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復(fù)習(xí)回顧1、基因工程又稱(chēng)為?2、基因工程中用到的工具中,“分子手術(shù)刀”是?來(lái)源是?其作用是?體現(xiàn)了酶的什么特性?作用部位是什么鍵?3、限制酶切割之后的結(jié)果是產(chǎn)生?從中軸線兩側(cè)切割得到的是什么末端?從中軸線處切開(kāi)呢?4、獲得目的基因需要切幾個(gè)切口?產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端?5、“分子縫合針”是?根據(jù)什么分為兩大類(lèi)?哪兩大類(lèi)?這兩類(lèi)酶的區(qū)別是?6、載體主要有哪幾類(lèi)?最常用的是?它的本質(zhì)是?載體必須具備的四個(gè)條件是?大腸桿菌(EcoRI)的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列,并在G和A之間切開(kāi)。寫(xiě)出切開(kāi)后產(chǎn)生的粘性末端?;蚬こ痰幕静僮鞒绦蛟思?xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。:編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上

游有啟動(dòng)子,下游有終止子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子:能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子:不能編碼蛋白質(zhì)的序列:有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子,下游有終止子非編碼序列:包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定目前被較廣泛提取使用的目的基因有:蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。一、目的基因的獲取目的基因供體生物細(xì)胞取出DNA限制酶剪去多余部分限制酶1.目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取目的基因的常用方法(1)從基因文庫(kù)中獲?。?)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增(3)人工合成1.概念:基因文庫(kù)(genelibrary)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)(如cDNA文庫(kù))

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱(chēng)為基因文庫(kù)(genelibrary)基因組文庫(kù):

基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù).部分基因文庫(kù):

基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù).基因因組組文文庫(kù)庫(kù)與與部部分分基基因因文文庫(kù)庫(kù)的的關(guān)關(guān)系系3.如何何從從基基因因文文庫(kù)庫(kù)中中得得到到所所需需要要的的基基因因??依據(jù)據(jù)::目目的的基基因因的的有有關(guān)關(guān)信信息息。。如::根根據(jù)據(jù)基因因的的核核苷苷酸酸序序列列基因因的的功功能能基基因因在在染染色色體體上上的的位位基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。4.為為什什么么要要構(gòu)構(gòu)建建基基因因文文庫(kù)庫(kù)??直直接接從從含含有有目目的的基基因因的的生生物物體體內(nèi)內(nèi)提提取取不不行行嗎嗎??構(gòu)建建基基因因文文庫(kù)庫(kù)是是獲獲取取目目的的基基因因的的方方法法之之一一,,并并不不是是唯唯一一的的方方式式。。如如果果所所需需要要的的目目的的基基因因序序列列已已知知,,就就可可以以通通過(guò)過(guò)PCR方式式從從含含有有該該基基因因的的生生物物的的DNA中,,直直接接獲獲得得,,也也可可以以通通過(guò)過(guò)反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄,,用用PCR方式式從從mRNA中獲獲得得,,不不一一定定要要構(gòu)構(gòu)建建基基因因文文庫(kù)庫(kù)。。但如如果果所需需要要的的目目的的基基因因的的序序列列完完全全不不知知,或或只知知道道目目的的基基因因序序列列的的一一段段,或或想從從一一種種生生物物體體內(nèi)內(nèi)獲獲得得許許多多基基因因,或或者者想知知道道這這種種生生物物與與另另一一種種生生物物之之間間有有多多少少基基因因不不同同,或或者者想知知道道一一種種生生物物在在個(gè)個(gè)體體發(fā)發(fā)育育的的不不同同階階段段表表達(dá)達(dá)的的基基因因有有什什么么不不同同,或或者者想得得到到一一種種生生物物的的全全基基因因組組序序列列,往往往往就就需需要要構(gòu)構(gòu)建建基基因因文文庫(kù)庫(kù)。。2.利利用用PCR技技術(shù)術(shù)擴(kuò)擴(kuò)增增目目的PCR———多多聚聚酶酶鏈鏈?zhǔn)绞椒捶磻?yīng)應(yīng)是一項(xiàng)生生物體外復(fù)制制特定DNA片段的核核酸合成成技術(shù)。。通過(guò)此此技術(shù),,可獲取取大量的的目的基基因。PCR技術(shù)原理:前提:原料能量方式PCR擴(kuò)增儀DNA復(fù)制一段已知知目的基基因的核核苷酸序序列:以_____方式擴(kuò)增增,即____(n為擴(kuò)增循循環(huán)的次次數(shù))指數(shù)2n模板DNA;DNA引物;四種脫氧氧核苷酸酸;熱穩(wěn)定DNA聚合酶((Taq酶);過(guò)程變性、退退火、延延伸三步步曲變性:加熱至90~95℃雙鏈DNA解鏈鏈成為單單鏈DNA退火:冷卻至55~60℃引物與部分模板的單單鏈DNA的特特定互補(bǔ)補(bǔ)部位相相配對(duì)和和結(jié)合延伸:加熱至70~75℃以目的基基因?yàn)槟D0澹虾铣苫パa(bǔ)補(bǔ)的新DNA鏈鏈變性退火延伸3.人人工合成成——根據(jù)已知知的氨基基酸序列列合成DNA蛋白質(zhì)的的氨基酸酸序列mRNA的核苷酸酸序列結(jié)構(gòu)基因因的核苷苷酸序列列推測(cè)推測(cè)目的基因因化學(xué)合成成二.基因因表達(dá)載載體的構(gòu)構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端端兩個(gè)切口獲得目的的基因DNA連接酶重組DNA分子(重重組質(zhì)粒粒)同一種限限制酶酶目的基因因與運(yùn)載載體的結(jié)結(jié)合過(guò)程程,實(shí)際際上是不不同來(lái)源源的基因因重組的的過(guò)程。。目的:組成:1、使目的的基因在在受體細(xì)胞胞中穩(wěn)定存存在,且且可以遺遺傳給下下一代,,2、使目的的基因能能夠表達(dá)和發(fā)揮作用用。它們各自自的作用用是什么么?目的基因因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因因+復(fù)制原點(diǎn)點(diǎn)啟動(dòng)子::位于基因因的首端端的一段段特殊的的DNA片斷,它它是RNA聚合酶識(shí)識(shí)別和結(jié)結(jié)合的部部位,有有了它才才能驅(qū)動(dòng)基因因轉(zhuǎn)錄出出mRNA,最終獲獲得蛋白白質(zhì)終止子::位于基因因的尾端端的一段段特殊的的DNA片斷,能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因因的作用是是為了鑒別受體細(xì)胞胞中是否否含有目目的基因因,從而而將有目目的基因因的細(xì)胞胞篩選出出來(lái)復(fù)習(xí)回顧顧1、基因工工程的基基本操作作程序的的四個(gè)步步驟是??核心是是?2、目的基基因指的的是什么么基因??3、獲取目目的基因因常用的的三種方方法是??其中人人工合成成法又包包括哪兩兩種?4、基因文文庫(kù)包括括哪兩類(lèi)類(lèi)?它們們有什么么區(qū)別??5、PCR的原理是是?PCR擴(kuò)增過(guò)程程中的解解旋方式式是?PCR需要的條條件有??7、基因表表達(dá)載體體的構(gòu)建建的目的的是?8、一個(gè)基基因表達(dá)達(dá)載體的的組成包包括哪幾幾部分??9、標(biāo)記基基因的作作用是??10、啟動(dòng)子子,終止止子的位位置,作作用?起起始密碼碼子,終終止密碼碼子呢??三、將目目的基因因?qū)胧苁荏w細(xì)胞胞(一)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化:(二)方方法將目的基基因?qū)肴胫参锛?xì)胞胞將目的基基因?qū)肴雱?dòng)物細(xì)胞胞將目的基基因?qū)肴胛⑸锛?xì)細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法(雙、裸裸)基因槍法法(單)花粉管通通道法——顯微注射射技術(shù)——用鈣離子子處理細(xì)細(xì)胞得到感受態(tài)細(xì)細(xì)胞目的基因因進(jìn)入_________內(nèi),并且且在受受體細(xì)細(xì)胞內(nèi)維維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞胞穩(wěn)定表達(dá)1、將目的的基因?qū)?dǎo)入植物物細(xì)胞的的方法::(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法①農(nóng)桿菌特特點(diǎn):易感染雙雙子葉植植物和裸裸子植物物,對(duì)大大多數(shù)單單子葉植植物沒(méi)有有感染能能力②原理:Ti質(zhì)粒上的的T-DNA可以轉(zhuǎn)移移到受體體細(xì)胞,,并整合合到受體體細(xì)胞染色體的的DNA上。③過(guò)程:(2)基因槍法法(3)花粉管通通道法2、將目的的基因?qū)?dǎo)入動(dòng)物物細(xì)胞①方法:顯顯微注射射法②程序:目的基因因表達(dá)載載體提純純?nèi)∪÷崖眩ㄊ芫眩╋@顯微注射射受受精精卵新新性性狀動(dòng)物物3、將目的的基因?qū)?dǎo)入微生生物細(xì)胞胞①原核生物物特點(diǎn)::繁殖快快、單細(xì)細(xì)胞、遺遺傳物質(zhì)質(zhì)少②方法:用Ca2+處理細(xì)胞胞感受態(tài)細(xì)細(xì)胞表達(dá)載體體與感受受態(tài)細(xì)胞胞混合感感受受態(tài)細(xì)胞胞吸收DNA分子(二)方方法將目的基基因?qū)肴胫参锛?xì)細(xì)胞將目的的基因因?qū)肴雱?dòng)物細(xì)細(xì)胞將目的的基因因?qū)肴胛⑸镂锛?xì)胞胞農(nóng)桿菌菌轉(zhuǎn)化化法(雙、、裸))基因槍槍法((單)花粉管管通道道法——顯微注注射技技術(shù)——用鈣離離子處處理細(xì)細(xì)胞得到感受態(tài)態(tài)細(xì)胞胞四、目目的基基因的的檢測(cè)測(cè)與鑒鑒定——檢查是是否成成功(一))、檢檢測(cè)1、檢測(cè)測(cè)轉(zhuǎn)基基因生生物染染色體體的DNA上是否插插入了了目的的基因因(關(guān)鍵步步驟)①首先先取出出轉(zhuǎn)基基因生生物的的基因因組DNA②用含目的基基因的的DNA片片段用放射射性同同位素素等作作標(biāo)記記,以以此做做探針③使探針針和轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因生物物的基基因組組雜交交,若若顯示示出雜雜交帶帶,表表明基基因已已插入入染色色體DNA中(1)方法:DNA分子雜雜交(2知識(shí)延延伸——DNA分子雜雜交技技術(shù)該方法法是根根據(jù)堿堿基互互補(bǔ)配配對(duì)原原則,,把互互補(bǔ)的的雙鏈鏈DNA解開(kāi),,把單單股的的DNA小片段段用同同位素素、熒熒光分分子或或化學(xué)學(xué)發(fā)光光催化化劑等等進(jìn)行行標(biāo)記記,之之后同同被檢檢測(cè)的的DNA中的同同源歸納步步驟(二))、鑒鑒定((個(gè)體體生物物學(xué)水水平))2、檢測(cè)測(cè)目的的基因因是否轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄出出了mRNA3、檢測(cè)測(cè)目的的基因因是否翻翻譯成成蛋白白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒鑒定、、抗病病鑒定定、活活性鑒鑒定等等①方法:方法:抗原-抗體雜雜交②過(guò)程:用上述述探針針和轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因生物物的mRNA雜交,若出現(xiàn)現(xiàn)雜交交帶,表明目目的基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄出出了mRNA歸納步驟驟(四)目的基因因的檢測(cè)測(cè)與鑒定定——檢查是否

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