種類型細胞中釋放，可以被多種細胞攝入，含有與母細胞類似的脂類、蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和細胞器，可通過改變基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和〔或〕表觀遺傳程序介入調(diào)控機體正常生理功能和異常病理進程，在細胞凋亡、免疫調(diào)控、腫瘤遷移、病毒擴散等方面起重要作用。當前，MVs作為一種新型的細胞間信號轉(zhuǎn)導載體，正逐步引起學者們關(guān)注。現(xiàn)對MVs的生物學特征，干細胞來源MVs在再生醫(yī)學中的應(yīng)用研究進展、將來發(fā)展方向和挑戰(zhàn)綜述如下。1MVs的生物學特征1.1MVs的構(gòu)成和釋放MVs是從細胞外表脫落或分泌的小圓球形膜樣構(gòu)造，在血液和其它體液中可檢測到兩種類型MVs,即外核體〔exosomes〕和脫落囊泡〔sheddingvesicles〕[1].兩者之間沒有嚴格的鑒別標準，主要差異為囊泡產(chǎn)生的方式和生理生化特征。外核體是指大小比擬均一，約30~120nm的雙層膜小囊泡，來自于細胞內(nèi)涵體膜區(qū)室，由微泡體外膜和細胞膜融合后釋放到胞外環(huán)境或體液中，此經(jīng)過依靠于細胞骨架激活的胞外分泌，詳細機制不清楚，機體內(nèi)多種細胞均能分泌外核體，在活化狀態(tài)下細胞分泌顯著增加。分泌的外核體可被周邊細胞，或通過血液循環(huán)及其它體液被遠處組織細胞攝取利用[2].在細胞內(nèi)，高爾基體運輸可溶性因子到細胞外表經(jīng)過中同時伴有外核體的釋放。因而，體外培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中往往同時含有可溶性因子和MVs.脫落囊泡，也稱之為microparticles,直徑通常在100~1000nm之間，成分中含有與母細胞膜類似的脂類和蛋白，可以能包含胞質(zhì)中細胞器和部分mRNA.脫落囊泡產(chǎn)生經(jīng)過與胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的增加和細胞骨架的重構(gòu)有關(guān)，鈣離子通過激活胞質(zhì)內(nèi)蛋白酶影響細胞骨架構(gòu)造，鈣蛋白酶和凝溶膠蛋白裂解骨架蛋白的網(wǎng)狀構(gòu)造，造成細胞骨架毀壞，使細胞膜以出苞方式釋放囊泡[3].MVs的脫落是一種生理現(xiàn)象，伴隨著細胞的活化和生長。有趣的是，與緩慢生長細胞相比，快速增殖細胞傾向于分泌更多的MVs.1.2MVs介導的細胞間信息溝通機制研究表示清楚，MVs含有母細胞來源蛋白〔如信號蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、逆轉(zhuǎn)錄酶和跨膜蛋白等〕、RNA〔mRNA、非編碼mRNA〕和DNA〔基因組DNA和互補DNA〕，以及完好的細胞器如線粒體等[4].MVs可通過不同的機制調(diào)節(jié)靶細胞功能：①MVs表示出外表分子，通過外表攜帶的配體與靶細胞受體結(jié)合，作為信號復(fù)合物直接激活靶細胞。②MVs通過細胞膜融合轉(zhuǎn)導受體和/或生物活性脂質(zhì)進入靶細胞，或通過細胞吞噬作用攝取MVs內(nèi)含物，使靶細胞呈現(xiàn)相關(guān)受體表型及調(diào)控靶細胞功能。③MVs可橫向轉(zhuǎn)移遺傳信息，MVs在構(gòu)成經(jīng)過中可將母細胞質(zhì)中的成分〔多肽或mRNA〕一起包裹，傳遞到靶細胞，使其具有新的生物學功能或遺傳特征。另外，MVs還可作為載體轉(zhuǎn)移傳染性因子或完好的細胞器，在特定情況下，MVs能以載體形式將病毒〔如HIV或朊病毒〕傳遞給其它細胞并影響靶細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路[3].某些因素刺激可增加細胞釋放MVs,例如：細胞活化，低氧或輻射，氧化損傷，暴露于活化的補體級聯(lián)反響蛋白中等[5].2干細胞來源MVs再生醫(yī)學領(lǐng)域研究進展間充質(zhì)干細胞〔mesenchymalstemcells,MSCs〕具備多向分化潛能，能遷移至組織損傷部位，可作為理想的種子細胞應(yīng)用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。當前MSCs移植已在骨組織損傷、心肌梗死、腎、肺、腦、肝損傷〔如毒性藥物、缺血再灌注損傷〕中廣泛開展應(yīng)用[6],但也存在一些問題，如干細胞在組織損傷部位存活率低，分化潛能有限等。因而，有學者對MSCs的可塑性及轉(zhuǎn)分化作用提出了質(zhì)疑，以為移植的MSCs在組織損傷部位的積極作用主要與MSCs的旁分泌效應(yīng)有關(guān)，由于MSCs可分泌一些可溶性生物活性因子，能夠抑制細胞凋亡和纖維化，促進血管再生和刺激組織內(nèi)在祖細胞有絲分裂和/或分化，并調(diào)節(jié)免疫反響促進損傷組織修復(fù)再生[7-8].除可溶性因子外，MSCs亦可分泌MVs,且越來越多的證據(jù)表示清楚，MVs在組織損傷器官功能恢復(fù)經(jīng)過中可能起到了重要的或被低估的作用。不同來源干細胞，如造血干細胞、間充質(zhì)干細胞、脂肪干細胞、神經(jīng)干細胞和心肌干細胞等釋放的MVs在不同的實驗?zāi)Ｐ椭?，均能有效地抑制損傷組織細胞凋亡，刺激其增殖和促進微血管再生[9-11].因而，開發(fā)利用干細胞來源MVs應(yīng)用于組織再生和修復(fù)治療，將是一種有效的替代干細胞的治療策略。2.1MSCs來源MVs與心肌組織損傷修復(fù)2007年Timmers等[12]通過豬和小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)再灌注前經(jīng)靜脈給予人胚胎干細胞分化的MSCs條件培養(yǎng)基能顯著減少心肌梗塞面積，起到心臟保衛(wèi)作用，以為MSCs分泌的保衛(wèi)性外核體在華而不實發(fā)揮主要作用?？紤]到胚胎干細胞應(yīng)用的局限性和生成MVs需要大量細胞，費用較高，該課題組采用Myc永生化胚胎干細胞分化的MSCs來源MVs〔MSCs-MVs〕，結(jié)果顯示這些細胞來源MVs同樣具有心臟保衛(wèi)功能[13].隨后進一步發(fā)現(xiàn)MSCs來源的外核體能夠?qū)π募∪毖峁┍Ｐl(wèi)，其機制與MVs轉(zhuǎn)移miRNAshas-let-7b和has-let-7g有關(guān)[14].Yu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)導GATA-4基因的MSCs-MVs內(nèi)存在抗凋亡miR-221的高表示出，且能被心肌細胞快速內(nèi)化，起到心肌保衛(wèi)作用。2.2MSCs來源MVs與腎臟組織損傷修復(fù)2018年Bruno等[16]報道，人骨髓MSCs-MVs在腎臟組織損傷修復(fù)經(jīng)過中可起到與MSCs移植類似的作用，在體外實驗和甘油誘導的嚴重聯(lián)合免疫缺陷〔severecombinedimmunodeficiency,SCID〕小鼠急性腎損傷模型中均能促進腎小管上皮細胞增殖，且效應(yīng)為RNA依賴性，通過RNase預(yù)處理MVs,保衛(wèi)效應(yīng)隨即消失，提示保衛(wèi)效應(yīng)與MVs傳遞的mRNA有關(guān)。進一步分析揭示MSCs-MVs可轉(zhuǎn)移與間充質(zhì)表型、轉(zhuǎn)錄控制、增殖和免疫調(diào)控等相關(guān)的特定mRNAs,這些mRNA隨后在損傷組織細胞內(nèi)翻譯成蛋白，與可溶性因子一起加強MSCs的治療效應(yīng)。Collino等[17]在體外和體內(nèi)實驗中也證實MVs可有效轉(zhuǎn)移特定的miRNAs和mRNAs,并在受體細胞內(nèi)翻譯成相關(guān)蛋白。隨后，該課題組在順鉑誘導的SCID鼠急性致死性腎損傷實驗中發(fā)現(xiàn)，一次給予人MSCs-MVs能夠改善腎臟組織形態(tài)的構(gòu)造和功能，增加存活小鼠數(shù)，但不能阻止腎小管慢性持續(xù)損傷；而屢次給予MVs后，小鼠死亡數(shù)進一步減少，21d后存活小鼠顯示正常的腎臟組織構(gòu)造和功能，其機制與MVs誘導的腎小管上皮細胞抗凋亡基因〔Bcl-xL、Bcl2等〕的上調(diào)和促凋亡基因〔Casp1、Casp8和淋巴毒素-〕下調(diào)有關(guān)[18].除此之外，MSCs-MVs對腎臟缺血再灌注損傷[11]和殘存余留腎模型中腎損傷[19]均有一定的保衛(wèi)作用。另外，Zhu等[9]報道人MSCs-MVs能夠轉(zhuǎn)移角化細胞生長因子〔keratinocytegrowthfactor,KGF〕mRNA到損傷肺泡內(nèi)表示出，對大腸桿菌內(nèi)毒素誘導的急性肺損傷具有治療作用。2.3其它干細胞來源MVs與組織損傷修復(fù)2018年Herrera等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在切除70%肝本質(zhì)的大鼠模型中，注入人肝臟干細胞來源MVs穿梭mRNA〔MV-shuttledmRNA〕，可加速肝臟形態(tài)和功能恢復(fù)。MVs與肝細胞體外共培養(yǎng)顯示，人肝臟干細胞來源MVs可刺激人和大鼠肝臟細胞增殖并抑制細胞凋亡。除此之外，內(nèi)皮祖細胞來源MVs可促進組織再生和血管構(gòu)成。2020年，Ranghino等[21]報道內(nèi)皮祖細胞來源MVs在SCID鼠后肢缺血模型中可促進新生血管構(gòu)成和組織再生。Cantaluppi等[22]報道內(nèi)皮祖細胞來源MVs通過轉(zhuǎn)移促血管生成miRNAsmiR-126和miR-296,可重編程殘存腎臟組織細胞，對腎臟缺血-再灌注損傷起到保衛(wèi)作用。并且這種MVs轉(zhuǎn)移的miR-126和miR-296在體外可以促進胰島血管再生，誘導胰島內(nèi)皮細胞增殖，遷移和抑制細胞凋亡，其機制與MVs誘導的胰島內(nèi)皮細胞PI3K-Akt和eNOS信號轉(zhuǎn)導途徑的激活有關(guān)[23].人腎臟干/祖細胞對腎小管內(nèi)皮細胞的修復(fù)作用是通過TLR2受體〔Toll-likereceptor2〕完成的，華而不實MVs轉(zhuǎn)移的抑制素A〔inhibin-A〕和微泡穿梭核心蛋白聚糖〔MVs-shuttleddecorin〕在細胞修復(fù)經(jīng)過中起至關(guān)重要的作用[24].除此之外，腎外干細胞通過分泌生長因子，轉(zhuǎn)移MVs和免疫調(diào)節(jié)作用，均有助于腎臟組織損傷修復(fù)[25].胚胎干細胞來源MVs可誘導視網(wǎng)膜Mller細胞內(nèi)與多能性、細胞增殖和早期視覺相關(guān)基因上調(diào)，這些基因與視網(wǎng)膜的保衛(wèi)和重塑相關(guān)，并可下調(diào)瘢痕相關(guān)基因、介入分化和細胞周期阻滯miRNA[26].2.4干細胞來源MVs介導組織損傷修復(fù)機制MVs內(nèi)生物活性成分依靠于來源細胞。通過微陣列比擬骨髓和肝MSCs及它們釋放的MVs內(nèi)miRNA圖譜，發(fā)現(xiàn)部分miRNAs同時存在于MVs和來源細胞內(nèi)，部分miRNAs選擇性存在于MVs,部分miRNAs僅存在于母細胞內(nèi)，以為MSCs-MVs存在控制miRNAs的分選機制，由于沒有精到準確的定量分析和功能實驗，這些結(jié)果間的相關(guān)性尚不清楚。但當靶細胞缺乏某些miRNAs時，通過MVs選擇性轉(zhuǎn)移這些miRNAs或許有特殊作用[17].通過基因芯片分析顯示，在MSCs和MSCs-MVs中同時存在的miRNAs,主要與生長發(fā)育、細胞存活和分化作用相關(guān)，而一些在MSCs-MVs內(nèi)富含的miRNAs主要與免疫細胞調(diào)控有關(guān)[27].除遺傳物質(zhì)外，MVs內(nèi)蛋白的作用也同等重要。Kim等首次應(yīng)用蛋白質(zhì)譜分析骨髓MSCs-MVs,730種蛋白，功能分析顯示MSCs-MVs內(nèi)不僅含有與細胞增殖、粘附、遷移和形態(tài)變化等細胞進程相關(guān)的蛋白，而且含有大量外表受體〔如PDGFRB、EGFR和PLAUR〕、信號通路分子〔如RAS-MAPK、RHO和CDC42等〕以及細胞黏附分子和MSCs抗原，這些分子可能與MSCs-MVs的生物學效應(yīng)有關(guān)[28].因而，干細胞來源MVs介導的修復(fù)作用可能與下面因素有關(guān)：①MVs富含生物活性脂質(zhì)；②MVs膜外表含有抗凋亡和刺激生長的細胞因子，如VEGF、SCF;③MVs可通過轉(zhuǎn)移mRNA、調(diào)控miR-NA和蛋白提高整個細胞功能。在組織損傷環(huán)境中，MVs介導的遺傳信息轉(zhuǎn)移一方面可誘導干細胞分化為組織細胞，另一方面，從干細胞來源MVs可誘導組織細胞去分化，重新進入細胞周期分化為鄰近損傷組織的細胞類型刺激組織再生，華而不實MVs介導的mRNA和miRNA轉(zhuǎn)移可影響靶細胞表型和生物學特征[29].3問題與瞻望基于MVs在再生醫(yī)學領(lǐng)域具有與來源細胞類似的有益作用，有可能通過大規(guī)模生產(chǎn)MVs,或修飾其構(gòu)造來到達更好的治療效應(yīng)。如通過控制細胞培養(yǎng)條件刺激細胞釋放更多的MVs,通過遺傳修飾來源細胞定制更合適治療目的MVs.其次，以MVs為基礎(chǔ)的治療將為誘導性多潛能干細胞〔inducedpluripotentstemcells,iPSCs〕的臨床應(yīng)用開拓新的途徑，由于iPSCs構(gòu)成畸胎瘤的高風險性限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用，但假如將病人來源iPSCs產(chǎn)生的MVs應(yīng)用于組織再生治療，可大大降低這種風險。再次，外核體是由天然非合成的非病毒成分組成，體積小，易穿透生物膜，使其更容易被遞送到靶細胞，并且雙層脂質(zhì)構(gòu)造可防止內(nèi)部RNA和蛋白質(zhì)降解，是一種理想的潛在基因治療載體。2018年Al-varez-Erviti等[30]初次報道應(yīng)用修飾后小鼠外核體遞送外源性遺傳物質(zhì)〔siRNA〕，成功地促使腦組織特定基因沉默。將這種外核體注射到健康小鼠體內(nèi)，沒有出現(xiàn)不良免疫反響，提示這是一種相對安全的治療形式。固然眾多研究結(jié)果表明未修飾的和修飾的MVs具有治療相關(guān)性，是一種潛在的、有吸引力的治療手段和研究方向。然而，MVs的應(yīng)用研究領(lǐng)域仍然有幾個基本問題需要解決。例如，獲取大量MVs的方式方法和操作的可重復(fù)性，不同來源MVs效力標準的確定等。盡管動物實驗初步研究顯示MV