shRNA詳細(xì)設(shè)計教程以LKO1u為載體設(shè)計

上海海吉浩格生物科技有限公司qq群345029495shRNA設(shè)計此教程用于不知道siRNA靶點(diǎn)的設(shè)計，從文獻(xiàn)中選擇序列，可以從第5步開始設(shè)計1.選擇基因例如GeneName: TP53 Accession: NM_000546.52.尋找靶點(diǎn)/rnaiexpress/setOption.do?designOption=shrna&pid=-7168952604080645646輸入基因序列號，或者粘貼序列點(diǎn)擊RNAi設(shè)計3.靶點(diǎn)選擇（選擇星號比較多的2-3個作為目的序列）4.shRNA網(wǎng)頁設(shè)計點(diǎn)擊設(shè)計shRNAOLigos網(wǎng)頁上的loop可以不更改（后面需要更改為常用loop序列TTCAAGAGA）點(diǎn)擊設(shè)計設(shè)計好的序列如下（上面是以thermo的載體(pENTR?/U6)設(shè)計）5.后續(xù)的根據(jù)自己的載體手工設(shè)計shRNA（以PLKO.1-puro設(shè)計，酶切位點(diǎn)AgeIEcoRI,酶切位點(diǎn)后1300bp有一個單一的酶切位點(diǎn)KpnI）注意：shRNA比較短，而且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，測序困難，選擇載體上的單一酶切位點(diǎn)，設(shè)計到shRNA里面，用于后續(xù)的單酶切驗(yàn)證設(shè)計模板按照下圖(下圖去除AgeI和EcoRI,也可以適當(dāng)位置添兩個堿基保留著兩個酶切位點(diǎn))5’-CCGGsiRNA正向序列TTCAAGAGA反向互補(bǔ)序列TTTTTTGGTACC-3’3’-正向互補(bǔ)序列AAGTTCTCT反向序列AAAAAACCATGGTTAA-5’將網(wǎng)頁上設(shè)計的shRNA序列替換到上述模板替換之后如下5’-CCGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGTTCAAGAGACTGTCCCAGAATGCAAGAAGCTTTTTTGGTACC-3’3’-CGAAGAACGTAAGACCCTGTCAAGTTCTCTGACAGGGTCTTACGTTCTTCGAAAAAACCATGGTTAA-5’注意：正義鏈為5’→3’，反義鏈為3’→5’，合成時需要進(jìn)行反向處理。6.驗(yàn)證設(shè)計的shRNA是否合適二級結(jié)構(gòu)（用DNAMAN分析二級結(jié)構(gòu)）分析正反向引物是否匹配用Snapgene分析，正向序列輸入進(jìn)去，反向的作為引物用來驗(yàn)證（注意5’3’方向）一個正確的shRNA應(yīng)該入下圖7.最終發(fā)送合成的序列為5’-CCGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGTTCAAGAGACTGTCCCAGAATGCAAGAAGCTTTTTTGGTACC-3’5’-AATTGGTACCAAAAAAGCTTCTTGCATTCTGGGACAGTCTCTTGAACTGTCCCAGAATGCAAGAAGC-3’8.引物合成shRNA對引物純度要求不高，不需要用page純化，為了節(jié)約成本，用低一級的純化方式HAP即可使用。9.引物退火連接稀釋到50uM取各取4.5ul，加1ul，退火buffer（可以用不含dNTP和酶的PCRbuffer），95℃3min，自然降溫到室溫。將載體酶切盡可能保證載體全部雙酶切切開，可以選擇NEB沒有星活性的的酶。取1ul退火后的溶液，與載體（20-50ng就夠了）連接并轉(zhuǎn)化。10.質(zhì)粒提取并驗(yàn)證如果有載體自連對照為陰性，可以取兩個單克隆提質(zhì)粒KpnI單酶切，如果有能切出一個1300bp左右的片段，可以認(rèn)為構(gòu)建是正確的。取一個質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序的時候告知測序公司，此質(zhì)粒為發(fā)卡結(jié)構(gòu)，和poly結(jié)構(gòu)。附錄1.shRNA啟動子多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴RNA聚合酶III啟動子(polIII)中的一種,操縱一段45—50nt的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（smallhairpinRNA,shRNA）在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá),shRNA在細(xì)胞內(nèi)會自動被加工成為siRNA,從而引發(fā)基因沉默或者表達(dá)抑制.這一類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子等。采用RNApolIII啟動子的原因是由于它有明確的啟始和終止序列,總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成RNA,遇到4—5個連續(xù)的U即終止,并且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在第二個尿嘧啶處被切下來,非常精確,而且還可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA.轉(zhuǎn)錄出的RNA形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)后,會在3’端形成2個突出的尿嘧啶,這類似于天然的siRNA,因而有利于雙鏈RNA誘發(fā)RNAi。要使用這類載體,需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈,退火后克隆到相應(yīng)載體的polIII啟動子下游?？寺〉倪^程需要幾天的時間,也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。先在體外構(gòu)建能表達(dá)雙鏈RNA的載體,再將載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)合成出雙鏈RNA,不但能增加有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞的種類,而且在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞株中,雙鏈RNA能夠長期發(fā)揮阻斷基因的作用?，F(xiàn)在有多個報道說通過質(zhì)粒表達(dá)siRNAs同樣可以抑制特定基因的表達(dá).當(dāng)這種帶有PolIII啟動子和shRNA編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞時,這種能表達(dá)siRNA的質(zhì)粒確實(shí)能夠下調(diào)特定基因的表達(dá),抑制范圍包括外源基因和內(nèi)源基因。附錄2RNAi的作用機(jī)制及siRNA的合成方法RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是由雙鏈RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因表達(dá)或使其沉默的過程。dsRNA可以抑制不同類型細(xì)胞的靶向基因表達(dá)，用特異性的抗體幾乎檢測不到靶向基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)。因此，RNAi技術(shù)又被形象地稱為基因敲除(knockout)或基因沉默(genesilencing)。RNAi是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttracriptionalgenesilencing，PTGS)。1RNAi技術(shù)的發(fā)展過程早在1990年，植物學(xué)家Jorgeen等人用矮牽?；ㄗ鲈囼?yàn)，將紫色素合成基因?qū)胫参矬w，嘗試將更多拷貝的色素基因注入植物體，使花朵的色彩更加艷麗。結(jié)果許多花朵沒有開出更艷麗的花朵，反而開出白色的花朵。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)入的基因不但自身沒有表達(dá)為蛋白質(zhì)，反而關(guān)閉了牽?；ㄖ信c其同源的色素相關(guān)基因的表達(dá)。由于這種由外源基因的導(dǎo)入而造成的抑制作用最初被確認(rèn)是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，稱這種現(xiàn)象為共抑制(cosureion)。1994年，Cogoni等人將外源性類胡蘿卜素基因?qū)胍吧痛植阪滄呙咕Y(jié)果轉(zhuǎn)化細(xì)胞中內(nèi)源性的類胡蘿卜素基因也受到了抑制，他們稱這種基因失活形式為消除作用或基因壓制(quelling)。1995年康乃爾大學(xué)的Guo博士在實(shí)驗(yàn)中想通過反義RNA阻斷美麗線蟲(C.elega)的par-1基因表達(dá)，同時還用正義RNA做了一個對照，試圖觀察到對照試驗(yàn)組基因表達(dá)增強(qiáng)的現(xiàn)象，但結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)了反義和正義RNA都阻斷了該基因的表達(dá)，Guo等人一直不能解釋該現(xiàn)象。直到1998年Fire等才發(fā)現(xiàn)這是由于Guo博士在試驗(yàn)中污染了雙鏈RNA而引起的。他們還證明轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA經(jīng)純化后注射線蟲所引起的阻斷作用十分微弱，而經(jīng)純化的雙鏈RNA則能高效特異地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，他們將此現(xiàn)象稱為RNA干擾。1999年，Hunter等的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了RNAi的存在。他們將dsRNA去除后，再將正義或反義的RNA注入線蟲卵中，沒有產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象。相反，如果將上述正義及反義RNA混合，經(jīng)退火復(fù)性后得到的dsRNA注入線蟲卵中可以顯著地產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象，從而印證了Fire等提出的RNAi作用是由dsRNA引起的結(jié)論。2000年首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)，通過核糖核酸酶可將長的dsRNA處理為21～23nt的短片段。2001年，首次報道了哺乳動物細(xì)胞中也有RNAi。2002年證明了用短的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（shRNA）在哺乳動物細(xì)胞中可以誘導(dǎo)特異性的基因沉默。2003年首次用RNAi技術(shù)對模型動物進(jìn)行了治療研究。2006年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎沒有堅(jiān)持研究成果要經(jīng)過數(shù)十年實(shí)踐驗(yàn)證的“慣例”，破格授予美國科學(xué)家安德魯?菲爾和克雷格?梅洛，以表彰他們1998年發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象。此后，人們在不同種屬的生物中進(jìn)行了廣泛而深入的研究，結(jié)果證實(shí)dsRNA介導(dǎo)的RNAi現(xiàn)象存在于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、渦蟲、水螅、斑馬魚、小鼠、大鼠、猴乃至人類等多種生物中。2RNAi的作用機(jī)制目前關(guān)于基因沉默的假說認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，主要包括起始階段、效應(yīng)階段和倍增階段。2．1起始階段外源性導(dǎo)入或由轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)座子、病毒感染等多種方式引入雙鏈核糖核酸(dsRNA)，在細(xì)胞內(nèi)特異性與RNA酶Ⅲ(RNAaseⅢ核酸內(nèi)切酶)Dicer結(jié)合，dsRNA被切割成21~23nt長度的帶有3′端單鏈尾巴及磷酸化的5′端的短鏈dsRNA，即小干擾RNA(siRNA)。（以下圖片均來自于陳莉等的文章《在醫(yī)藥領(lǐng)域中RNA干擾研究進(jìn)展》）2.2效應(yīng)階段雙鏈siRNA可以與含Argonauto（Ago）蛋白的核酶復(fù)合物結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）并被激活。在ATP供能情況下，激活的RISC將siRNA的雙鏈分開，RISC中核心組分核酸內(nèi)切酶Ago負(fù)責(zé)催化siRNA其中一條鏈去尋找互補(bǔ)的mRNA鏈，然后對其進(jìn)行切割。反義鏈先與同源mRNA配對結(jié)合，然后RISC在距離siRNA3'端12個堿基的位置將mRNA切斷降解，從而阻止靶基因表達(dá)，使基因沉默。2.3倍增階段siRNA在RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA為模板，siRNA為引物，擴(kuò)增產(chǎn)生足夠數(shù)量的dsRNA作為底物提供給Dicer酶，產(chǎn)生更多的siRNA，可再次形成RISC，并繼續(xù)降解mRNA，從而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)。并作用于靶mRNA。如此反復(fù)倍增，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大。因此少量的siRNA就可以產(chǎn)生高效的基因沉默效果。3RNAi的設(shè)計及合成3.1siRNA的設(shè)計設(shè)計高效率的siRNA首先要通過NCBI、DDBJ、BMBL這3個基因序列數(shù)據(jù)庫，檢索相關(guān)的基因序列，獲得靶向mRNA或cDNA序列，再就是合理設(shè)計siRNA。常規(guī)siRNA的設(shè)計原則是以成熟的mRNA為標(biāo)準(zhǔn)，若以DNA序列為參照，則最好選擇cDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)+50到+100以后的下游序列，兩端的非翻譯區(qū)不作為siRNA設(shè)計依據(jù)。siRNA二聚體的正義鏈和反義鏈各含21nt為佳，3'端為突出末端。3'凸端為尿苷(U)，5'凹端為腺苷(A)的mRNA序列應(yīng)作為首選。進(jìn)行Gen-BankBLAST查詢，確保所選siRNA編碼不與其它基因同源。不是mRNA的所有亞單位都能形成有效的siRNA，大約有60%~70%可以發(fā)揮沉默效應(yīng)，這是由于5‘和3’-UTR有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，產(chǎn)生UTR結(jié)合蛋白或翻譯起始復(fù)合物均可能影響RISC結(jié)合mRNA，從而影響siRNA的效果，所以沉默效應(yīng)率差異較大，針對一個靶基因需要設(shè)計3~4條siRNA，以保證能夠篩選出一條有效序列。3.2siRNA的合成方法制備siRNA的方法主要有化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、酶消化法、體內(nèi)轉(zhuǎn)錄法等。當(dāng)已經(jīng)找到最有效的siRNA時，適合以核苷酸單體為原料，通過化學(xué)方法合成兩條互補(bǔ)的長約21~23nt的RNA單鏈，然后退火形成雙鏈復(fù)合體，這種方法所獲得的產(chǎn)物純度、干擾效率高，合成簡單，但是制備周期長，作用時間短，而且價格昂貴限制了其應(yīng)用和推廣。體外轉(zhuǎn)錄法是以兩段互補(bǔ)的DNA為模板，在針對靶序列的正義鏈和反義鏈上游接上T7啟動子，使用T7RNA聚合酶，各自在體外轉(zhuǎn)錄獲得兩條單鏈RNA，將兩條單鏈退火后形成雙鏈RNA，然后用RNA酶消化，所得產(chǎn)物經(jīng)純化后就是所需的雙鏈RNA，此方法適用于篩選有效的siRNA，但不適用于對特定siRNA進(jìn)行長期研究。酶消化法是先在體外化學(xué)合成200~1000完整的目的基因長片段dsRNA，用細(xì)胞內(nèi)形成的siRNA關(guān)鍵酶-Dicer酶或者RNaseⅢ進(jìn)行消化，即可得到各種不同的針對同一目的基因的不同位點(diǎn)的siRNA混合物，然后將混合物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，能得到較高的抑制效率。該方法抑制率高，且省時省力，但此法產(chǎn)生的混合物可能導(dǎo)致非特異性抑制，另外在體外轉(zhuǎn)錄長鏈RNA有困難，Dicer酶費(fèi)用較高，此方法不適用于長時間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療。體內(nèi)轉(zhuǎn)錄是將siRNA的質(zhì)粒、病毒表達(dá)載體或帶有siRNA表達(dá)盒的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入細(xì)胞，由細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生RNA干擾作用。siRNA表達(dá)載體常用能在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)shRNA的含有RNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)啟動子的載體，通過轉(zhuǎn)染含有RNA聚合酶II/III的啟動子U6或H1，及其下游一小段特殊結(jié)構(gòu)的質(zhì)?；虿《据d體到宿主細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄出shRNA，該RNA在細(xì)胞內(nèi)被Dicer酶剪