生化課件華科-上蛋白質(zhì)

HCO+ O 蛋白質(zhì)(Protein)復(fù)習(xí):肽肽一肽（peptide）多肽肽的理化性蛋白質(zhì)一級結(jié)肽的固相合1.11.1連接方式：肽鍵(peptidebond個(gè)氨基酸的羧基與另OOHHNHCCOH HNHCCOH O H HNCCNHCCNCCNHCC氨基酸順N-末端ASHC-FVC氨基酸殘基(aminoresidue)肽肽鏈方向性（從N末端指向C末端肽鍵具有部分雙鍵的肽鍵不可自由旋轉(zhuǎn) NHCO及Ca、Cb共平面（肽平面）肽鍵比一般碳-氮單鍵短（肽鍵中的C-N鍵長為0.132nm，介于0.148nm（C-N）和0.127nm（C=N）之間肽肽肽肽一肽（peptide）多 兩個(gè)氨基酸縮合形成二肽，三個(gè)氨基酸縮合形成三肽由幾個(gè)至十幾個(gè)基酸相連而的肽稱為寡ip),由 的氨基酸連形成的肽為多ppd)1.2肽的理化性質(zhì)①肽鍵中的游離末端α-H、α-CH及側(cè)鏈R基上的可解離基團(tuán)pKaα-羧基的pKa值比游離氨基酸的大，末端⑤雙縮尿反應(yīng)：兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵化合物與CuSO堿性溶液1.21.2肽的理化性質(zhì)⑥肽的水解非特異水解H+、OH-（高溫）如6NHCl11012-24h完全水解，即所有的H如：rpin、Ppin等 非特異：如肼肽二硫生物活性肽肽類激素：催產(chǎn)素、加壓素抗生素：短桿菌肽S神經(jīng)肽：腦啡Phe短桿菌肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Leu-腦啡GlnS+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Met-腦啡Gly加壓美籍化學(xué)家VincentduVgneaud已美籍化學(xué)家VincentduVgneaud已ILe正是由于這項(xiàng)成果，Vincent GlnSGly1.3蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)（primarystructure)：指蛋白質(zhì)的多肽鏈中氨基酸的排列順序；主要靠肽鍵維系，有些包含二硫鍵。1.31.3測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的要樣品必需純（>97%以上知道蛋白質(zhì)的分子量（誤差蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)(Primarystructure)測定包括：多肽鏈的氨基酸順多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目能的基礎(chǔ)。1.3氨基酸序列測定的第一人:FSng 1.31.3獎(jiǎng)人工合成胰島素就成了一項(xiàng)世界性的熱門課題據(jù)，1955- ，在世界范圍內(nèi)共有10研究1958年開始研究，1965年，中國世界上首次成功人工合成胰島素， 了中國科學(xué)工作者歷經(jīng)八年的科研關(guān)，奪得了這項(xiàng)科學(xué)競賽的“世界冠軍”。1.3蛋白質(zhì)順序測定基1.3鑒定多肽鏈的N-末端和C1.3鑒定多肽鏈的N-末端和C利 肽重建完整多肽鏈的一級結(jié)1.3多聚蛋白質(zhì)（雜多聚蛋白質(zhì)）:：8mol/L，6mol/L1.31.31.3.3.二硫鍵的過甲酸氧化法：將二硫鍵氧化成磺酸基1.31.31.3.4.完全水解：酸水解是主要方法，多用HCl，同時(shí)輔以堿水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破壞，Ser，Thr，Tyr部分破壞，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu。---計(jì)算各種氨基酸殘基的數(shù)目或比例R+HNCHRSOHNCH RSOHNCHC1.31.3.5.鑒定多肽鏈的N-末端和C-末二硝基氟苯（DNFB）法：肽游離末端NH與DNFB反應(yīng)生DNP-肽，最后水解生成黃色DNP-氨基N-末端測丹磺酰氯（DNS）法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基丹磺酰氯（DNS）法(強(qiáng)熒光，檢測靈敏度可以達(dá)到1X10-CH CHCH CHBrS+C甲基硫酸HCSC....NCCHNHHHCO...NCCN+H 溴化亞氨內(nèi)酯....NCCNH CHC...NCCHH++HNO肽酰高絲氨酸內(nèi)酯(C-末端肽段)(N-末端肽段)1.31.3.5N-末端和C肼解法：最重要，肽與肼反應(yīng)，除C-末端氨基酸，其他氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘被狨ｋ禄?。肼化物能夠與苯縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。羧肽酶AProArg羧肽酶法：最有效、羧肽酶B:Arg羧肽酶HO HOOHNCCNCNHCCNCCNHCCHRRR100HNCCNHNH +HNCCNHNH+NHCCHHH n-1個(gè)氨基酸酰 氨基1.31.3.6. 糜蛋白酶(chymotrypsin)：斷裂Tyr，Leu酶裂解：胃蛋白酶(pepsin)：在酸性條件穩(wěn)定，肽鍵兩側(cè)均為疏水氨基酸。在確定二硫鍵位置時(shí)，常用到此酶。葡萄球菌蛋白酶(thermolysin)：專一斷裂Glu（化學(xué)裂解：溴化（CNBr）：只斷裂Met1.3.61.3.6.多肽鏈的裂解溴化水解法：選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的1.31.3.7.測定各肽段的氨基酸(1)Edan化學(xué)降解法：用Edman試劑PC與游離氨基作用生成PTH-氨基酸，并可用各種層析技術(shù)分離；用此法降解，一次可連續(xù)測出60-0個(gè)氨基酸基的序列；作量大，作麻煩；現(xiàn)改用蛋白質(zhì) 儀。肽段的基 (2)由核苷酸序列推定(3)質(zhì)譜法1.31.31.3.7.(1)Edman化學(xué)降解法：偶聯(lián)反 轉(zhuǎn)化反 1.3例如：知道一部分氨基酸序列就容易找到并分離相應(yīng) 建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 蛋白質(zhì)信息庫序列數(shù)歐洲歐洲分子生物學(xué)數(shù)據(jù)1.31.3.7.質(zhì)譜儀能夠準(zhǔn)確地測量肽段和蛋白質(zhì)的相對分子量、氨基酸序列及翻譯后修飾等結(jié)構(gòu)信息，甚至可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行相對或者絕對定量。質(zhì)譜技術(shù)很靈活，能與多種蛋白分離、捕獲技1.31.3.7.質(zhì)譜儀能夠準(zhǔn)確地測量肽段和蛋白質(zhì)的相對分子量、氨基酸序列及翻譯后修飾等結(jié)構(gòu)信息，甚至可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行相對或者絕對定量。質(zhì)譜技術(shù)很靈活，能與多種蛋白分離、捕獲技質(zhì)譜技術(shù)能快速的鑒定大量的蛋白質(zhì)，并且質(zhì)譜技術(shù)的靈敏度也非常高。質(zhì)譜技術(shù)的這些優(yōu)點(diǎn)使其成為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的主流技術(shù)。1.31.3.7.通通過測定電離后的肽段或者其碎片離子的質(zhì)荷（m/z）來對蛋白質(zhì)的組成成分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行（MALDI-TOF-電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MALDI-TOF-基本原理：將分析物分散在基質(zhì)(Matrx)分子中并形成共結(jié)晶,當(dāng)用激光(337nm的氮激光)照射晶體時(shí),基質(zhì)分子吸收激光能量與樣品解吸附，基質(zhì)－樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離基質(zhì)的–相,。MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖中的譜峰與樣品各組分的質(zhì)量數(shù)有一一對應(yīng)關(guān)離子化效率高，是現(xiàn)今靈敏度最高的質(zhì)譜儀質(zhì)量分析范圍：800Da---基本原理：利用高電場使質(zhì)譜進(jìn)樣端的毛細(xì)管柱流出的液滴帶電，在2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電斷重復(fù)使最終的液滴非常細(xì)小呈噴霧狀，這時(shí)液滴表面的電場非常強(qiáng)大，使分析物離子化并以帶單電荷或多電荷的離子的形式進(jìn)入質(zhì)量分析器。電噴霧電離產(chǎn)生多電荷峰，質(zhì)譜圖顯示離子帶不荷數(shù)的一系列質(zhì)荷比峰[n+，根據(jù)這些峰值換算出離子電荷和分子質(zhì)量。肽質(zhì)量譜（PeptideMass肽質(zhì)量譜（PeptideMassFingerprint， 譜（PeptideFragmentFingerprint，可以提確結(jié)構(gòu)信息，一般是對蛋白未分離或分離效果差的樣品。串聯(lián)質(zhì)譜可以提 確結(jié)構(gòu)信息，一般是對蛋白未分離或分離效果差的樣品。第一級質(zhì)量分析器起質(zhì)量過濾器的作用，從總離子譜中挑選出需進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的母離子進(jìn)入碰撞室，母離子在碰撞室內(nèi)經(jīng)高流速惰性氣體碰撞誘導(dǎo)離解產(chǎn)生碎片離子/ 搜庫是目前主要的數(shù)據(jù)處理把實(shí)驗(yàn)圖譜與數(shù)據(jù)庫中的每個(gè)肽段的理論圖譜進(jìn)行比較并且按照一定的打分算法進(jìn)行打分，最后給出匹配最好的肽段或者是肽段列表。這種方法假設(shè)要鑒定的肽段在數(shù)據(jù)庫中是存在的。這種方法是有效的并且已經(jīng)成功應(yīng)用于幾個(gè)蛋白質(zhì)組計(jì)劃。這種方法不適用于目標(biāo)序列不存在于數(shù)據(jù)庫中的情況，如目標(biāo)序列來源于一種新的蛋白質(zhì)，存在翻譯后修飾或者DNA錯(cuò)誤。通過直接分析串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)而得到肽段序列，而不需要搜索數(shù)據(jù)庫。理論上，如果肽段的碎裂是完全的（即肽段的每個(gè)肽鍵都碎裂產(chǎn)生碎裂碎片），那么我們可以通過計(jì)算同一種離子類型中相鄰碎片的質(zhì)荷比差值而得到整個(gè)肽段的序列。1.31.3.8.肽：由于不同的斷裂方法即斷裂的專一性不同，產(chǎn)生的切口彼此錯(cuò)位，使兩套肽段正好跨過切口而的肽段；獲得肽需要兩種或兩種以上的不同方法斷裂同一多肽樣品，得到兩套或多套肽段例1.31.3.9.胃蛋白酶水解含二硫鍵的蛋白質(zhì)。胃蛋白酶專一低，切點(diǎn)多，得到含有二硫鍵的肽段較小，易分離鑒定第一向電 甲酸氧化（S-S斷裂1.3鑒定多肽鏈的N-末端和C利 肽重建完整多肽鏈的一級結(jié)1.41.41.4化學(xué)家RobertBruceMerrifield由于肽的固相合成方法，這在方法學(xué)上是一個(gè)重大的破，所以他獲得了1984化學(xué)1.41.4總結(jié):肽的理化蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)肽的固相1酸水解和氨基酸組成為Ala21酸水解和氨基酸組成為Ala2Arg，Lys2，Phe，Ser羧肽酶A水解得一氨基酸為胰蛋白酶水解得四個(gè)肽段，其氨基酸組成如下：①Ala，Arg②Lys，Phe，Ser③Lys④A1a，Met，溴化水解得兩個(gè)肽段，其氨基酸組成如下Arg，Ala，Met，Phe，Ser②A1a，Ser①A1a，Arg，Ser②Ala，Lys，Met，Phe，Ser 第四組：肖慶宇 、吳雪靜、王洋