基因工程的操作程序

復(fù)習(xí)回顧1、基因工程又稱(chēng)為？基因工程的原理是?2、基因工程中用到的工具中，“分子手術(shù)刀”是？來(lái)源是？其作用是？體現(xiàn)了酶的什么特性？作用部位是什么鍵？3、限制酶切割之后的結(jié)果是產(chǎn)生？從中軸線兩側(cè)切割得到的是什么末端？從中軸線處切開(kāi)呢？4、獲得目的基因需要切幾個(gè)切口？產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？切割質(zhì)粒呢？5、“分子縫合針”是？根據(jù)什么分為兩大類(lèi)？哪兩大類(lèi)？這兩類(lèi)酶的區(qū)別是？6、DNA連接酶連接的是？DNA聚合酶連接的是？7、DNA連接酶作用于什么鍵？8、載體主要有哪幾類(lèi)？其中，最常用的是？它的本質(zhì)是？9、載體必須具備的四個(gè)條件是？10、寫(xiě)出限制酶切割后的黏性末端。基因工程的基本操作程序原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有啟動(dòng)子，下游有終止子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子

基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定問(wèn)題1一：目的基因的獲取

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因，還有植物的抗病（抗病毒、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。

1.目的基因主要是指___________________編碼蛋白質(zhì)的基因目的基因指的是：？也可以是具有調(diào)控作用的因子獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、人工合成目的基因反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)1.基因文庫(kù)概念2.基因文庫(kù)類(lèi)型基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（包含一種生物的所有基因）（包含一種生物的一部分基因）(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因3.基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼敢欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)4.cDNA文庫(kù)的構(gòu)建建提取某種生物物的某器官或或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接接cDNA文庫(kù)庫(kù)反（逆）轉(zhuǎn)錄錄酶DNA聚聚合酶導(dǎo)入受體菌中中儲(chǔ)存兩種基因文庫(kù)庫(kù)的主要區(qū)別別如下表（課課本P10））文庫(kù)類(lèi)型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小小大基因中啟動(dòng)子無(wú)有基因中內(nèi)含子無(wú)有基因多少部分基因全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以總結(jié)1、概念：PCR全稱(chēng)為為_(kāi)_______________，是一項(xiàng)項(xiàng)在生物____復(fù)復(fù)制_____________的的核酸合成技技術(shù)3、條件：2、原理：__________多聚酶鏈?zhǔn)椒捶磻?yīng)體外特定DNA片段DNA雙鏈復(fù)制(二)利用PCR技術(shù)術(shù)擴(kuò)增增目目的的基基因因模板板（目目的的基基因因））原料料(脫脫氧氧核核苷苷酸酸)引物物（一一小小段段單單鏈鏈DNA））耐高高溫溫的的DNA聚聚合合酶酶（（Taq酶酶））溫度度控控制制4、、操操作作前前提提：：一段段已已知知目目的的基基因因的的核核苷苷酸酸序序列列，，以以便便合合成成引引物物。。6、結(jié)果果：5、擴(kuò)增增形式：：指數(shù)形式式（2n）在短時(shí)間間內(nèi)大量量擴(kuò)增目目的基因因7、過(guò)程程：a、變性性（90℃℃-95℃）：：雙鏈DNA模模板在熱熱作用下，_____斷裂裂，形成成___________b、復(fù)性性（55℃℃-60℃）：：系統(tǒng)溫溫度降低低，引物物與DNA模模板結(jié)合合，形成成局部________。c、延伸伸（70℃℃-75℃）：：在Taq酶的的作用下下，從引物開(kāi)始始進(jìn)行堿堿基互補(bǔ)補(bǔ)配對(duì)，，合成與與模板互補(bǔ)補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈(二)利利用PCR技術(shù)術(shù)擴(kuò)增目目的基因因動(dòng)畫(huà)演演示（三）人人工合成成目的基基因反轉(zhuǎn)錄法法：以目的基基因轉(zhuǎn)錄錄成的信信使RNA為模模板，反反轉(zhuǎn)錄成成互補(bǔ)的的單鏈DNA，，然后在在酶的作作用下合合成雙鏈鏈DNA，從而而獲得所所需的基基因?；瘜W(xué)合成成法DNA合成儀推測(cè)推測(cè)合成前提：基因比較較小、核核苷酸序序列已知知蛋白質(zhì)的的氨基酸酸順序mRNA核苷酸酸序列基因DNA的核核苷酸酸序列列目的基因問(wèn)題43、如如果不不知道道目的的基因因的核核苷酸酸序列列，可可采用用_________________獲取目目的基基因的的三種種方法法應(yīng)用用1、如如果有有目的的基因因的核核苷酸酸序列列，而而且基基因比比較大大，可可采用用____________2、如如果知知道目目的基基因的的序列列，而而且基基因比比較小小，可可采用用________________PCR技術(shù)術(shù)擴(kuò)增增化學(xué)合合成法法從基因因文庫(kù)庫(kù)獲取取的方方法復(fù)習(xí)回回顧1、基基因工工程的的基本本操作作程序序的四四個(gè)步步驟是是？核核心是是？2、目目的基基因指指的是是什么么基因因？3、獲獲取目目的基基因常常用的的三種種方法法是？？其中中人工工合成成法又又包括括哪兩兩種?4、基基因文文庫(kù)包包括哪哪兩類(lèi)類(lèi)？5、PCR的原原理是是？PCR全稱(chēng)稱(chēng)是？？PCR擴(kuò)擴(kuò)增過(guò)過(guò)程中中的解解旋方方式是是？PCR需要要的條條件有有？6、基基因表表達(dá)載載體的的構(gòu)建建的目目的是是？7、一一個(gè)基基因表表達(dá)載載體的的組成成包括括哪幾幾部分分？8、標(biāo)標(biāo)記基基因的的作用用是？？9、啟啟動(dòng)子子，終終止子子的位位置，，作用用？起起始密密碼子子，終終止密密碼子子呢？？二：基基因表表達(dá)載載體的的構(gòu)建建———基因因工程程的核心1目的：：使目的的基因因在受受體細(xì)細(xì)胞中中穩(wěn)定存存在，并且且可以以遺傳給給下一一代，同時(shí)時(shí)使目目的基基因能能夠表達(dá)和和發(fā)揮揮作用。。2組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因等啟動(dòng)子子：位于基基因的的首端的一段段特殊殊的DNA片斷斷，RNA聚合合酶識(shí)別和和結(jié)合合的部部位，，啟動(dòng)動(dòng)轉(zhuǎn)錄錄終止子子：位于基基因的的尾端的一段段特殊殊的DNA片斷斷，能能終止mRNA的的轉(zhuǎn)錄錄（與與終止止密碼碼子區(qū)區(qū)別））標(biāo)記基基因：：鑒別受體細(xì)細(xì)胞中中是否否含有有目的的基因因，從從而將將有目目的基基因的的細(xì)胞胞篩選出來(lái)3.基因表表達(dá)載體的的構(gòu)建過(guò)程程質(zhì)粒DNA分子子限制酶處理理兩個(gè)切口四個(gè)黏性末末端DNA連接接酶重組DNA分子（重重組質(zhì)粒））同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末末端三、將目的的基因?qū)肴胧荏w細(xì)胞胞1轉(zhuǎn)化概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。2轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)：目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上生物種類(lèi)植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細(xì)胞一般是體細(xì)胞受精卵-------------4、目的基因因?qū)胧荏w體細(xì)胞的方方法1、將目的的基因?qū)肴胫参锛?xì)胞胞的方法：：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化化法①農(nóng)桿菌特點(diǎn)點(diǎn)：易感染雙子子葉植物和和裸子植物物，對(duì)大多多數(shù)單子葉葉植物沒(méi)有有感染能力力②原理：Ti質(zhì)粒上上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到到受體細(xì)胞胞，并整合合到受體細(xì)細(xì)胞染色體的DNA上。三、目的基基因?qū)胧苁荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)入穩(wěn)定維持和和表達(dá)③過(guò)程：（2）基因槍法：目的基因?qū)?dǎo)入單子葉植物物細(xì)胞基因槍法（3）花粉管通道道法：將目的基因因?qū)胫参镂锛?xì)胞①操作方法法：在植物物花受粉后后，花粉形形成花粉管管還末愈合合前期，剪剪去柱頭，，然后，滴滴入DNA（含的基基因）使目目的基因借借助花粉管管通道進(jìn)入入受體細(xì)胞胞②特點(diǎn):十分分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)濟(jì)。③例：轉(zhuǎn)基因因抗蟲(chóng)棉（（我國(guó)）（4）、將將目的基因因?qū)雱?dòng)物物細(xì)胞方法：顯微注射法法目的基因表表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新新性狀動(dòng)物物為什么動(dòng)物物細(xì)胞要用用受精卵做做受體細(xì)胞胞？全能性受限限制（5）、將將目的基因因?qū)胛⑸锛?xì)胞①微生物作受受體細(xì)胞優(yōu)優(yōu)點(diǎn)：繁殖快、多多為單細(xì)胞胞、遺傳物物質(zhì)相對(duì)少少②常用菌：：大腸桿菌菌③常用法：：Ca2+處理獲得感感受態(tài)細(xì)胞胞（改變細(xì)胞胞壁的通透透性）④過(guò)程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞胞吸收DNA表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合導(dǎo)入過(guò)程完完成后，全全部受體細(xì)細(xì)胞都能攝攝入入重組DNA分子嗎嗎？真正能攝入入重組DNA分子的的受體細(xì)胞胞很少，且且有的會(huì)攝攝入載體-載體，目目的基因-目的基因因類(lèi)型目的基因進(jìn)進(jìn)入受體細(xì)細(xì)胞后，是是否都能穩(wěn)穩(wěn)定維持和和表達(dá)？不一定，需需要檢測(cè)問(wèn)題4問(wèn)題5——檢查是是否成功分子水平個(gè)體水平：：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基基因生物染染色體的DNA上是否插入入了目的基基因②檢測(cè)目的的基因是否否轉(zhuǎn)錄出了了mRNA③檢測(cè)目的的基因是否否翻譯成蛋蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、、抗病鑒定定、活性鑒鑒定等方法、工具具：方法、工具具：方法、工具具：DNA分子子雜交、DNA探針針?lè)肿与s交、、DNA探探針抗原-抗體體雜交、抗抗體四、目的基基因的檢測(cè)測(cè)與鑒定方法：接種實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因生物物染色體的的DNA上上是否插入入了目的基因基因探針：：放射性同位位素等標(biāo)記記的含有目目的基因DNA片段段方法——DNA分子子雜交技術(shù)術(shù)變性變性知識(shí)延伸——DNA分子子雜交技術(shù)術(shù)該方法是根根據(jù)堿基互互補(bǔ)配對(duì)原原則，把互互補(bǔ)的雙鏈鏈DNA解解開(kāi)，把單單股的DNA小片段段用同位素素、熒光分分子或化學(xué)學(xué)發(fā)光催化化劑等進(jìn)行行標(biāo)記，之之后同被檢檢測(cè)的DNA中的同同源互補(bǔ)序序列雜交，，從而檢出出所要查明明的DNA或基因。。變性方法——分子雜交技技術(shù)（2）檢測(cè)測(cè)目的基因因是否轉(zhuǎn)錄錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物物的mRNA14N14N提?。?）檢測(cè)測(cè)目的基因因是否翻譯譯成蛋白質(zhì)質(zhì)方法——抗抗原-抗體體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋蛋白將Bt毒蛋蛋白注射小小鼠體內(nèi)從小鼠血管管抽出血液液分離出抗抗Bt毒素素的抗體抗體蛋白質(zhì)出現(xiàn)雜交帶帶脫分化組織培養(yǎng)（4）除上上述分子檢檢測(cè)外，有有時(shí)還需進(jìn)進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)學(xué)水平的鑒鑒定：如抗抗性特性——檢