技術(shù)腫瘤相關(guān)抗原的篩選方法

SEREX技術(shù)

----腫瘤相關(guān)抗原的篩選方法目錄SEREX的概況SEREX的原理SEREX的基本流程SEREX發(fā)現(xiàn)的抗原SEREX的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)SEREX的改進(jìn)展望SEREX概況中文名稱：重組表達(dá)cDNA克隆的血清學(xué)分析技術(shù)英文名稱：serologicalanalysisofrecombinantlyexpressedcDNAclone(SEREX)定義：用腫瘤患者血清從腫瘤細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選和尋找腫瘤抗原基因的方法。SEREX，是1995年由德國(guó)血清學(xué)家Sahin等建立的從分子水平鑒定腫瘤抗原的方法，開創(chuàng)了血清學(xué)檢測(cè)腫瘤抗原的新時(shí)代。SEREX技術(shù)原理提取腫瘤細(xì)胞或組織的mRNA，構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫(kù)，用含高滴度抗體的患者血清篩選cDNA文庫(kù)，經(jīng)過2-3輪復(fù)篩后獲得陽性單克隆。對(duì)所獲得的陽性克隆經(jīng)過體內(nèi)刪除成為噬菌粒后進(jìn)行序列測(cè)定，然后對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，再進(jìn)一步展開對(duì)這些基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究。SEREX技術(shù)基本路線SEREX技術(shù)具體方法cDNA表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建

從新鮮腫瘤標(biāo)本或腫瘤細(xì)胞株抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后重組到噬菌體λZAP表達(dá)載體中，經(jīng)體外包裝后轉(zhuǎn)染大腸桿菌，收集噬菌體即為cDNA表達(dá)文庫(kù)。cDNA文庫(kù)的免疫篩選

從構(gòu)建的cDNA文庫(kù)抽取少量噬菌體，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，鋪入LB培養(yǎng)皿，孵育過夜，次日將噬菌斑轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（NC膜），接著5%脫脂奶粉（NFDM）于室溫封閉NC膜1h，后用TBS液沖洗干凈，用1：200經(jīng)預(yù)處理的自體血清與NC膜室溫孵育5-6h，再用TBS沖洗，將膜同1：3000稀釋的堿性磷酸酶（AKP）標(biāo)記羊抗人IgG抗體孵育1h，最后進(jìn)行顯色反應(yīng)。挑取陽性克隆，陽性克隆再次擴(kuò)增進(jìn)行第2輪、第3輪篩選純化。SEREX技術(shù)具體方法對(duì)陽性克隆進(jìn)行DNA序列分析在Genbank中用BLAST進(jìn)行對(duì)比分析，判定該基因序列是已知還是未知，還可根據(jù)人類基因組圖譜對(duì)陽性cDNA序列進(jìn)行染色體基因定位。采用Southernblot或RT-PCR檢測(cè)陽性克隆cDNA在正常組織組織及腫瘤中的表達(dá)情況。采用Northernblot檢測(cè)腫瘤抗原mRNA的表達(dá)，確定腫瘤抗原的組織表達(dá)譜。采用Westernblot分析各種組織中腫瘤抗原的表達(dá)。用已知抗原檢測(cè)體內(nèi)相應(yīng)抗體的濃度，定量分析腫瘤特異性抗體及其臨床意義。SEREX鑒定腫瘤抗原的分類通過SEREX方法已經(jīng)在黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、等惡性腫瘤中找到了約1500種抗原，用該方法鑒定出來的抗原按來源和性質(zhì)可分為以下幾類：CT抗原分化抗原突變抗原過表達(dá)抗原剪切變異體抗原

應(yīng)用SEREX發(fā)現(xiàn)的抗原肝癌：羅國(guó)榮等篩選出肝癌相關(guān)抗原SMP-30和Kinectin，并應(yīng)用基因工程技術(shù)方法構(gòu)建、表達(dá)、和純化出肝癌相關(guān)抗原SMP-30和Kinectin的融合蛋白，采用westernblot和ELISA檢測(cè)出SMP-30和Kinectin相應(yīng)抗體在肝癌患者血清中有較高的陽性率。卵巢癌：王穎等發(fā)現(xiàn)MY-OVA-13基因；周芙玲發(fā)現(xiàn)12個(gè)新基因鼻咽癌：謝可發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的熱休克蛋白基因家族的抗原；黃紹明發(fā)現(xiàn)了14個(gè)新的鼻咽癌相關(guān)抗原；舒峻篩選出16個(gè)抗原，并首次在鼻咽癌組織中篩選出金屬硫2A基因應(yīng)用SEREX發(fā)現(xiàn)的抗原結(jié)腸癌：Scanlan等在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)17個(gè)新基因大腸癌：何敬東等篩選獲得16個(gè)陽性克隆,代表12個(gè)不同抗原基因肺癌：Gure等發(fā)現(xiàn)8個(gè)抗原，以NY-LU-12抗原最重要胰腺癌：Nakatsura等發(fā)現(xiàn)5個(gè)新基因高表達(dá)白血?。篒toh等在成人T淋巴白血病中發(fā)現(xiàn)3個(gè)抗原胃癌：王運(yùn)偉等篩選出14個(gè)胃癌腫瘤相關(guān)抗原編碼基因SEREX技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)通過構(gòu)建文庫(kù)進(jìn)行篩選簡(jiǎn)化篩選步驟篩選的抗原分子多為全長(zhǎng)cDNA，可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，且不易導(dǎo)致腫瘤抗原編譯丟失cDNA文庫(kù)可以來源于腫瘤組織，也可以來源于細(xì)胞系，篩選血清可以是自體血清，也可以是同源異體血清cDNA表達(dá)克隆的血清學(xué)分析，不只限于分析腫瘤細(xì)胞的表面抗原，它涵蓋了由腫瘤基因編碼的大多數(shù)蛋白將病人血清稀釋后進(jìn)行篩選，使得免疫分析僅限于那些可以誘導(dǎo)強(qiáng)免疫反應(yīng)的抗原使用病人多克隆抗體血清篩選，使得在一次篩選過程中，可以鑒定出多個(gè)抗原SEREX技術(shù)的缺點(diǎn)SEREX技術(shù)必須構(gòu)建cDNA基因表達(dá)文庫(kù)，并且僅局限于對(duì)一個(gè)或者很少幾個(gè)病人血清的篩選，代表性差SEREX技術(shù)不能檢測(cè)腫瘤表達(dá)的所有抗原。因?yàn)樵赟EREX方法中，抗原在細(xì)菌-噬菌體系統(tǒng)中表達(dá)后，不能正確折疊和翻譯后修飾，所以不適用于鑒定具有翻譯后修飾功能的腫瘤相關(guān)抗原對(duì)某些在腫瘤發(fā)展的不同階段表達(dá)的抗原，若取新鮮組織標(biāo)本的時(shí)間與該抗原表達(dá)的階段不一致也將被漏檢SEREX的改進(jìn)去除假陽性：篩選血清可以通過與野生型的細(xì)菌-噬菌體裂解物預(yù)吸收來消除同細(xì)菌或噬菌體復(fù)合物起反應(yīng)的人血清抗體。將制成的腫瘤cDNA文庫(kù)與正常組織cDNA文庫(kù)進(jìn)行消減雜交，消減后的腫瘤cDNA再進(jìn)行血清學(xué)篩選，可排除在正常組織中有明顯表達(dá)的基因。發(fā)展真核表達(dá)系統(tǒng)：蛋白質(zhì)的構(gòu)造和翻譯后修飾對(duì)抗原作用的發(fā)揮及其重要，也影響其免疫原性。將蛋白質(zhì)組學(xué)與SEREX方法結(jié)合起來SEREX展望SEREX&MDV=？重組cDNA表達(dá)文庫(kù)血清學(xué)分析技術(shù)在腰椎間盤突出癥自身抗原篩選中的應(yīng)用前景；2010應(yīng)用SEREX技術(shù)篩選和鑒定肺癌相關(guān)抗原的研究進(jìn)展廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院；2009應(yīng)用SEREX技術(shù)篩選和鑒定非小細(xì)胞肺癌腫瘤相關(guān)抗原

北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所；2009

SEREX方法在腫瘤相關(guān)抗原篩選中的應(yīng)用河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2009卵巢上皮性癌相關(guān)抗原篩選中SEREX技術(shù)的應(yīng)用

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科；2008SEREX技術(shù)在