免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理及其應(yīng)用

免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理及其應(yīng)用第一頁，共四十二頁，2022年，8月28日提要免疫學(xué)檢測技術(shù)主要應(yīng)用：對多種免疫性疾病的診斷、療效評估、發(fā)病機(jī)制探討;對抗原性物質(zhì)、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、粘附分子或細(xì)胞受體等的定性、定量檢測。第二頁，共四十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)抗原或抗體的檢測抗原-抗體反應(yīng)包括：沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、溶解反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、中和反應(yīng)等。抗原-抗體反應(yīng)可用已知的特異性抗體檢測未知的抗原；也可用已知的抗原檢測未知的抗體。第三頁，共四十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)抗原或抗體的檢測免疫標(biāo)記技術(shù)包括：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)等。第四頁，共四十二頁，2022年，8月28日抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：P226抗原-抗體的特異性結(jié)合?？乖贵w分子表面的非共價鍵結(jié)合。反應(yīng)的兩個階段：特異性結(jié)合階段；可見的反應(yīng)階段。是否呈現(xiàn)可見的反應(yīng)現(xiàn)象，與抗原和抗體兩者的分子濃度和比例密切相關(guān)。第五頁，共四十二頁，2022年，8月28日抗原抗體比例對反應(yīng)現(xiàn)象的影響第六頁，共四十二頁，2022年，8月28日抗原-抗體反應(yīng)的影響因素1.電解質(zhì)：抗原-抗體反應(yīng)通常應(yīng)用0.85%的氯化鈉（適當(dāng)濃度的電解質(zhì)）作為稀釋液。2.溫度：反應(yīng)常在37℃水浴或孵育箱中進(jìn)行。3.酸堿度：抗原-抗體反應(yīng)適應(yīng)的酸堿度

為PH6-8?？乖?抗體反應(yīng)受多種因素影響第七頁，共四十二頁，2022年，8月28日抗原抗體的檢測方法凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)中和反應(yīng)用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)第八頁，共四十二頁，2022年，8月28日凝集反應(yīng)

(Agglutination)

細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合、凝集的現(xiàn)象。1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法（定性試驗）和試管法（半定量試驗）。第九頁，共四十二頁，2022年，8月28日凝集反應(yīng)

(Agglutination)2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，形成致敏顆粒，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)的顆粒凝集現(xiàn)象。第十頁，共四十二頁，2022年，8月28日血球凝集第十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日沉淀反應(yīng)

（Precipitation)

血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。第十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日沉淀反應(yīng)

（Precipitation)沉淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，如絮狀沉淀。大多數(shù)沉淀反應(yīng)是用半固體瓊脂凝膠為介質(zhì)，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散故也稱免疫擴(kuò)散。第十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日單向免疫擴(kuò)散

(SingleImmunodiffusion)將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板；打孔，將抗原加入孔中擴(kuò)散?？乖c抗體相遇，形成沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比。常用于測定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)第十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日雙向免疫擴(kuò)散

（DoubleImmunodiffusion)將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由擴(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測。第十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日免疫電泳

（Immunoelectrophoresis)將待測血清標(biāo)本作瓊脂凝膠電泳，不同分子量蛋白組分開，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應(yīng)的抗血清，與不同區(qū)帶的蛋白抗原作雙向免疫擴(kuò)散，在各區(qū)帶相應(yīng)的位置形成沉淀弧。常用于血清蛋白種類分析。第十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日火箭電泳（RocketElectrophoresis)

也稱免疫擴(kuò)散，是把單向免疫擴(kuò)散同電泳結(jié)合在一起的方法?？乖诤卸靠贵w的瓊脂中泳動，兩者比例適宜時，在較短時間內(nèi)生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。特點(diǎn)：需時較短，用于快速沉淀標(biāo)本中抗原含量的測定。第十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日火箭電泳示意圖第十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日免疫標(biāo)記技術(shù)

用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。能極大地提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對微量物質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位檢測。三種基本類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)。第十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日免疫熒光顯微技術(shù)

(ImmunofluorescenceTechnique)

將熒光素（異硫氰酸熒光素，F(xiàn)ITC、藻紅蛋白，PE)與抗體連接成熒光抗體，再與待測標(biāo)本的抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光，對標(biāo)本中抗原的鑒定和定位。包括直接熒光法、間接熒光法和補(bǔ)體法。第二十頁，共四十二頁，2022年，8月28日直接熒光法：將熒光素直接標(biāo)記抗體作標(biāo)本染色。優(yōu)點(diǎn)：是特異性強(qiáng)。缺點(diǎn)：每檢測一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗染色。優(yōu)點(diǎn)：敏感性比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗可用于多種抗原的檢測。第二十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日補(bǔ)體結(jié)合免疫熒光法：在間接法的第一步抗原-抗體反應(yīng)時加入補(bǔ)體，使之與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合；再用熒光素標(biāo)記的抗C3抗體進(jìn)行示蹤。第二十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日間接免疫熒光法示意圖第二十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日免疫熒光顯微技術(shù)第二十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FCM)

FCM是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對單個細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細(xì)胞分選收集。FCM還可對同一細(xì)胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等）進(jìn)行多信息分析。流式細(xì)胞術(shù)第二十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日流式細(xì)胞儀工作原理第二十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日酶免疫測定

(EnzymeImmunoassay,EIA)用酶（常用辣根過氧化物酶，即HRP或堿性磷酸酶，即ALP)標(biāo)記的抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)。通過酶作用于底物后顯色來判定結(jié)果。常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗和酶免疫組化法，前者測定可溶性抗原或抗體，后者測定組織中或細(xì)胞表面的抗原。第二十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日酶聯(lián)免疫吸附試驗

(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。用洗滌法將液相中游離成分洗除。主要有雙抗體夾心法、間接法等。第二十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日

ELISA檢測抗體第二十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日第三十頁，共四十二頁，2022年，8月28日放射免疫測定法

(Radioimmunoassay,RIA)用放射性核素標(biāo)記抗原進(jìn)行的免疫學(xué)檢測技術(shù)。放射性核素顯示的高靈敏性，使檢測的敏感性達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長激素、藥物等微量物質(zhì)的測定。第三十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日免疫印跡法（Immunoblotting）將凝膠電泳與固相免疫測定結(jié)合，先把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測定。能分離分子大小不同的蛋白質(zhì)并確定其分子量。常用于檢測多種病毒（如HIV）的抗體或抗原。第三十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日免疫印跡法示意圖第三十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日第三節(jié)免疫細(xì)胞的檢測

檢測各種淋巴細(xì)胞的數(shù)量與功能是觀察機(jī)體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測標(biāo)本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細(xì)胞。實(shí)驗動物還可取胸腺、脾、淋巴結(jié)等作為標(biāo)本進(jìn)行檢查。第三十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后，緩慢加于分離液上第三十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日T細(xì)胞功能測定體外法：T細(xì)胞增殖試驗形態(tài)學(xué)檢查

3H-TdR摻入法

MTT法體內(nèi)法：用生物抗原或化學(xué)抗原作皮內(nèi)試驗。OT-PPD皮試

第三十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過濾測量放射性淋巴細(xì)胞增殖試驗（3H-TdR摻入法）示意圖第三十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日靶細(xì)胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應(yīng)細(xì)胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時細(xì)胞毒試驗（51Cr釋放法）示意圖：（Na51CrO4標(biāo)記靶細(xì)胞）第三十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日細(xì)胞毒試驗（乳酸脫氫酶釋放法）

正常情況下，乳酸脫氫酶（LDH）存在于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞損傷時，細(xì)胞膜通透性增加，LDH釋放，酶促顯色反應(yīng)。第三十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法

（Enzyme-LinkedImmunospot,ELISPOT)在ELISA的基礎(chǔ)上建立的檢測抗體生成細(xì)胞及細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞的方法。第四十頁，共四十二頁，2022年，8月28日CK抗體包被的反應(yīng)板

CK抗原包被的反應(yīng)板加入淋巴細(xì)胞加入酶標(biāo)記二抗加入