抗體類藥物的生物分析方法,藥學(xué)論文

抗體類藥物的生物分析方法,藥學(xué)論文內(nèi)容摘要：抗體類藥物因其靶向性、高度特異性、低毒性等優(yōu)點成為臨床治療諸多疾病的首選藥物，但在生物體內(nèi)的處置機(jī)制有其特殊性和復(fù)雜性，極大地增加了生物檢測的難度，因而必須建立靈敏、準(zhǔn)確、可重復(fù)的測定方式方法。本文主要針對該類藥物的生物分析方式方法，介紹酶聯(lián)免疫吸附分析、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)以及一些新技術(shù)方式方法的特點和應(yīng)用大概情況，以期為研究此類藥物提供參考。本文關(guān)鍵詞語：單克隆抗體；生物分析方式方法；液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)；流式細(xì)胞術(shù)；Abstract:Antibodydrugshavebecomethefirstchoiceforclinicaltreatmentofmanydiseasesduetotheiradvantagesoftargeting,highspecificityandlowtoxicity.However,thedisposalmechanisminvivohasitsparticularityandcomplexity,whichgreatlyincreasesthedifficultyofbiologicaldetection.Therefore,toestablishthesensitive,accurateandrepeatablemethodsisurgent.Thispapermainlyfocusesonthebioanalyticalmethodsofthiskindofdrugs,introducesthecharacteristicsandapplicationofenzyme-linkedimmunosorbentassay,electrochemiluminescence,liquidchromatography-massspectrometry,flowcytometryandsomenewtechniques,inhopeofprovidingareferenceforthestudyofrelateddrugs.Keyword:monoclonalantibody;bioanalyticalmethods;LC-MS/MS;flowcytometry;隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的單克隆抗體藥物被開發(fā)用于臨床治療。相比于以往的小分子藥物，抗體藥物具有特異性強(qiáng)、活性高、生物功能明確、毒性低、半衰期長、有利于臨床應(yīng)用等優(yōu)點。調(diào)查顯示，最近幾年單克隆抗體獲得市場批準(zhǔn)的速度是小分子藥物的兩倍[1].截至2021年9月，全球已上市的單克隆抗體藥物有133個?？贵w類藥物具有與內(nèi)源性分子類似、相對分子質(zhì)量大、分子類型多樣和部分用藥劑量小等特點，在生物體內(nèi)的處置機(jī)制有其特殊性和復(fù)雜性，極大地增加了生物檢測的難度。因而選用具有更高層次特異性、靈敏度、回收率、重現(xiàn)性以及更寬線性范圍，并且能將進(jìn)入體液的藥物及其降解產(chǎn)物和代謝產(chǎn)物與內(nèi)源性、外源性干擾物區(qū)別開來的分析方式方法是非常重要的。與典型的酶聯(lián)免疫吸附測定法對多種不同靶點單抗的測定參數(shù)比擬〔Tab.1〕，各種分析手段都存在著各自的優(yōu)缺點。因而，本文就當(dāng)前進(jìn)行該類藥物的生物分析方式方法做一概述。1酶聯(lián)免疫吸附分析〔ELISA〕酶聯(lián)免疫吸附分析〔enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA〕是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)，當(dāng)前這種方式方法已經(jīng)成為免疫分析領(lǐng)域最通用的分析方式方法。此方式方法是以酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體為主要試劑，通過復(fù)合物中的酶催化底物呈色而對被測物進(jìn)行定性或定量的標(biāo)記免疫技術(shù)，具有操作簡單、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)并且適用于批量處理等優(yōu)點[1].當(dāng)前已廣泛應(yīng)用于各種抗體類藥物的藥代動力學(xué)研究中，如阿達(dá)木單抗及其生物仿制藥[2]、PD-L1單抗[3]、抗體偶聯(lián)藥物[4]等。但是此方式方法也存在著一些缺乏：〔1〕牽涉多個孵育和洗滌步驟；〔2〕有限的動態(tài)范圍；〔3〕不能同時測定生物技術(shù)藥物及其代謝產(chǎn)物；〔4〕易受內(nèi)源性和外源性物質(zhì)干擾；〔5〕高度依靠特異性高，親和力強(qiáng)的高品質(zhì)單克隆抗體試劑等。由此可見，ELISA作為當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的免疫分析法，仍需要不斷完善及改良。Tab.1Characteristicsofanalyzedplatforms2基于MSD技術(shù)平臺的電化學(xué)發(fā)光技術(shù)〔ECL〕電化學(xué)發(fā)光技術(shù)〔electrochemiluminescence,ECL〕是一個抗原與用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合，根據(jù)電極上的發(fā)光強(qiáng)度而對待測物進(jìn)行定量分析，提供藥物代謝動力學(xué)〔pharmacokinetic,PK〕研究的獨特平臺[5,6,7,8].其免疫分析格式類似于典型的ELISA格式，但將其線性范圍擴(kuò)大至1000倍以上，靈敏度提升100倍，為當(dāng)前一些疾病樣本中低劑量待測蛋白濃度的測定提供了更好的選擇。雷珠單抗〔ranibizumab〕是一種用于治療新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物，ELISA的靈敏度僅為20ng/mL,而ECL能夠在低至300pg/mL的濃度下可靠地量化此單抗[7].趙小平[9]進(jìn)行乙型肝炎病毒感染血清學(xué)標(biāo)志物檢測方式方法比照的結(jié)果顯示ECL比ELISA方式方法操作愈加簡單，反響時間更短，準(zhǔn)確度更高層次。Teimouri等[10]使用ECL檢測人血清抗弓形蟲IgG的靈敏度和特異性均高于ELISA,但其存在專業(yè)讀取器增加測定成本的缺點。除此之外，MSD技術(shù)平臺通過點陣技術(shù)可在96孔石墨電極板實現(xiàn)10個指標(biāo)/孔的檢測。Sumathi等[11]使用MSD平臺上的多重免疫測定法準(zhǔn)確地測量了血清樣品中REGN3470,REGN3471和REGN3479的總濃度，并且特異性地定量每種抗埃博拉病毒單克隆抗體的濃度而不受其他抗體的干擾。因而，ECL方式方法具有線性范圍寬、靈敏度高和可進(jìn)行多重檢測等優(yōu)于ELISA方式方法的特點，但在吞吐量和工作流程方面沒有太大改良。所以在成本預(yù)算較高的情況下，ECL方式方法可為ELISA提供高靈敏度，可重復(fù)性，同源性和血清耐受性的替代方式方法。3液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)〔LC-MS/MS〕配體結(jié)合試驗〔ligandbindingassay,LBA〕如ELISA、ECL等，由于低成本、操作簡單和高通量等特征已成為蛋白質(zhì)生物分析的標(biāo)準(zhǔn)檢測方式方法。然而，該技術(shù)存在一些局限性，包括穿插反響性，高劑量鉤狀效應(yīng)，本身抗體的存在會產(chǎn)生錯誤結(jié)果等。近年來，由于LC-MS/MS技術(shù)的改良，它已成為定量生物基質(zhì)中蛋白質(zhì)和抗體的有前景的替代技術(shù)。尤其是在早期的單克隆抗體開發(fā)階段，LC-MS/MS方式方法的出現(xiàn)彌補了傳統(tǒng)LBA開發(fā)時間長，缺乏特異性試劑，基質(zhì)效應(yīng)因物種而異的缺陷。當(dāng)前已有眾多文獻(xiàn)報道LC-MS/MS用于單克隆抗體臨床和非臨床的藥代動力學(xué)研究[12,13,14].在非臨床研究中，可通過計算機(jī)搜索出抗體候選物的重鏈和輕鏈恒定區(qū)的可能序列，過濾動物物種的血漿蛋白質(zhì)組的這些序列的肽，實現(xiàn)LC-MS/MS分析方式方法的通用性。Li等[15]使用一種通用的同位素標(biāo)記特征肽技術(shù)和免疫捕獲技術(shù)，對不含臨床前物種氨基酸序列的4種人源化IgG1單抗和4種人源化IgG2單抗進(jìn)行了大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究，與ELISA方式方法之間的時間-濃度曲線顯示出良好的一致性，實現(xiàn)了IgG2和IgG1的分析方式方法通用性。但在臨床研究中此方式方法的通用性仍處于探尋求索階段[16].LC-MS/MS也具有可檢測降解產(chǎn)物和翻譯后修飾物質(zhì)，免除高免疫原性對PK/TK分析存在干擾的優(yōu)勢。Kang等[17]報道了一種有效的LC-MS/MS法，能夠同時測定胰高血糖素樣肽1-Fc融合蛋白〔GLP1-Fc〕的母體藥物和兩種活性代謝物。Law和Wang等[18,19]均得到了LC-MS/MS法測得的抗體藥物濃度始終高于ELISA法的結(jié)論，并證明了是由于抗藥性抗體的存在而導(dǎo)致的。除此之外，分析物富集、色譜分離和多反響監(jiān)測技術(shù)提供了多個選擇維度，使LC-MS/MS適用于多重分析。Lanshoeft等[20]成功地運用LC-MS/MS的多重分析同時定量多種不同人類IgG1抗體。由此可見，LC-MS/MS具有線性動態(tài)范圍寬、方式方法開發(fā)快、多組分分析、可同時量化母體和代謝物等優(yōu)點。LC-MS/MS法可使單克隆抗體大小的蛋白質(zhì)〔~150000〕的定量下限到達(dá)50ng/mL[21],靈敏度稍低于ELISA,但此水平足以在大多數(shù)情況下對抗體藥物進(jìn)行定量。并且隨著更多尖端技術(shù)的出現(xiàn)，包括免疫捕獲〔IC〕在內(nèi)的樣品制備經(jīng)過的改良，靈敏度得到了顯著提高，但可重復(fù)性差這一問題尚未解決。4流式細(xì)胞術(shù)〔flowcytometry〕在免疫分析方式方法中，通常需要精制的抗原以及特異性的單克隆抗體用于生物基質(zhì)中被分析物的捕獲與檢測，流式細(xì)胞術(shù)則可基于空間構(gòu)造近乎于天然存在形式的細(xì)胞外表抗原來定量檢測生物基質(zhì)中的抗體。RhD是在Rh血型系統(tǒng)中存在于紅細(xì)胞外表的D抗原，Yver等[22]使用流式細(xì)胞術(shù)成功地對一種人重組單克隆抗RhD抗體roledumab進(jìn)行了定量。抗體-藥物偶聯(lián)物〔antibody-drugconjugate,ADC〕的抗原是具有復(fù)雜蛋白質(zhì)構(gòu)造的膜蛋白，其可溶性表示出仍然是一個難題。奧法木單抗〔OFA〕是一種抗CD20單克隆抗體，用于治療非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病。Zhao等[23]建立了基于流式細(xì)胞術(shù)的奧法木單抗ADC〔OFA-HL-MMAE〕藥物測定分析方式方法，并利用這種新方式方法定量測量了小鼠血清中OFA-HL-MMAE的濃度。鄧承蓮等[24]采用ELISA與流式細(xì)胞術(shù)兩種方式方法對抗CD20單抗進(jìn)行定量分析，結(jié)果表示清楚兩種方式方法均具有良好的特異性、精致細(xì)密度和準(zhǔn)確度，但其靈敏度與ELISA相比相差約兩個數(shù)量級。由此看出，此方式方法不受可溶性抗原表示出問題的限制，還擴(kuò)展了LBA方式方法的應(yīng)用范圍，對于量化臨床ADC樣品和以細(xì)胞外表抗原為靶點的單克隆抗體具有很高的價值。但存在著可重復(fù)性差、靈敏度低的缺點，而且適用性及通用性也需要我們進(jìn)一步的探究。5新型檢測技術(shù)5.1微流控免疫分析平臺〔Gyrolab〕典型的Gyrolab免疫測定是將分析試劑和研究樣品從聚丙烯微量滴定板全自動轉(zhuǎn)移到一系列含有納升級鏈霉親合素蛋白柱的光盤〔CD〕微構(gòu)造上，通過測量來自每個柱的熒光信號定量藥物濃度。可在5h內(nèi)完成單個5CD運行以獲得560個最大樣品量，以允許在有限的時間內(nèi)進(jìn)行快速的分析方式方法開發(fā)[25].具有試劑消耗低，動態(tài)范圍寬，基質(zhì)效應(yīng)低，樣品體積小和自動化等優(yōu)點。已被提議作為傳統(tǒng)的基于微量滴定板的免疫測定的可行替代方式方法。Liu等[25]使用Gyrolab平臺對兩種抗體的四個非臨床毒理學(xué)和兩個臨床試驗進(jìn)行了驗證，根據(jù)LBA方式方法的可接受標(biāo)準(zhǔn)，觀察到分析批的通過率高達(dá)83%~100%,真實樣品再分析的通過率高達(dá)94%以上，與傳統(tǒng)的ELISA方式方法相比，樣本測定時間縮短了1~2周，樣品和試劑的消耗量低約10倍。除此之外，研究顯示較短的孵育時間使非特異性互相作用最小化，進(jìn)而使其基質(zhì)效應(yīng)比ELISA低10倍，比ECL低2倍[26].常規(guī)ELISA方式方法檢測克羅恩病人中的單克隆抗體Etrolizumab時有著較強(qiáng)的基質(zhì)干擾，Williams等[27]運用Gyrolab免疫測定法有效地消除了基質(zhì)效應(yīng)，并將其定量范圍擴(kuò)大了將近兩個數(shù)量級。但此平臺易發(fā)生污染和管道堵塞，需要較為頻繁的清潔，而且每個BioaffyCD的價格比ELISA板的價格高出約300倍，緩沖液和標(biāo)記系統(tǒng)等也需要額外的費用[28,29].只要當(dāng)分析時間作為一個考慮因素時，Gyrolab工作站最終比ELISA和ECL更具成本效益。5.2外表等離子共振技術(shù)〔Biacore〕BIA〔biomolecularinteractionanalysis〕技術(shù)是基于一種稱為外表等離子共振〔surfaceplasmonresonance,SPR〕的物理光學(xué)現(xiàn)象發(fā)展起來的新型生物傳感分析技術(shù)。將一種生物分子固定在傳感器的葡聚糖外表，與之互相作用的分子溶于流過芯片外表的溶液中，通過SPR共振角的變化檢測器能跟蹤檢測溶液中的分子與芯片外表的分子結(jié)合、解離整個經(jīng)過的變化。此方式方法被廣泛用于動力學(xué)常數(shù)和樣品濃度的測定[30]、分析分子的互相作用形式[31]等方面。Alaedini等[32]用Biacore平臺檢測抗單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂〔抗GM1〕本身抗體，其靈敏度和特異性與經(jīng)典的ELISA試驗相當(dāng)。Schlichtiger等[33]檢測抗心磷脂抗體，Biacore平臺顯示出比傳統(tǒng)ELISA更高層次的靈敏度，并允許分析結(jié)合動力學(xué)和親和力。與常規(guī)ELISA相比，Biacore系統(tǒng)在免疫測定中具有樣本需求量少、監(jiān)測實時性、樣品無需標(biāo)記及快速自動化等突出優(yōu)點。但此項檢測技術(shù)還不夠成熟，對蛋白純度要求也較高。5.3單分子免疫檢測技術(shù)〔singlemoleculecounting,Erenna〕單分子計數(shù)〔SMC〕技術(shù)利用激光聚焦于愛里斑中單個熒光標(biāo)記分子，初次實現(xiàn)了在單分子水平對蛋白進(jìn)行計量。用洗脫液將檢測抗體從基于珠或板的免疫復(fù)合物中解離下來，并送入Erenna系統(tǒng)的毛細(xì)管中，通過獨特的軟件擬合單個熒光素標(biāo)記抗體在通過檢測空間時產(chǎn)生的熒光閃爍輸出信號，可實現(xiàn)寬動態(tài)范圍和加強(qiáng)的靈敏度。SMCTM技術(shù)采用了與傳統(tǒng)ELISA技術(shù)特別類似的流程，但將靈敏度提高了三個數(shù)量級，并且具有多重檢測的優(yōu)勢。Gilbert等[34]通過含有多個激光器的Erenna系統(tǒng)一次性準(zhǔn)確地測量三種分析物的亞pg/mL含量，此多路復(fù)用可減少使用較小體積的樣品來分析多個分析物所需的時間。但是SMCTM技術(shù)吞吐量相對較低，每個分析人員天天的檢測通量不可能超過兩個96孔板[35],存在著試劑殘留的問題[36].測定成本也較高，但既可使用磁珠又可使用普通96孔板作為抗體包被介質(zhì)的特點，使其在靈敏度和成本方面獲得了巧妙平衡。6結(jié)論與瞻望單抗藥物憑借其靶向性強(qiáng)、毒性低，具有傳統(tǒng)化學(xué)療法無可比較的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于臨床。伴隨著生物技術(shù)的發(fā)展，又涌現(xiàn)出了各種更具療效的抗體藥物衍生物，如構(gòu)造域抗體、雙特異性抗體、肽抗體、抗體藥物結(jié)合物等。固然此類藥物的生物分析技術(shù)已經(jīng)獲得了長足發(fā)展，有多種技術(shù)手段可供選擇，但選擇一個適宜的生物分析平臺是由多個因素決定的，不僅取決于靈敏度要求，還取決于平臺可訪問性、樣本量可用性、方式方法開發(fā)容易性、平臺靈敏性和吞吐量需求。應(yīng)根據(jù)這類藥物性質(zhì)特點、方式方法需求及可操作性等選擇合適的分析方式方法或者多種分析手段聯(lián)合使用。隨著科技的進(jìn)步，也將會有更靈敏、樣本量需求更少、分析周期更短、重復(fù)性更高層次、全自動化等優(yōu)點的生物分析技術(shù)被開發(fā)出來，為該類藥物的藥動學(xué)研究提供更可靠的數(shù)據(jù)。以下為參考文獻(xiàn)[1]FreseK,EisenmannM,OstendorpR,etal.Anautomatedimmunoassayforearlyspecificityprofilingofantibodies[J].mAbs,2020,5〔2〕：279-287.[2]PuriA,NiewiarowskiA,AraiY,etal.Pharmacokinetics,safety,tolerabilityandimmunogenicityofFKB327,anewbiosimilarmedicineofadalimumab/Humira,inhealthysubjects[J].BritJClinPharmacol,2021,83〔7〕：1405-1415.[3]李雪，史晶瑩，董雪，等。一種人抗PD-L1單抗的間接ELISA方式方法的建立[J].生物技術(shù)，2021,27〔6〕：552-556.[4]李萌，于傳飛，王文波，等?？贵w偶聯(lián)藥物抗HER2單抗-MCC-DMl質(zhì)控方式方法的建立[J].藥物分析雜志，2021,36〔1〕：22-30.[5]SoderstromCI,SpriggsFP,SongW,etal.Comparisonoffourdistinctdetectionplatformsusingmultipleligandbindingassayformats[J].JImmunolMethods,2018,371〔1/2〕：106-113.[6]夏明。ECLIA法檢測血清促甲狀腺激素受體抗體在本身免疫性甲狀腺病中的診斷價值[J].中國醫(yī)學(xué)工程，2021,23〔1〕：160-162.[7]LoweJ,MaiaM,WakshullE,etal.Developmentofanovelhomogenouselectrochemiluminescenceassayforquantitationofranibizumabinhumanserum[J].JPharmBiomedAnal,2018,52〔5〕：680-686.[8]SmeragliaJ,SilvaJP,JonesK.Improvingthesensitivityandspecificityofabioanalyticalassayforthemeasurementofcertolizumabpegol[J].Bioanalysis,2021,9〔16〕：1217-1226.[9]趙小平。兩種不同免疫檢驗方式方法檢測乙型肝炎病毒感染血清學(xué)標(biāo)志物的臨床比照討論[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2022,17〔3〕：61-62.[10]TeimouriA,ModarressiMH,ShojaeeS,etal.Detectionoftoxoplasma-specificimmunoglobulinGinhumansera:performancecomparisonofinhouseDot-ELISAwithECLIAandELISA[J].EuroJClinMicrobiol,2021,37〔8〕：1421-1429.[11]SumathiS,MohamedK,RabihS,etal.Safety,pharmacokinetics,andimmunogenicityofaco-formulatedcocktailofthreehumanmonoclonalantibodiestargetingEbolavirusglycoproteininhealthyadults:arandomised,first-in-humanphase1study[J].LancetInfectDis,2021,18〔8〕：884-893.[12]PengX,LiuB,LiY,etal.DevelopmentandValidationofLC-MS/MSMethodfortheQuantitationofInfliximabinHumanSerum[J].Chromatographia,2021,78〔7〕：521-531.[13]IwamotoN,ShimadaT,TerakadoH,etal.ValidatedLC-MS/MSanalysisofimmunecheckpointinhibitorNivolumabinhumanplasmausingaFabpeptide-selectivequantitationmethod:nano-surfaceandmolecular-orientationlimited〔nSMOL〕proteolysis[J].JChromatogrB,2021,1023-1024:9-16.[14]黃怡，李曉宇，田芳，等。質(zhì)譜方式方法實現(xiàn)抗體類藥物糖鏈修飾的鑒定與定量研究[J].中國生物工程雜志，2021,38〔1〕：32-41.[15]LiH,OrtizR,TranL,etal.GeneralLC-MS/MSmethodapproachtoquantifytherapeuticmonoclonalantibodiesusingacommonwholeantibodyinternalstandardwithapplicationtopreclinicalstudies[J].AnalChem,20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