食品中霉菌和酵母分布檢測和鑒定

食品中霉菌和酵母分布、檢測和鑒定福建省疾病預(yù)防控制中心馬群飛霉菌和酵母的基本特性霉菌和酵母這種稱謂僅是為了方便起見，將小型真菌有真正菌絲的稱為霉菌，沒有菌絲的稱酵母，并沒有分類學(xué)上的依據(jù)。相對于低等的細菌來說，霉菌和酵母生長緩慢，競爭能力較弱，故霉菌和酵母常在不利于細菌生長繁殖的環(huán)境中形成優(yōu)勢菌群。由于霉菌和酵母的細胞較大，新陳代謝能力強，故102?104個酵母即可引起一克食物的變質(zhì)，而細菌則需要100倍于此數(shù)的細胞。通常霉菌和酵母適合在高碳低氮有機物如植物性物質(zhì)上生存。適合的pH3?8,有些霉菌可以在pH2,酵母在pH1.5時生活。水活度要求0.99?0.61，霉菌0.85時最適宜，某些嗜滲酵母和霉菌常引起糖果類食品的變質(zhì)。一般的霉菌的生長溫度為20?30°C,部分霉菌可以在不低于一7C的溫度下生長。酵母一般在0?45C時生長。耐熱能力較差，酵母細胞55?56C幾分鐘就被殺死。少數(shù)霉菌的抱子（如絲衣霉）則可在90C中耐受幾分鐘。霉菌和酵母很多可以耐受防腐劑。如乳酸、醋酸、CO和SO等。有些酵母酯酶22活性高并能合成B族維生素。食品中酵母的常見類群在食品中能分離出各種酵母菌，但它們很可能沒有什么意義，因為其中多數(shù)來源于外界的偶然污染。僅有非常有限的幾個酵母屬可使經(jīng)過加工并正常生產(chǎn)工藝包裝的食品腐敗。比如抗SO熏蒸的酵母，就是飲料、葡萄酒變質(zhì)的常見因素。耐受保鮮劑的畢赤2酵母，高度嗜氧，可以形成泡菜和醬油的表面膜。當(dāng)然，如果不按照標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)程序進行食品生產(chǎn)，那么許多外界污染的酵母都將在食品中大量繁殖，這種情況下，就談不上優(yōu)勢菌群問題了，也不必進行酵母的分類鑒定。處理方法只有一個，恢復(fù)正常的生產(chǎn)程序。乳制品：鮮奶易因細菌污染而腐敗，酵母菌不是重要問題。當(dāng)鮮奶被加工成奶油、乳酪、酸奶等制品后，由于細菌被抑制，酵母可相應(yīng)地成為優(yōu)勢菌。它們使奶油、乳酪產(chǎn)生怪味和氣體，使黃油產(chǎn)生有味物質(zhì)，并可使酸奶和酸乳酪腐敗。在實驗室中，漢遜德巴利酵母、布提利假絲酵母、多抱絲抱酵母和紅酵母均能導(dǎo)致固體和液體乳酪的腐敗。肉類與肉制品：通常情況下，這類制品適于細菌的生長，酵母不是引起變質(zhì)的主要原因。某些德巴利酵母可使冷凍的豬、牛肉香腸和午餐肉表面出現(xiàn)令人不愉快的粘滑感覺。2.3水果和蔬菜：兩者的差別主要是pH值。水果通常為酸性，pH值在1.8?2.2左右（味濃的水果，檸檬等）到pH4.5?5.0（西紅柿等）之間，對細菌有抵抗力。而蔬菜的pH值接近中性，對細菌侵入敏感。通常引起水果腐敗的原因是霉菌而非酵母，只有檸檬型克拉克酵母可侵入破損的草莓。2.4果醬、蜜餞、果汁和干果：這類食物的特點是水活度低。一些接合酵母能使加熱不完全的果醬敗壞。魯接合酵母和拜爾接合酵母可引起包裝好的巧克力變質(zhì)。即使僅沾上幾個細胞，最終也將生長而產(chǎn)生大量氣體至將外包裝脹破。拜爾接合酵母同樣能使果汁變質(zhì)，它能在水活度很低并含防腐劑的食品中生長。無花果由于種子腔開口易被酵母菌污染，有時嗜干酵母可導(dǎo)致無花果干的腐敗。2.5葡萄酒：酒中9?22%的乙醇、3?3.6的pH值和防腐劑（一般是SO和山梨酸）能2抑制多種微生物生長。二孢接合酵母和釀酒酵母卻能生長于18%的乙醇中，而路德酵母能抵抗SO和山梨酸，它們使葡萄酒渾濁，生成沉淀和怪味物質(zhì)。22.6啤酒：啤酒花（Hops）和2?6%的乙醇、CO及低pH值加上厭氧環(huán)境，營養(yǎng)成分2有限，能在其中生長的微生物量受到限制。酵母屬可使之渾濁并產(chǎn)生丁二醇、酚類等異味物質(zhì)。浸漬制品：蔬菜和水果在浸漬時由于未能隔絕空氣造成膜生酵母及一些丁酸細菌生長而引起變質(zhì)。正常情況下，這類食品中，酵母菌是優(yōu)勢菌群之一。無酒精飲料：常因酵母屬、畢赤酵母屬和球擬酵母屬等生長而腐敗。充碳酸氣的飲料少見霉菌性變質(zhì)，有時可見酵母引起沉淀物產(chǎn)生。美國食品和管理局（FDA）要求此類食品每毫升酵母數(shù)少于50個，霉菌少于100個。糧食：在干燥情況下，酵母并非優(yōu)勢菌。國內(nèi)有報導(dǎo)紅酵母屬引起濕糯米粉制成的元宵變色，失去固有粘性，但毒理學(xué)檢查未見異常。3．食品中霉菌的類群霉菌分布廣泛，但它與細菌主要的不同之一便是通過空氣中的分生孢子傳播。蔬菜是霉菌生長的良好基質(zhì)，霉菌還是水果、漿果、谷物、面包等變質(zhì)的主要原因。它還能在不適于微生物生長的皮革、衣物上生長。比如枝孢霉常存在于土壤和植物中，對植物無害，它也是空氣中常見真菌，容易導(dǎo)致衣物出現(xiàn)小小的黑斑。霉菌多為需氧菌，主要生長于和空氣接觸的物體表面。嗜冷霉菌可在一7?0°C生長，如鐮刀菌、青霉、枝孢霉。耐熱的絲衣霉常導(dǎo)致加工過的水果變質(zhì)。許多霉菌特異性高，僅在特殊的環(huán)境下存活。例如鐮刀菌在低溫能生長，常導(dǎo)致冷庫貯存的大蒜、大麥芽變質(zhì)。青霉常在柑桔中常檢出，它能夠抵抗防腐劑，對于生產(chǎn)影響較大。谷類：霉菌很容易成為優(yōu)勢菌。田野霉對收獲后的谷物霉變沒有多大意義。霉菌和酵母數(shù)量是食品加工衛(wèi)生史的一種指標(biāo)。霉菌數(shù)高的糧食保存期相當(dāng)短。水果和蔬菜：水果臨近成熟時pH值升高，表皮變軟，防御屏障薄弱，易為霉菌侵染。青霉是柑桔類水果變質(zhì)的最常見原因，有時是白地霉或柑桔鏈孢霉。擴展青霉甚至可使冷藏的蘋果和梨腐爛。變質(zhì)時水果先變軟，表面有淡褐色斑點并迅速擴展至全果。即使將變質(zhì)的部分削去也不能除去擴散的展青霉素。所以，被擴展青霉侵染過的薔薇科水果制成的果醬和果汁中，這種致癌致畸的毒素陽性檢出率非常之高。在我國北方省份生產(chǎn)的蘋果、山楂等水果的果醬和果汁中多次檢出展青霉素。叢梗孢霉和黑根霉能使桃、杏等核果腐爛。蔬菜腐爛主要是由葡萄孢霉（豌豆、洋蔥、西紅柿等）、曲霉（洋蔥等）、鐮刀菌（洋蔥、大蒜、馬鈴薯等）和交鏈孢霉（番茄、瓜葉類蔬菜）造成的。根霉可引起幾乎所有的水果和蔬菜的霉?fàn)€。市售蔬菜的主要病害可由曲霉、青霉、枝孢霉等造成。干燥食品：曬干的谷物常見有散囊菌。黃曲霉和寄生曲霉的檢出有重大意義。大量青霉出現(xiàn)表明在干燥過程中可能有生長。水活度高的食品如面包、蛋糕，可因青霉及其他常見霉菌生長引起發(fā)霉。果醬、蜜餞、果汁和干果：發(fā)霉果醬中常見散囊菌，時有嗜干青霉。金銹孢霉引起蜜餞變質(zhì)，嗜旱二孢霉引起甘草腐敗。經(jīng)巴氏消毒后的果汁中雖有絲衣霉存在，但它們不能生長。杏、桃、梨和香蕉制干前二氧化硫的熏蒸抑制了多數(shù)微生物。未經(jīng)處理的干果易因嗜干霉菌如散囊菌、嗜旱二孢霉等變質(zhì)。果仁中霉菌毒素問題較多。4．霉菌和酵母總數(shù)測定4.1基本要求：霉菌培養(yǎng)應(yīng)用專用培養(yǎng)箱，培養(yǎng)溫度在25?30°C之間對結(jié)果影響不大。為盡快得到結(jié)果，我們以27C為培養(yǎng)溫度。菌落計數(shù)應(yīng)于培養(yǎng)后的72小時進行第一次觀察。這時主要是觀察那些密集生長的平皿，以免到第五天之后，菌落生長成片而難以計數(shù)。實驗時手腳要快，動作宜輕，培養(yǎng)過程中觀察平板時，動作稍重，生長快速的霉菌孢子就會在培養(yǎng)基內(nèi)擴散，導(dǎo)致二次污染，結(jié)果讀數(shù)異常。特別是翻轉(zhuǎn)平板進行培養(yǎng)，觀察時再轉(zhuǎn)過來，特別容易導(dǎo)致孢子飛散。一般以第五天的讀數(shù)為最終計數(shù)。但觀察應(yīng)持續(xù)七天。由于霉菌和酵母菌落較大，光線正常時可以方便地計數(shù)。選擇那些霉菌數(shù)為10?100個之間的平皿計數(shù)，而不是象細菌的30?300個。有時10?50個菌落的平皿也是受肯定的。霉菌和酵母培養(yǎng)時間較長，用于傾注的培養(yǎng)基量應(yīng)稍多于細菌計數(shù)，約為15?20mL,以保證培養(yǎng)時不至于造成培養(yǎng)基過分干燥。培養(yǎng)箱內(nèi)溫濕度調(diào)節(jié)不當(dāng)，會造成霉菌蔓延生長或培養(yǎng)基失水。尤其是當(dāng)濕度過高時，常導(dǎo)致嗜濕的根霉、木霉、毛霉、鏈孢霉等的強烈污染。當(dāng)然，每批實驗時空白對照都是要做的。霉菌和酵母計數(shù)培養(yǎng)基傳統(tǒng)霉菌和酵母計數(shù)時用酸性培養(yǎng)基來抑制細菌。酸化的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）是一致公認(rèn)最好的酸化培養(yǎng)基。用酸，如酒石酸調(diào)pH至3.5后用于計數(shù)，效果尚令人滿意。酸化培養(yǎng)基也有無法避免的缺點，如霉菌菌落的擴展，耐酸細菌的生長，蛋白質(zhì)出現(xiàn)沉淀，以及抑制了不耐酸霉菌和酵母的生長等。最后還有一點，生長在酸化培養(yǎng)基上的霉菌和酵母形態(tài)異常，不利于分類鑒定。目前普遍使用抗生素培養(yǎng)基，上述缺點明顯改善。此方法經(jīng)濟有效，培養(yǎng)基易制備，不會破壞正常的菌落形態(tài)。常用的抗生素類藥物有氯霉素（50?100mg/kg）、土霉素（100mg/kg）、硫酸慶大霉素（50mg/kg）、鏈霉素（3g/kg）、鹽酸金霉素（20mg/kg）等。兩種抗生素合并使用效果更好。硫酸慶大霉素和氯霉素耐高壓，可以預(yù)先添加在培養(yǎng)基中一起滅菌，而其他的抗生素一般在培養(yǎng)基溫度降至50°C以下后添加。注意，抗生素效用在堿性條件下（pH>8.0）降低。孟加拉紅（RoseofBengal）常被用于制備霉菌和酵母的計數(shù)瓊脂。主要作用是限制霉菌菌落的蔓延生長，而不是象某些書本所描述的那樣，用于抑制細菌。孟加拉紅也被稱為虎紅，化學(xué)名是四碘四氯熒光素鈉鹽或鉀鹽。添加孟加拉紅的培養(yǎng)基上生長的霉菌菌落較為致密，而且生長的菌落背面顯出較濃的紅色，有助于計數(shù)。唯一的缺點是孟加拉紅溶液對光敏感，易分解成一種黃色的有細胞毒作用的物質(zhì)。平時應(yīng)將孟加拉紅溶液用不透光的容器或袋子包好，貯存在冰箱中。已變黃的溶液和瓊脂應(yīng)棄去。著名的應(yīng)用孟加拉紅的培養(yǎng)基是馬丁瓊脂（Matin'sMedia，亦稱虎紅瓊脂、孟加拉紅瓊脂）。孟加拉紅可添加在PDA中。鄰氯對硝基苯胺（2mg/kg）有類似孟加拉紅的作用。國外學(xué)者也常用孟加拉紅瓊脂，其中添加孟加拉紅25mg/kg，另外附加鄰氯對硝基苯胺2mg/kg，氯霉素50mg/kg，金霉素50mg/kg。美國FDA尚未認(rèn)可孟加拉紅瓊脂，它的標(biāo)準(zhǔn)仍以PDA的酸化法和抗生素法為基本。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，霉菌和酵母數(shù)檢驗時使用的培養(yǎng)基為孟加拉紅瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）。原標(biāo)準(zhǔn)只要求做糧食霉菌總數(shù)時，使用高鹽察氏瓊脂。高鹽察氏瓊脂使用時也有抑制力過強的缺點，而毛霉和根霉等卻仍然生長旺盛。一般使用CAO時，應(yīng)同時使用孟加拉紅瓊脂，以反映食品真菌的菌相全貌?，F(xiàn)在高鹽察氏瓊脂已廢止。不過，標(biāo)準(zhǔn)中忘記刪除流程圖中的CA0。察氏瓊脂（Czapek）和PDA通常只用于分類鑒定。當(dāng)酵母為優(yōu)勢菌群時，使用MEGA計數(shù)。配方：麥芽浸膏20克，蛋白胨1克，葡萄糖20克，瓊脂20克，蒸餾水1升，調(diào)pH5.4，121°C15min,添加50mg/kg氯霉素和金霉素以抑制細菌。如買不到麥芽浸膏，可以向啤酒廠購買麥芽汁(未添加啤酒花,withouthops)代替。上述培養(yǎng)基均有干粉出售。使用時十分方便，但各品牌的質(zhì)量不一。霉菌和酵母計數(shù)方法稀釋平板法最常用于食品樣品的檢驗。國家標(biāo)準(zhǔn)種樣品處理等方法與細菌的菌落總數(shù)計數(shù)方法大致相同。事實上，可以在進行菌落總數(shù)計數(shù)的同時，進行霉菌和酵母總數(shù)的檢驗。兩者之間的差異為培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度的不同。有人認(rèn)為，霉菌和酵母計數(shù)用表面涂布平板法能提高檢出率，因為霉菌有氣生菌絲，好氧性強，酵母耐熱性差，不耐融化瓊脂的熱力。而且可用不透明的培養(yǎng)基。檢驗方法同細菌檢驗常規(guī)，不再贅述。但因使用樣品量較少，對含菌量少的樣品，此法可能不夠準(zhǔn)確。對于國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的霉菌直接計數(shù)方法，引用了著名的霍華德(Howard)霉菌計數(shù)法，適用于檢驗番茄及其加工制品，但是需要專門的技術(shù)培訓(xùn)和相應(yīng)設(shè)備。5.霉菌和酵母分類鑒定霉菌中的多數(shù)種類不會產(chǎn)生有害的霉菌毒素，危害較小，而少數(shù)菌株即使污染數(shù)量不多，產(chǎn)生的霉菌毒素卻有極大的危害，因此單純的霉菌和酵母計數(shù)并不能反映食品的安全性，只有知道了食品的污染菌菌相，才能更準(zhǔn)確地判斷。分類鑒定的意義就在于此。但是，霉菌和酵母的分類鑒定十分繁瑣。分離和純化：常用方法有直接點種法、劃線法、稀釋平板法。稀釋平板法同常規(guī)檢驗，除了培養(yǎng)基用具選擇性的外，還要求每皿中長出的霉菌菌落在十個左右，太多則影響分離效果。另外，如采用傾注法，長在瓊脂深處的霉菌發(fā)育不良，無法觀察其菌落特征?？筛挠帽砻嫱坎挤?。此方法手續(xù)繁瑣，但所得種類較多。直接點種法將食物小顆粒直接種于分離培養(yǎng)基上，25C培養(yǎng)2?3天后，用接種針挑取抱子或菌絲，轉(zhuǎn)接于適當(dāng)?shù)沫傊泵嫔洗b定。此方法分純效果略遜。劃線法是用無菌水洗滌樣品，用接種環(huán)沾取液體在分離培養(yǎng)基上劃線分離。此法最簡便，但可能遺落部分菌株。真菌分類系統(tǒng)：全世界已知真菌有上千屬，十萬種。四十年多來，真菌的研究飛速發(fā)展，盡管在真菌超微結(jié)構(gòu)、生理生化、醫(yī)學(xué)真菌學(xué)、藥用真菌學(xué)、真菌毒素、食用真菌人工培養(yǎng)開發(fā)等方面已經(jīng)獲得了很多進展，但是，真菌學(xué)仍然是微生物學(xué)的薄弱環(huán)節(jié)，還有待進一步深入研究。目前，在系統(tǒng)學(xué)方面，受到公認(rèn)的分類體系不多。酵母分類鑒定：酵母在真菌分類系統(tǒng)中分別隸屬于子囊菌綱、擔(dān)子菌綱和半知菌類。為方便起見，國際上仍沿用酵母（Yeast）這個非分類學(xué)名詞。酵母分類以荷蘭LodderJ.主編《TheYeast—ATaxonomicStudy》（羅德，酵母一分類研究）1970年再版本為比較完整的系統(tǒng)。鑒定一株酵母，要花費極大的人力物力。因其形態(tài)和生理方面的試驗項目繁多，一般微生物實驗室難以開展。分離酵母時，現(xiàn)在一般不用低pH培養(yǎng)，而以抗生素抑制細菌。嗜干酵母常規(guī)方法很難檢出，因其要求低水活度，可以用濃縮果汁為培養(yǎng)基，或添加30％葡萄糖，稀釋樣品時也用30％葡萄糖溶液。濃縮果汁中此類菌數(shù)量不得超過1/50mL。在檢查分離抗防腐劑的酵母時，培養(yǎng)基添加0.5%醋酸能促進抗保鮮劑酵母的生長并抑制其他酵母。鑒定時，先根據(jù)細胞形態(tài)特征進行屬以上的判斷，如是否有性繁殖，子囊孢子、擲孢子、冬孢子和擔(dān)孢子數(shù)量、形態(tài)，無性生殖是出芽還是裂殖，有無假菌絲等等。種的確定主要以生理特性，尤其是糖類發(fā)酵或同化為依據(jù)，還要包括無維生素生長、酯酶活性、色素形成、同化硝酸鹽、酯類產(chǎn)生情況、對放線菌酮抗性、低水活度生長等等生理特點，常常需要數(shù)周后才有鑒定結(jié)果。使用API20C或Biolog全自動細菌分類系統(tǒng)等可以大大加快檢索鑒定速度。目前，上述設(shè)備及類似設(shè)備研制較多，但普及有一定難度，主要原因是其價格居高不下。這種全自動或半自動檢索代表了今后微生物分類研究的發(fā)展方向。目前鑒定一株酵母需花費約5美元。霉菌分類鑒定5.4.1霉菌分類培養(yǎng)基：絲狀真菌沒有完整的分類系統(tǒng)，常用Smith系統(tǒng)。霉菌培養(yǎng)時常因不同的培養(yǎng)基而在生理和形態(tài)方面表現(xiàn)出極大的差異，故描述菌種時應(yīng)注明鑒定培養(yǎng)基。最為常用的是察氏瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂，通常對青霉、曲霉菌種用察氏瓊脂培養(yǎng)，其他霉菌則應(yīng)選用PDA。對于鐮刀菌屬的菌種，必要時要選用六種以上的不同培養(yǎng)基來分別顯示它的不同培養(yǎng)特征。對有特殊要求的霉菌，培養(yǎng)時也應(yīng)滿足其條件，低水活度食品如果醬、糧食中的嗜干霉菌，應(yīng)使用大量添加蔗糖或食鹽的高滲培養(yǎng)基。培養(yǎng)時間：直接采用霉菌和酵母計數(shù)后的平板進行霉菌分類鑒定是可行的。但在培養(yǎng)5?7天時，菌種的形態(tài)特征不明顯，不容易觀察。通常于培養(yǎng)7?14天時鑒定。染色液：制片時染色液是必需的。常用兩種：乳酸品紅液（百萬分之一酸性品紅乳酸溶液），染色速度快，尤其是幼齡組織上色快。胞壁組織清晰，適于顯微攝影。1896年Amann氏發(fā)明的乳酸苯酚棉藍染色液（10克石炭酸溶于10mL熱蒸餾水，再加入甘油20mL、乳酸10mL、棉藍cottonblue0.22克即成），折光率好，背景微藍，細胞不變形，殺菌防腐防腐，且不易干燥，保持時間較長。霉菌鑒定程序：霉菌分類的困難關(guān)鍵在于培養(yǎng)特征的觀察和描述。使用檢索表時一定要對每一分類特征判斷清楚，以免因一次錯誤而誤入歧途。經(jīng)常進行霉菌分類鑒定的單位或部門需要專人負責(zé)這項工作，臨時人員是無法勝任的。鑒定時先肉眼觀察平板上生長的單個菌落，注意菌落顏色、質(zhì)地等。然后用顯微鏡由低倍鏡、高倍鏡至油鏡觀察，注意菌絲形態(tài)、孢子梗、分生孢子和有性器官顏色、形態(tài)等。這是鑒定時一定要仔細觀察的指標(biāo)。以曲霉鑒定為例。先進行察氏瓊脂觀察。曲霉在察氏瓊脂上顏色和形態(tài)分化較好。根據(jù)菌落有無綠色調(diào)產(chǎn)生分成兩大類。有時需要放幾