光譜分析技術hu

光譜分析技術hu第一頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日光是電磁波，可用波長“λ”表示，電磁波譜是由不同性質(zhì)的連續(xù)波長的光譜所組成，對于生物化學來說，最重要的波長區(qū)域是可見光和紫外光。光的波長是二個相鄰的波峰之間的距離。光的傳播是由相互垂直的電場分量“E”和磁場分量“H”所構成。λ＝C/νλ——波長C——光速ν——頻率，單位時間通過一個定點的波數(shù)。第二頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日紫外可見吸收光譜的形成

按照量子力學原理，分子能態(tài)按一定的規(guī)律跳躍式地變化，物質(zhì)在入射光的照射下，分子吸收光時，其能量的增加是不連續(xù)的，物質(zhì)只能吸收一定能量的光，吸收光的頻率和兩個能級間的能量差要符合下列關系：E＝E2-E1＝h第三頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日E1、E2分別表示初能態(tài)和終能態(tài)的能量，初能態(tài)與終能態(tài)之間的能量差愈大，則所吸收的光的頻率愈高（即波長愈短），反之則所吸收的光的頻率愈低（即波長愈長）。由于吸收是不連續(xù)的，因此在光的一定部位出現(xiàn)一系列吸收暗帶。因為分子轉(zhuǎn)動、振動及電子能級躍遷的能量差別較大，因此，它們的吸收光譜出現(xiàn)在不同的光譜區(qū)域。分子轉(zhuǎn)動能級級差小，△E＜0.05電子伏特（ev），分子轉(zhuǎn)動光譜的吸收出現(xiàn)在遠紅外或微波區(qū)。振動能級縱間的差別較大，E＝0.05～1.0ev，振動光譜出現(xiàn)在中紅外區(qū)。電子能級的級差更大，E＝1～20ev，所以由電子躍遷得到的光譜出現(xiàn)在可見、紫外或波長更短的光譜區(qū)。第四頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日可見光、紫外光吸收光譜，是由于分子中聯(lián)系較松散的價電子被激發(fā)產(chǎn)生躍遷從而吸收光輻射能量形成的，即分子由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，電子由一個低能級的軌道（即成鍵軌道），吸收了光能量躍遷到高能級軌道（稱為反鍵軌道）。第五頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長，并測定物質(zhì)對各種波長光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波長λ作橫坐標，“A”或“T”為縱座標，畫出連續(xù)的“A~λ”或“T~λ”曲線，即為該物質(zhì)的吸收光譜曲線。第六頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日第七頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日⑴曲線上“A”處稱最大吸收峰，它所對應的波長稱最大吸收波長，以λmax表示。⑵曲線上“B”處有一谷，稱最小吸收，它所對應的波長，所對應的波長，稱最小吸收波長，以λmin表示。⑶曲線上在最大吸收峰旁邊有一小峰“C”，稱肩峰。⑷在吸收曲線的波長最短的一端，曲線上“D”處，吸收相當強，但不成峰形，此處稱為末端吸收。第八頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日λmax是化合物中電子能級躍遷時吸收的特征波長，不同物質(zhì)有不同的最大吸收峰，所以它對鑒定化合物極為重要。吸收光譜中，λmax、λmin、-肩峰以及整個吸收光譜的形狀決定于物質(zhì)的性質(zhì)，其特征隨物質(zhì)的結構而異，所以是物質(zhì)定性的依據(jù)。測定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已知標準的紫外光譜圖相對照，對照時須注意測定的條件，如溶劑、濃度等。第九頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日常用標準的紫處吸收光譜是薩德勒研究實驗公司編制的“Sadtler”紫外標準圖譜集，到七十年代末為止已收集28585個化合物紫外光譜圖，此外還有藥物和非極性溶劑紫外光譜圖2000多幅。第十頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不象紅外光譜是許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜進行化合物定性鑒定時，應注意：化合物相同，其紫外光譜應完全相同；但是紫外光譜相同不一定化合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團或基團，因此在鑒定時應與紅外光譜相結合。第十一頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日常用的術語紫外光譜中常用的術語有發(fā)色團、助色團、增色效應和減色效應。發(fā)色團：凡是與飽和碳氫化合物連接能引起n→π*、π→π*、n→σ*等電子躍遷的基團稱為發(fā)色團。例如：C＝C、C＝O等發(fā)色團。助色團：助色團是一些具有非共價鍵的基團（如OH、NH2、SH等）。這些基團在波長＞200nm處沒有吸收，當它與發(fā)色團相連接時，使發(fā)色團的吸收帶向長波移動，稱為紅移（或淺色效應），紅移的同時吸收帶的強度增加。若助色團與發(fā)色團相連接，產(chǎn)生n→π*躍遷，使吸收波長向短波移動，稱為蘭移（或深色效應）。第十二頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日增色效應（hyperchromiceffect）:核酸變性或降解，使得DNA或RNA溶液對紫外光的吸收明顯增加，即ε值（吸光系數(shù)或稱消光系數(shù)）顯著升高，此現(xiàn)象稱為增色效應。此效應是由于堿基之間電子相互作用的改變所致，通常在260nm處測量。減色效應（hypochromiceffect）:在一定的條件下，變性的核酸又可以復性，此時ε值又明顯減少，回復到原來的核酸分子ε值較低的水平，即此時DNA或RNA溶液的紫外光吸收顯著降低，此現(xiàn)象稱為減色效應，此效應也是由于堿基之間電子相互作用的變化所引起的，通常在260nm條件下測量。第十三頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日有色溶液對可見光線有選擇性的吸收作用，有些無色溶液，所含物質(zhì)可以吸收特定波長的紫外線或紅外線。不同物質(zhì)由于其分子結構不同，對不同波長光線的吸收能力也不同，因此，每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜。利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質(zhì)進行定性定量分析和物質(zhì)結構分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術，使用的儀器稱為分光光度計。分光光度計靈敏度高，測定速度快，應用范圍廣。第十四頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日第二章光譜分析技術第一節(jié)朗伯-比爾（Lambert-beer）光吸收定律第二節(jié)分光光度計基本結構第三節(jié)光度法的誤差第四節(jié)分光光度法的應用第五節(jié)原子吸收分光光度法第六節(jié)熒光分析法第七節(jié)散射光譜分析法第十五頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)朗伯-比爾（Lambert-beer）1.1朗伯-比爾（Lambert-beer）光吸收定律：A：吸光度，又稱光密度“OD”T：透光度，T＝I/I0I0：照射到吸收池上的光強It：透過吸收池的光強。第十六頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日1.2吸光度、溶液濃度及液層厚度之間關系：A=εbCε：摩爾吸光系數(shù)或克分子吸光系數(shù)，L·mol-1·cm-1b：樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收地。C：樣品濃度，mol·L-1摩爾吸光系數(shù)ε是物質(zhì)對某波長的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越強，相應的分光度法測定的靈敏度就越高。ε值越大，說明電子躍遷的幾率大，通常ε＝10～105：一般認為ε＞104為強吸收；ε＝103～104

為較強吸收；ε＜102

為弱吸收，此時分光光度法不靈敏。第十七頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日1.3應用朗伯-比耳定律的條件：入射光波長應為λmax，且單色性好；被測溶液具有均勻性、非散射性(不渾濁，也不呈膠體)；被測物質(zhì)的濃度應在一定范圍內(nèi)；朗伯-比耳定律不僅適用于可見光，也適用于紅外光和紫外光；朗伯-比耳定律不僅適用于均勻非散射的液體，也適用于固體和氣體。因此，它是各類吸光光度法定量的依據(jù)，用途很廣。第十八頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)分光光度計基本結構2.1常見的分光光度計類型2.2分光光度計基本結構

2.2.1電光源系統(tǒng)

2.2.2樣品室

2.2.3單色器第十九頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日2.1常見的分光光度計類型2.1.1單光束分光光度計2.1.2雙光束分光光度計2.1.3雙波長分光光度計2.1.4光多道二極管陣列檢瀏分光光度計第二十頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日第二十一頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日2.1.1單光束分光光度計早期的分光光度計都是單光束的，例如751型、75lG型，有些仍為手動操作，即固定在某一波長，分別測量比較樣品、空白或參比液的透光率或吸光度，操作比較費時，要求光源和檢測器的供電電壓穩(wěn)定性高，用于繪制吸收光譜圖時很不方便，但其光路簡單，能量損失小，適用于物質(zhì)的定量分析。第二十二頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日2.1.2雙光束分光光度計雙光束分光光度計是目前發(fā)展最快，應用最為普遍的一種。既可直接讀數(shù)，又可掃描圖譜。因為單色光能在很短的時間內(nèi)交替通過空白和樣品溶液，所以可以減小因光源強度不穩(wěn)帶來的誤差。雙光束分光光度計在測量過程中不需移動吸收池，可在隨意改變波長的同時記錄吸光度。其操作簡單，測量快速，自動化程度高。測定含量時，為準確起見，仍宜用固定波長測量方式。第二十三頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日第二十四頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日2.1.3雙波長分光光度計雙波長分光光度計是將光源發(fā)出的光分成兩束，分別進人各自的單色器，獲得兩束波長可任意調(diào)節(jié)的單色光，然后交替照射到同一個吸收池，到達同一檢測器，測得在兩個波長處的吸光度差值△A，△A與被測組分的量成正比。此法可消除參比和樣品溶液組成不一致及比色池不匹配帶來的誤差，主要用于存在干擾組分的樣品、渾濁樣品和多組分混合樣品的測定。但儀器價格昂貴，體積較大。第二十五頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日第二十六頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日2.1.4光多道二極管陣列檢瀏分光光度計光多道二極管陣列檢測分光光度計是一種具有全新光路系統(tǒng)的儀器。具有光譜響應寬、數(shù)字化掃描準確、性能比較穩(wěn)定等優(yōu)點。由于全部波長同時被檢測，而且光二極管的響應很快，一般可在0.1s的極短時間內(nèi)獲得190～820nm范圍的全光光譜，可作為追蹤化學反應和反應動力學研究的重要工具。第二十七頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日隨著儀器的改進和計算機的應用，又出現(xiàn)了許多新的測量技術，如1～4階導數(shù)光譜測量技術、三波長分光光度法、速率分析或動力學分析等。第二十八頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日2.2分光光度計基本結構光源單色器吸收池檢測器顯示系統(tǒng)2.2.1電光源系統(tǒng)2.2.2樣品室2.2.3單色器第二十九頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日2.2.1電光源系統(tǒng)可見光源：鎢/鹵鎢燈(320-2500nm)，鹵鎢燈更好。紫外光源：氫燈和氘燈發(fā)光二極管，氘燈(160-375nm)，氘燈產(chǎn)生的光譜強度比氫燈大3～5倍，而且壽命也比氫燈長。

紅外光源：碘鎢燈(近紅外)、能斯持燈(中紅外)、汞燈(遠紅外)。線光源：空心陰極燈/金屬(汞/鈉)蒸汽燈激光光源：固體/氣體/染料激光器熒光分光光度計多用球形氙燈原子吸收光譜儀多用原子光譜燈，要求輻射的原子光譜線半寬度要窄，以利于提高儀器的靈敏度。第三十頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日能斯特燈是由鈰、鋯、釷和釔等氧化物燒結而成的長約2cm、直徑約1mm的實心或空心棒組成，工作溫度可達1300～1700℃，其發(fā)射的波長范圍約為1～30μm，它的壽命較長、穩(wěn)定性好。對短波范圍輻射效率優(yōu)于硅碳棒，但價格較貴，操作不如硅碳棒方便。硅碳棒是由碳化硅燒結而成的實心捧，工作溫度達1200～1500℃。對于長波，其輻射效率高于能斯特燈，其使用波長范圍比能斯特燈寬，發(fā)光面大，操作方便、廉價。第三十一頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日島津熒光分光光度計RF-5301PC熒光分光光度計在越來越多的領域發(fā)揮著巨大的作用，比如生命科學中的定性定量分析，化學中的光化學反應的研究，食品中的殘留農(nóng)藥檢測和環(huán)境中大氣、水質(zhì)、土壤的污染評估。相比于吸光度法，熒光法的靈敏度更高，選擇性也更好，把激發(fā)光、熒光波長相結合，可以測定混合物。RF-5301PC作為新一代的熒光分光光度計具有高水平的性價比和功能強大的軟件，從日常分析到科學研究都發(fā)揮了極大的作用第三十二頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日原子吸收光譜儀的光源主要采用空心陰極燈?？招年帢O燈的結構如左圖所示。1－紫外玻璃窗口；2－石英窗口，3－密封4－玻璃套，5－云母屏蔽；6－陽極；7－陰極；8－支架；9－管座，10－連接管腳第三十三頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日2.2.2樣品室紫外-可見分光光度計和熒光分光光度計的樣品室內(nèi)裝有比色皿，可以是玻璃或石英比色皿?？梢姽夥秶貌ＡП壬?。紫外光范圍用石英比色皿。原子吸收光譜儀的樣品室為原子化器，常用的原子化器有火焰和石墨爐。第三十四頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日2.2.3單色器凡能把復合光分解為按波長順序排列的單色光，并能通過出射狹縫分離出某一波長單色光的儀器，稱為單色器。分光光度計中所用的單色器有兩種類型：棱鏡單色器和光柵單色器。第三十五頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日單色器主要部分都是由入光狹縫、出光狹縫、色散元件、準直鏡以及附屬機械裝置所組成。入光狹縫起著限制復合光進入單色器的作用；色散元件起著把復合光分解為單色光的作用；準直鏡的作用一是把來自入光狹縫的光轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫泄?，投射到色散元件上，作用二是把來自色散元件的平行光束聚焦于出光狹縫上，形成光譜像；出光狹縫是單色光的出口。它只讓光譜帶中額定波長的光從狹縫中透出，而將其他波長的光擋住，不許其通過。第三十六頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日1、棱鏡單色器30゜利特羅（Litrow）式（自準式）60゜棱鏡利特羅（Litrow）式瓦茲渥斯（Wadsworch）式澤尼特（Czerny-Turner）式第三十七頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日光從一種介質(zhì)射到另一種介質(zhì)時，一部分光從界面反射回去稱為反射，另一部分光則改變前進方向進入第二種介質(zhì)稱為折射。若入射角為i、折射角為θ，則其折射率n為：n=sini/sinθ。不同的光學材料具有不同的折射率，即便是同一種光學材料以相同的入射角照射，若波長不同，得到的折射角也不一樣。第三十八頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日第三十九頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日2、光柵單色器光路圖光柵色散均勻、譜線清晰、工作波段寬，是棱鏡無法比擬的。再加上它所組成的單色器的結構比較簡單，所以近年來逐步取代了棱鏡，而成為色散元件的主角。第四十頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日光柵原是指大量等寬、等間距的平行狹縫所組成的光學元件，是一種多狹縫部件，光柵光譜的產(chǎn)生是多狹縫干涉和單狹縫衍射兩者聯(lián)合作用的結果。多縫干涉決定光譜線出現(xiàn)的位置，單狹縫衍射決定譜線的強度分布。光柵分為平面透射光柵和反射光柵，反射光柵應用更廣泛。反射光柵又可分為平面反射光柵（或稱閃耀光柵）和凹面反射光柵。第四十一頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日b為狹縫寬度d為光柵常數(shù)，它等于狹縫寬度加兩狹縫之間的距離，即相鄰兩刻痕間的距離。θ為衍射角。i為入射角光柵的色散原理圖光柵會聚透鏡透鏡焦平面上的受光屏平面透射光柵第四十二頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日當光以垂直方向照射光柵即i＝0°，則

n=0，±1，±2，……，

n稱為干涉的級?？梢缘玫椒Q為零級、一級、二級、……的光柵光譜。若入射光不是垂直地照射在光柵上，而是有一定的角度，則上式寫為：

該式稱為平面衍射光柵方程，簡稱光柵方程。第四十三頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日反射型復制光柵，它是在平面玻璃上粘結上一定角度刻槽的鋁反射膜而制成的。鋁膜很薄(約0.1～1.5um)、很亮，故從外表看不出和一般的反射鏡有什么明顯的差異。第四十四頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日光柵表面的鋁膜質(zhì)地很松軟，極易擦傷，所以在維護時，嚴禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去觸摸，否則會造成永久性損壞。萬一光柵上落上了灰塵，只能用吹氣球吹去。不同波長的光具有不同的衍射角，兩者成比例關系。波長長者衍射角大，波長短者衍射角小。因此，利用光柵可以把不同波長的光分開，這就是光柵的色散原理。第四十五頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日閃耀光柵光柵的寬度越大，總刻線數(shù)越多，分辨率越大。對同一線光譜而言，光柵的分辨率是常數(shù)，不隨波長而變化。i是入射角，θ是衍射角，β是光柵刻痕角。反射面與光柵平面的夾角，稱為閃耀角。第四十六頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3、濾光片在簡易的比色計中，使用濾光片能夠獲得有限波長范圍的光。濾光片分為吸收濾光片和干涉濾光片兩種。吸收濾光片由有色玻璃或內(nèi)夾在兩玻璃片之間的有色染料的明膠所組成，這種濾光片適用于可見光區(qū)。干涉濾光片是根據(jù)光的干涉原理設計的，它是由透明的電解質(zhì)（如氟化鈣或氟化鎂），夾在兩塊內(nèi)側(cè)涂有一層半透明金屬（如銀）簿膜的玻璃或石英片之間所組成。電解質(zhì)的厚度必須嚴格控制。這種濾光片適用于紫外光區(qū)。第四十七頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日偏離Beer定律的因素根據(jù)Beer定律，當波長和入射光強度一定時，吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度C成正比。不同濃度的標準溶液的吸光度，C與A之間的關系應該是一條通過原點的直線。但實際工作中常常會出現(xiàn)偏離直線的情況，即偏離Beer定律的現(xiàn)象。導致偏離的主要因素有化學因素與光學因素。第三節(jié)光度法的誤差第四十八頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3.1化學因素通常只有當溶液濃度小于0.01mol／L的稀溶液時Beer定律才能成立。隨著溶液濃度的改變，溶液中吸光物質(zhì)可因濃度的改變而發(fā)生離解、締合、溶劑化以及配合物組成等的變化，使吸光物質(zhì)存在形式發(fā)生變化，從而使吸光物質(zhì)對光吸收的選擇性和吸光強度也發(fā)生相應的變化。第四十九頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日

隨著濃度的增大，660nm處吸收峰減弱，而610nm處吸收峰增強，吸收光譜形狀改變。由于離子濃度的變化，使吸光度與濃度成正比的關系發(fā)生偏離。例1：亞甲藍陽離子水溶液的吸收光譜第五十頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日例2：重鉻酸鉀的水溶液有以下平衡：若溶液稀釋2倍，由于受稀釋平衡向右移動的影響，Cr2O72-離子濃度不是減小2倍，Cr2O72-

離子濃度的減少明顯地多于2倍。第五十一頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日Cr2O72-、CrO42-兩種離子在某一波長處吸光強度相差較大，致使重鉻酸鉀水溶液吸光度的降低與濃度的降低不成正比而偏離Beer定律。若控制溶液的酸度，在強酸性條件下測定Cr2O72-

，或在強堿條件下測定Cr2O72-

，偏離Beer定律的現(xiàn)象可以避免。第五十二頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3.2光學因素3.2.1非單色光Beer定律只適用于單色光，而實際用于測量的是一定波長范圍的復合光，由于吸光物質(zhì)對不同波長的光的吸收能力不同，就導致了對Beer定律的偏離。第五十三頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日例如，右圖所示的吸收光譜，用譜帶I所對應的波長進行分析，造成的偏離就比較小。用譜帶Ⅱ所對應的波長進行分析就會造成較大的偏離。通常選擇吸光物質(zhì)的最大吸收波長作為測定波長。這樣不僅能保證測定有較高的靈敏度，而且此處曲線較為平坦，吸光系數(shù)變化不大，對Beer定律的偏離程度就比較小。在保證一定光強的前提下，應使用盡可能窄的帶寬寬度，同時應盡量避免采用尖銳的吸收峰進行定量分析。第五十四頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3.2.2雜散光從單色光器得到的單色光中，還有一些不在譜帶范圍內(nèi)的與所需波長相隔甚遠的光，稱為雜散光(straylight)。主要由儀器光學系統(tǒng)的缺陷或光學元件受灰塵、霉蝕的影響而引起。特別是在透光率很弱的情況下，雜散光的影響尤為顯著。第五十五頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日雜散光Is常隨入射光強度I0的增大而增大。若供試品不吸收雜散光，(Is+I0)／(It+Is)<I0/It，A變小，為負偏離，供試品吸收雜散光，A增大，為正偏離。前一種情況在分析中常會遇到。

設照射光強度為I0，透過光強度為It，雜散光強度為Is，則觀察到的吸光度為：第五十六頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日隨著儀器制造工藝的提高，絕大部分波長內(nèi)雜散光的影響可忽略不計。但在接近紫外末端處，因在短波長光源強度和檢測器靈敏度均減弱，雜散光的比例相對增大，測定時可能會出現(xiàn)假峰。如用鎢燈作為光源時，350-400nm波長雜散光影響顯著；若用紫外光源時，220nm以下的雜散光迅速增大。第五十七頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3.2.3散射光和反射光吸光質(zhì)點對入射光有散射作用，吸收池內(nèi)外界面之間入射光通過時又有反射作用。散射光和反射光均由入射光譜帶寬度內(nèi)的光產(chǎn)生，對透射光強度有直接影響。散射和反射作用致使透射光強度減弱。真溶液散射作用較弱，可用空白進行補償?；鞚崛芤荷⑸渥饔幂^強，一般不易制備相同的空白溶液，常使測得的吸光度偏離，分析中不容忽視。第五十八頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3.2.4非平行光通過吸收池的光，一般都不是真正的平行光，傾斜光通過吸收池的實際光程將比垂直照射的平行光的光程長。使厚度增大而影響測量值。這種測量時實際厚度的變異也是同一物質(zhì)用不同儀器測定吸光系數(shù)時，產(chǎn)生差異的主要原因之一。第五十九頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3.3干擾的產(chǎn)生及其消除干擾物質(zhì)的影響有以下幾種情況：干擾物質(zhì)本身有顏色或無色但與顯色劑形成有色化合物，在測定條件下也有吸收；在顯色條件下，干擾物質(zhì)水解，析出沉淀使溶液混濁，致使吸光度的測定無法進行；與待測離子或顯色劑形成更穩(wěn)定的配合物，使顯色反應不能進行完全。第六十頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3.3.1控制酸度根據(jù)配合物的穩(wěn)定性不同，可以利用控制酸度的方法提高反應的選擇性，保證主反應進行完全。例如，雙硫腺能與Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+、等十多種金屬離子形成有色配合物，其中與Hg2+生成的配合物最穩(wěn)定，在o.5mol/mlH2SO4介質(zhì)中仍能定量進行，而上述其他離子在此條件下不發(fā)生反應。第六十一頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3.3.2選擇適當?shù)难诒蝿┦褂醚诒蝿┫蓴_是常用的有效方法。選取的條件是掩蔽劑不與待測離子作用；掩蔽劑以及它與干擾物質(zhì)形成的配合物的顏色應不干擾待測離子的測定。第六十二頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3.3.3利用生成惰性配合物

例如鋼鐵中微量鈷的測定常用鈷試劑為顯色劑，但鈷試劑不僅與Co2+發(fā)生反應，而且與Ni2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、等都有反應。鈷試劑與Co2+在弱酸性介質(zhì)中一旦完成反應后，即使再用強酸酸化溶液，該配合物也不會分解。Ni2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、等與鈷試劑形成的配臺物在強酸介質(zhì)中很快分解，從而消除了上述離子的干擾，提高了反應的選擇性。第六十三頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3.3.4選擇適當?shù)臏y量波長例如在K2Cr2O7存在下測定KMnO4時不是選λmax(525nm)，而是選λ=545nm。這樣測定KMn04溶液的吸光度，K2Cr2O7就不干擾。第六十四頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3.3.5選擇適宜的空白溶液空白溶液又叫參比溶液?？瞻兹芤撼靡孕Ｕ齼x器透光率100％或吸光度為零，除作為測量的相對標準外，在中藥制劑分析中還用于消除干擾吸收。溶劑、試劑、器皿及試樣本身都可能引入干擾因素。常見的空白溶液有：溶劑空白、試劑空白、試樣空白、不顯色空白、平行操作空白等。第六十五頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日1、溶劑空白在測定入射光波長下，溶液中只有被測組分對光有吸收，而顯色劑和其他組分對光無吸收，或雖有少許吸收，但所引起的測定誤差在允許范圍內(nèi)，在此情況下可用溶劑作為空白溶液。第六十六頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日2、試劑空白相同條件下只是不加試樣溶液，依次加入各種試劑和溶劑所得到的溶液稱為試劑空白溶液。適用于在測定條件下，顯色劑或其他試劑、溶劑等對待測組分的測定有干擾的情況。第六十七頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3、試樣空白與顯色反應同樣的條件取同量試樣溶液，不加顯色劑所制備的溶液稱為試樣空白溶液。適用于試樣基體有色并在測定條件下有吸收，而顯色劑溶液無干擾吸收．也不與試樣基體顯色的情況。第六十八頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4、不顯色空白某些顯色反應，當改變試劑加入順序或某一操作（如加熱改為不加熱）時，可使被測組分與顯色劑的顯色反應不發(fā)生，這樣配制的溶液稱為不顯色空白溶液。這種空白能夠同時消除試樣基體和試劑的干擾。第六十九頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日5、平行操作空白如果容器、器材、溶劑、試劑以及環(huán)境可能帶入被測組分或干擾組分時．可采用不含被測組分的試樣基體作為空白試樣，與試樣在完全相同條件下平行操作，然后用此溶液為空白溶液，這種空白可當作一個試樣來處理，測得的結果稱為空白值，應從試樣測得結果中減去。第七十頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日3.3.6分離若上述方法不宜采用時，也可以采用預先分離的方法，如沉淀、萃取、離子交換、蒸發(fā)和蒸餾以及色譜分離法等。此外，還可以利用化學計量學方法實現(xiàn)多組分同時測定。第七十一頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4.1定性分析4.2定量分析4.3分光光度法的具體應用第四節(jié)分光光度法的應用第七十二頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日1、比較吸收光譜曲線。2、比較最大吸收波長。3、比較吸光度比值。4.1定性分析第七十三頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日定性分析缺點：紫外和可見光譜的特征吸收帶是主要的定性依據(jù)，但在定性分析上的應用是有限的，因為其吸收帶很寬，缺乏精細結構的特征，在定性方面不如紅外吸收光譜。如果只有一兩個發(fā)色團相同，其它部分的結構略有不同，對紫外和可見光譜影響變化不大，往往具有十分接近的吸收光譜。所以在鑒定化合物時要注意，即使是光譜相同，未必是同一種化合物，要采用其它分析方法配合進一步鑒定。第七十四頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4.2定量分析定量分析的依據(jù)是比耳定律、在液層厚度一定時，溶液的濃度與吸光度要成正比關系。標準曲線法、對比法、標準增量法，多組分混合物分析法，雙波長分光光度法。第七十五頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4.2.1標準曲線法將一系列濃度不同的標準溶液按照一定操作過程顯色后，分別測吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。在相同條件下處理待測物質(zhì)并測定其吸光度，即可從標準曲線找出相對應的濃度。第七十六頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4.2.2對比法先配制一種己知濃度的標準溶液C標，測其吸光度為A標，再在相同條件下測得樣品溶液的吸光度為A樣，根據(jù)下列公式求得樣品濃度。此法可不做標準曲線．但要求溶液中的待測物質(zhì)能嚴格符合光的吸收定律，而且樣品溶液和標準溶液的吸光度值較為接近．這種方法的測定誤差比標準曲線法要大一些。第七十七頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4.2.3標準增量法采用標準曲線法使未知樣與標準樣保持一致，在實際中并不是總能做到的，

采用增量法可以彌補這一缺點。方法是將未知樣分成體積相同若干份，除其中一份不加已知被測組分外，其余都加，在合適條件下測定．如未知樣不含被測組分，吸光值A應為零，曲線過原點。但實際沒過原點，上截矩A1，校正后，曲線延長至OO’濃度為Cx如圖。第七十八頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日此法還可以檢查實驗過程的系統(tǒng)誤差．設樣品中校測組分真實含量為Cx．實驗值為C1，在樣品中增加已知量b時，測得實驗值為C2，實驗過程系統(tǒng)誤差為k則：必要條件是當被測組分含量的變化時K不隨其改變。第七十九頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4.2.4多組分混合物分析法當樣品溶液中含有二種以上組分時，由于組分之間吸收峰相互干擾情況不同，計算方式也有所不同。①吸收光譜不重疊②吸收光譜重疊第八十頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日①吸收光譜不重疊。在λ1處B無吸收，在λ2處A無吸收，所以可分別在λ1及λ2處測定組分A和B的濃反，直接應用比爾定律計算。第八十一頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日②吸收光譜重疊如果二組分各自的吸收光譜互相重疊，則混合物的吸收光譜為二組分各自吸收光譜的加和，則可根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。Aλ1=εaλ1bca+εbλ1bcb

Aλ2=εaλ2bca+εbλ2bcb

第八十二頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4.2.5雙波長分光光度法不需空白溶液作參比；但需要兩個單色器獲得兩束單色光(λ1和λ2)；以參比波長λ1處的吸光度Aλ1作為參比，來消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復雜試樣時顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測量精密度等方面都比單波長法有所提高。

ΔA＝Aλ2

－Aλ1

＝(ελ2

－ελ1)bc兩波長處測得的吸光度差值ΔA與待測組分濃度成正比。ελ1和ελ2分別表示待測組分在λ1和λ2處的摩爾吸光系數(shù)。第八十三頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日雙波長分光光度法關鍵問題測量波長λ2和參比波長λ1的選擇與組合以兩組分x和y的雙波長法測定為例：設：x為待測組分，y為干擾組分，二者的吸光度差分別為:ΔAx和ΔAy。則該體系的總吸光度差ΔAx+y為：

ΔAx+y=ΔAx+ΔAy如何選擇波長λ1

、λ2有一定的要求。第八十四頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日波長組合λ1

、λ2的基本要求是：⑴選定的波長λ1和λ2處，干擾組分應具有相同吸光度，即：

ΔAy=ΔAyλ2-ΔAyλ1=0

故：ΔAx+y=ΔAx=(εxλ2-εxλ1)bcx此時：測得的吸光度差ΔA只與待測組分x的濃度呈線性關系，而與干擾組分y無關。若x為干擾組分，則也可用同樣的方法測定y組分。⑵在選定的兩個波長λ1和λ2處待測組分的吸光度應具有足夠大的差值。采用作圖法選擇符合上述兩個條件的波長組合。第八十五頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4.3分光光度法的具體應用4.3.1蛋白質(zhì)測定雙縮脲法考馬斯亮藍G250染色法4.3.2核酸測定4.3.3葉綠素的測定第八十六頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4.3.1蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)的分析是生物化學和其它生物學科、食品檢驗、臨床診斷等領域最常涉及到的分析檢測手段。由于蛋白質(zhì)種類很多，分子組成、結構、分子量差別很大，功能各異，因此分析蛋白質(zhì)含且的方法很多，各有其持點。分光光度法是目前最常用的一種方法．第八十七頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日(1)雙縮脲法利用雙縮脲反應，蛋白質(zhì)與二價銅離子在堿性溶液中形成紫色絡合物，最大吸收波長在540nm，可測定含有10-1200ug/mL蛋白質(zhì)樣品，標準曲線的線性關系和重復性好．雙縮脲試劑：硫酸銅1.5g，酒石酸鉀鈉6g，碘化鉀1g，溶于適量水，攪拌狀態(tài)下加入300mL10％氫氧化鈉溶液，用水稀釋至1000mL，在塑料瓶中貯存．標淮曲線繪制及樣品測定：在試管中分別加入0.0，0.1，0.2，0.3、0.4，0.5，0.6mL標準蛋白液，用水補足到0.6ml，另取一份0.6mL樣品，上述溶液中分別加入2.4mL雙縮脲試劑，混均后室溫放置15min，540nm處測定．第八十八頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日(2)考馬斯亮藍G250染色法考馬斯亮藍G250，在酸性溶液中為棕紅色，它和蛋白質(zhì)通過疏水作用結合后產(chǎn)生顏色反應呈藍色。在595nm處有最大光吸收，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與595nm的吸收值成正比，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為l-140ug/mL，幾乎無測定干擾，靈敏度較高。配制顯色劑：將100mg考馬斯亮藍G250溶解于50mL95％的乙醇中。加入100mL85％的磷酸，加水稀釋至1L。配制標準蛋白溶液：在試管中分別加入含0，10，20，30，40，50，60ug的標準蛋白質(zhì)，加水至60uL．加3mL染色液，另取樣品液也加3mL染色液，混勻后室溫放置15min。595nm處測定。第八十九頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4.3.2核酸測定由于核酸和蛋白質(zhì)通常(結合在一起)以核蛋白的形式存在，所以在提純核酸的過程中．要測定其中蛋白質(zhì)雜質(zhì)的含量。通過兩個波長(260nm/280nm)的吸收讀數(shù)比率和空白的校正，即可估算核酸的純度。DNA比值為1.8，RNA比值為2.0。對核酸來說，260nm/280nm的比值越小，說明蛋白雜質(zhì)越多，兩個波長吸收比率小于所規(guī)定的最小值，則核酸純度不符合要求。第九十頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日常涉及到用于測定核酸樣品的波長有4個①230nm，肽鍵的吸收波長，用此波長檢測蛋白質(zhì)的含量比280nm處更靈敏．但常用緩沖液(如Tris等)對測定有干擾。②280nm，蛋白質(zhì)中芳香族氨基鼓的吸收波長，由于干擾少，經(jīng)常使用。③260nm，大多數(shù)單核苷酸的最大吸收波長均在260nm附近，用來檢測核酸的含量。④320nm，用于本底校正，核酸和蛋白質(zhì)在此波長下無吸收，一些干擾因素（如散射光）可產(chǎn)生吸收。為使用方便起見，將上述4種波長按不同組合編成四個固定的指定參數(shù)方法。第九十一頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日核酸測定的四種指定的參數(shù)法：(1)測定260nm/280nm及280nm/260nm的比率。(2)測定260nm/280nm及280nm/260nm的比率，背景校正波長320nm。(3)測定230nm/280nm及260nm/230nm的比率，背景校正波長320nm。(4)測定260nm/280nm及280nm/260nm的比率，用Warburg和Christian系數(shù)計算蛋白質(zhì)和核酸濃度。第九十二頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日核酸中的嘌呤、嘧啶、蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸都有共軛雙鍵，分別在波長260nm、280nm處有紫外吸收。由于各種核酸、蛋白的差異很大，為了更準確的測定核酸和蛋白質(zhì)的濃度，用經(jīng)典濃度公式，即Warburg和Christian濃度公式測定核酸和蛋白質(zhì)濃度．蛋白質(zhì)(ug/mL)＝1552×A280－757.3×A260核酸（ug/mL）＝62.9×A260－

36×A280第九十三頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4.3.3葉綠素的測定將2g鮮重葉片放在干凈研缽內(nèi)，加40mL80％丙酮，把組織研磨勻漿，研磨大約3min，小心地把綠色液體轉(zhuǎn)移到一個墊有濾紙的漏斗內(nèi)，當過濾提取液時(抽濾)，用另外30mL80％丙酮重復研磨所剩物成勻漿，3-4min之后，如前一樣將第二次提取液過濾到含第一次提取液的燒瓶里。最后用80％丙酮將濾液定容至100mL。葉綠素有葉綠素a和葉綠素b，它們分別有持征吸收光譜。在丙酮提取液中，葉綠素a在波長663nm；葉綠素b在波長645nm有吸收蜂。第九十四頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日式中Ca、Cb分別為葉綠素a及葉綠素b的濃度，為了便于區(qū)別用d代表光徑。當d=1.0cm，C取mg/mL為單位時，其ε值已由實驗測定，分別為：

εa1=82.09εb1=9.24εa2=16.75εb2=45.6葉綠素提取液的消光度在兩種波長下分別為A1及A2，它們可寫為：第九十五頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日可得到每克葉片中所含葉綠素的毫克數(shù):W為葉片的鮮重、單位為克．V是80％丙酮-葉綠素提取液的最終體積，單位為毫升．測量時以80％丙酮為空白對照，比色池的光徑為10mm。第九十六頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日另外，葉綠素a、b的等吸收點在652nm，故可在652nm測定。第九十七頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日4.3.4酶動力學研究分光光度法是酶動力學研究最有效的工具。通過酶促反應動力學的研究，有助于了解酶與底物的結合機制和作用方式、酶的底物濃度與酶促反應速度的關系符合米氏理論。第九十八頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日第五節(jié)原子吸收分光光度法1802年，發(fā)現(xiàn)原子吸收現(xiàn)象：原子蒸氣對其原子共振輻射吸收的現(xiàn)象；1955年，澳大利亞物理學家WalshA（瓦爾西）發(fā)表了著名論文：《原子吸收光譜法在分析化學中的應用》，奠定了原子吸收光譜法的基礎，之后迅速發(fā)展。第九十九頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日原子吸收光譜法特點：(1)檢出限低，10-10～10-14g；(2)準確度高，誤差在1%～5%；(3)選擇性高，一般情況下共存元素不干擾；(4)應用廣，可測定各種樣品中70多個元素。原子吸收光譜法局限性：(1)難熔元素、非金屬元素測定困難(2)不能同時多元素第一百頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日第六節(jié)熒光分析法某些物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后，能立即放出能量較低（亦即波長較長）的光。當照射停止后，如化合物的發(fā)射在10-9秒鐘內(nèi)停止，則稱熒光超過此限度即稱為磷光。熒光的波長與被照射物質(zhì)有關。以紫外線作激發(fā)光源，所發(fā)射的熒光常在可見光區(qū)。測量熒光強度以確定物質(zhì)含量的方法叫做熒光分析法，所使用的儀器叫熒光計。第一百零一頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日6.1原理設IF為熒光強度；I0入射紫外線強度；It為透過溶液后紫外線強度；Ia為溶液吸收紫外線；則：Ia=I0-ItC為溶液中被測物質(zhì)的濃度；l為溶液層的厚度。第一百零二頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日據(jù)朗伯-比爾定律A=εlc經(jīng)數(shù)學推導，當濃度很小時：又Ia=I0-It，則第一百零三頁，共一百一十八頁，2022年，8月28日熒光強度IF與物質(zhì)吸收紫外線的強度成正比當紫外線的強度一定，溶液的厚度一定，對同